Inhoudsopgave

Inhoudsopgave............................................................................................................................1
1 Inleiding...................................................................................................................................2
1.1Longcarcinomen.................................................................................................................3
1.2EGFR Protocol...................................................................................................................4
1.3Immunohistochemie...........................................................................................................4
1.4Mutatieanalyse...................................................................................................................5
1.5DISH..................................................................................................................................6
1.5.1CISH ...........................................................................................................................7
1.5.2Centromeer probe........................................................................................................8
1.6Doel en opzet van het onderzoek.......................................................................................8
2 Materiaal en methode.............................................................................................................10
2.1 EGFR procedure.............................................................................................................10
2.2 Immunohistochemie........................................................................................................10
2.3 Mutatieanalyse................................................................................................................11
2.4 CISH................................................................................................................................11
3 Resultaten...............................................................................................................................15
3.1 Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal...........................................................15
3.1.1...................................................................................................................................15
3.1.2...................................................................................................................................15
3.1.3...................................................................................................................................15
3.1.4...................................................................................................................................15
3.1.5...................................................................................................................................15
3.1.6...................................................................................................................................15
3.1.7...................................................................................................................................16
3.1.8...................................................................................................................................16
3.1.9...................................................................................................................................16
3.1.10.................................................................................................................................16
3.1.11.................................................................................................................................16
3.1.12.................................................................................................................................16
3.2 Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal.....................................................17
3.2.1...................................................................................................................................17
3.2.2...................................................................................................................................18
3.3Patiënten materiaal...........................................................................................................18
4 Conclusie en discussie...........................................................................................................18
Literatuur verwijzingen.............................................................................................................19
Bijlage 2 ...................................................................................................................................21
Zymed EGFR CISH protocol....................................................................................................21
Bijlage 3 ...................................................................................................................................22
Zytovision EGFR CISH protocol..........................................................................................22

1
1 Inleiding
Bij de ontwikkeling van moderne anti-kanker therapieën is het de trend om middelen te
gebruiken die specifiek inwerken op kankercellen. Receptor eiwitten zijn daarvoor zeer
geschikt, op voorwaarde dat deze specifieke eiwitten aanwezig zijn op de tumorcellen.
Bij deze therapieën wordt gebruik gemaakt van proteïne kinases, in de meeste gevallen
tyrosine kinase. Deze spelen een belangrijke rol in het reguleren van de meeste celfuncties,
zoals celdeling/celcyclus, celoverleving/celdood (apoptose) en DNA reparatie.
Tyrosine kinase remmers zorgen ervoor dat de receptoren geen signalen meer kunnen geven
doorgeven aan de aan de cel waardoor de functie van de tyrosine kinase verhindert word.(1)

Gefitinib/erlotinib is een Epidermal Growth Factor

Receptor (EGFR) tyrosine kinase remmer die gebruikt
wordt bij de behandeling van bepaalde tumoren,
waaronder longtumoren. EGFR komt voor in de
epitheliale cellen van het lichaam. De EGF receptor
behoort tot de tyrosine kinase glycoproteïnes. EGFR
bestaat uit een buiten de celgelegen gedeelte
(extracellulair) waaraan eiwitten zich kunnen binden,
een in het membraan gelegen gedeelte, en een in de cel
gelegen gedeelte (intracellulair) dat onder andere
bestaat uit tyrosine kinase. EGF en TGFα kunnen zich
binden aan het extracellulaire gedeelte van het EGFR
waardoor het tyrosine kinase gedeelte gefosforyleerd
wordt. Door deze fosforylatie worden er drie pathways
geactiveerd, de AKT pathway, de RAS/ERK pathway
en de STAT pathway. Deze pathways geven een signaal Figuur 1: Schematische weergave van de
pathways die EGFR activeert.(3)
door aan de kern waarin ze zorgen voor gentranscriptie.
De AKT pathway remt de apoptose, de RAS/ERK
pathway zorgt voor celdeling en de STAT pathway zorgt voor bloedvatvorming en voor de
migratie, adhesie en invasie van cellen in het omliggende weefsel.(2)

Normaal gesproken wordt het EGFR voor een korte tijd geactiveerd, waardoor deze cellen
kort tot deling worden aangezet. Hierna worden de receptoren gerecycled of afgebroken.
Een verhoogde EGFR activiteit kan verschillende oorzaken hebben.
1. Een verhoogd aantal EGF receptoren op het celoppervlak als gevolg van een verhoogt
aantal EGFR genen in het DNA (gen amplificatie).
2. een gestegen aantal EGFR gen transcripties en translaties, waardoor er een
overexpressie ontstaat van mRNA, met als gevolg een verhoogt aantal EGF receptoren.

Gefitinib/erlotinib zorgt dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden, hierdoor
worden geen signalen meer naar het cytoplasma en de kern doorgeven. Dit zorgt ervoor dat de
celproliferatie geremd wordt en de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden.
Alleen als het aantal receptoren verhoogd is door een EGFR gen amplificatie zorgt de
Gefitinib/erlotinib therapie voor een duidelijke vermindering van de hoeveelheid signalen dat
doorgegeven word aan de kern. De bijwerkingen van deze therapie kunnen de
gezondheidstoestand van de patiënt, die al slecht is door de tumor, verergeren.
Om deze redenen is het belangrijk dat er amplificaties kunnen worden aangetoond.

2
Figuur 2: Gefitinib/erlotinib zorg ervoor dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden,
hierdoor word geen signaal meer naar het cytoplasma en de kern doorgegeven. Dit zorgt ervoor dat de
celproliferatie geremd wordt en dat de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden. (4)

1.1 Longcarcinomen
Gefitinib/erlotinib wordt gebruikt om longcarcinomen met een EGFR amplificatie te
behandelen. Longcarcinomen zijn tumoren die ontstaan uit de bedekkende (epitheliale) laag
van de longen en bronchiën. Deze worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen
• Het kleincellig longcarcinoom
• Het niet-kleincellig longcarcinoom
Ongeveer 20% van de longcarcinomen behoord tot het kleincellige type. Deze worden zo
genoemd doordat de cellen zeer klein zijn en weinig cytoplasma bevatten. Om deze rede
worden ze soms verwart met lymfocyten.
De groep niet-kleincellige longcarcinoom bestaat uit 3 verschillende typen:
• plaveiselcelcarcinoom
• adenocarcinoom
• grootcellig carcinoom

A B C

Figuur
Deze worden 3 A: gegroepeerd
samen plaveiselcelcarcinoom B: Adenocarcinoom
omdat ze C: kleincellig
alle drie op dezelfde maniercarcinoom
behandelt kunnen
worden.

3
Het plaveiselcelcarcinoom is het meest voorkomende type van longcarcinomen. Het
plaveiselcelcarcinoom ontwikkeld zich vanuit de cellen die de bronchiën van de long
bedekken (plaveiselcellen) en wordt vaak in de kern van de long gevonden.
Het adenocarcinoom ontwikkeld zicht uit de slijmvormende cellen die zicht in de luchtwegen
bevinden. Vaak bevinden de tumoren zich in de buitenste gedeelten van de long.
Tumoren waarbij het niet duidelijk is of het een plaveiselcelcarcinoom of een adenocarcinoom
is worden ze ingedeeld in de groep grootcellige carcinomen. Hiermee wordt duidelijk
gemaakt dat de tumor niet kleincellig is en dus behandeld moet worden als een niet-
kleincellig longcarcinoom. (5)

1.2 EGFR Protocol

In het VUmc is bij de pathologie een procedure gestart voor EGFR bepalingen op
longcarcinomen waarmee kan worden bepaald of patiënten een EGFR amplificatie hebben
waardoor ze behandeld kunnen worden met Gefitinib/erlotinib. Hierbij worden er een aantal
testen gedaan op paraffinecoupes.
1. EGFR eiwit expressie. hierbij wordt gekeken naar het patroon en mate ven
eiwitexpressie van EGFR op de tumorcellen.
2. Een EGFR en K-ras mutatieanalyse. Hierbij wordt gekeken naar de aanwezigheid van
mutaties op het DNA.
3. Een EGFR genkopie bepaling. Hiermee wordt het aantal EGFR genkopieën per cel
geteld.
4. TTF1 expressie. Deze kleuring kleurt de longtumoren altijd positief aan bij een
mutatie is in het EGFR gen, dit is niet het geval bij K-ras mutaties
5. ALK-1 expressie. Indien de ALK-1 aankleurt is het het al zeker dat het geen EGFR
mutatie is.
Het plan is om dit ook te gaan doen op cytologisch materiaal. Het verkrijgen van cytologisch
materiaal is minder ingrijpend dan het nemen van een biopt. Dit komt doordat de patient niet
geopereerd hoeft te worden om weefsel te verkrijgen.

Deze testen worden gedaan bij patiënten die voldoen aan de volgende criteria:
 Een vrouwelijke patiënt die nooit heeft gerookt heeft waarbij voor het eerst een
longcarcinoom is geconstateerd
 Een patiënt die een recidief heeft van een adenocarcinoom die behandeld is geweest
met chemotherapie of straling.

1.3 Immunohistochemie

Als onderdeel van de immunohistologische kleuringen van het

EGFR protocol worden de TTF-1(Thyroid transcription
factor-1), EGFR en ALK-1 (anaplastic lymphoma kinase-1)
gedaan.
Het TTF-1 eiwit komt voor inde kern en wordt gebruikt om
normaal schildklierweefsel aan te kleuren, maar waarvan is
gebleken dat het ook longtumoren aankleurt. De TTF-1 is in
Figuur 4 TTF-1 kleuring
het EGFR protocol opgenomen omdat is gebleken dat deze
altijd positief is bij een EGFR amplificatie.

4
Het EGFR eiwit komt voor in het membraan van de cel en
kleurt het intrinsieke gedeelte van het EGF receptor aan. Bij
de aanwezigheid van grote hoeveelheden receptoren komen
deze ook in het cytoplasma voor en wordt ook het
cytoplasma aangekleurd. De EGFR kleuring zorgt voor het
zichtbaar maken van de receptoren, maar laat niet zien of
het een EGFR gen mutatie is of een andere mutatie in een Figuur 5. ALK-1 aankleuring (7)
ander gen. De coupes worden beoordeeld met behulp van
een scoringsschema. Deze gaat van 0, negatief, tot 3+, sterk positief. Hierbij wordt gekeken
naar de cytoplasmatische aankleuring en de membraan aankleuring (figuur 3)

Figuur 6 EGFR immunohistochemische scoring . a) score 0 b) score 1+ c) score 2+ d) score 3+

het ALK-1 eiwit komt voor in de kern en het cytoplasma en wordt normaal gebruikt om een
translocatie aan te tonen in grootcellige anaplastische lymfomen om er zo achter te komen
welk type lymfoom het is. Uit recent onderzoek is gebleken dat deze mutatie ook kan
voorkomen in longcarcinomen. Het blijkt dat de aanwezigheid van deze mutatie aangeeft dat
EGFR mutaties niet aanwezig zijn.

1.4 Mutatieanalyse

Een ander onderdeel van het EGFR protocol is de mutatieanalyse. Met behulp van een
mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden opgespoord. Bij de EGFR
mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen als op het K-ras gen. Als
een mutatie op het K-ras gen aanwezig is, is het zeker dat de Gefitinib/erlotinib therapie niet
zal werken, omdat het dan geen mutatie zit in de EGF receptor. Voor mutaties in het EGFR
gen wordt een mutatieanalyse gedaan op exon19, exon20 en exon21 en voor mutaties op het
K-ras gen op exon1, al deze bevinden zich op chromosoom 7. De meest voorkomende EGFR

5
mutaties zitten op exon19 (45%) en exon21 (40-45%), een klein gedeelte van de mutaties
zitten op exon18 (5%) en exon20 (5%). Niet alle mutaties die voorkomen reageren op de
Gefitinib/erlotinib therapie. De meeste mutaties die niet reageren op de Gefitinib/erlotinib
therapie zitten op exon20, om deze rede is de exon20 wel opgenomen in het protocol en
exon18 niet. Als uit verdere testen blijkt dat een EGFR mutatie aanwezig zou moeten zijn
wordt alsnog een exon18 mutatieanalyse aangevraagd.

Figuur 7 schematisch weergave van de verschillende EGFR mutaties in niet kleincellige longtumoren en
hun gevoeligheid voor Gefitinib/erlotinib therapie. (8)

1.5 DISH

In Situ Hybridisatie (ISH) is een techniek waarbij je specifieke sequenties DNA(DISH) of

mRNA (RISH) met behoud van morfologie kan zichtbaar maken. RISH wordt meestal
toegepast voor de detectie van virussen indien RNA meer voorkomt dan DNA (bijv. het veel
voorkomende EBER bij EBV geïnfecteerde cellen) of voor de lokalisatie van het mRNA van
interesse in de cellen. DISH daarentegen wordt gebruikt om grove fouten, zoals translocaties,
deleties en amplificaties van complete genen, in het DNA op te sporen. Dit wordt gedaan met
behulp van probes. Probes bestaan uit kleine specifieke stukjes dubbelstrengs DNA die
dezelfde nucleotidevolgorde (sequentie) hebben als het te detecteren stukje DNA. Deze
probes zijn voorzien van een label om hybridisaties zichtbaar te maken. De label kan direct
door fluorescentie (FISH) of indirect door een enzymatische reactie (CISH) zichtbaar worden
gemaakt.
Er zijn verschillende typen probes die ieder hun eigen hybridisatie- eigenschappen hebben,
die gebasseerd zijn op de sterkte van de binding van de probe aan het DNA. Probes die sterk
binden moeten stringenter gewassen worden na incubatie met probe. Stringent wassen wordt
gedaan in een zoutoplossing bij een hoge temperatuur. Bij de zoutconcentratie geld de regel

6
hoe lager de zouconcentratie hoe stingenter het wast, en bij de temperatuur geld de regel hoe
hoger de wastemperatuur hoe stringenter.
Een DISH kan worden gedaan op formaline gefixeerd, in paraffine ingebed weefsel waarvan
coupes van 5μm dik zijn gesneden, ook kan het toegepast worden op cytologisch materiaal.

1.5.1 CISH

Om het aantal genkopieën per cel te bepaling is een EGFR DNA In Situ Hybridisatie nodig
Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van CISH. Dit omdat CISH een aantal
voordelen heeft ten opzichte van FISH. Het belangrijkste voordeel is dat de coupes te
archiveren zijn, dit omdat het signaal niet uitdooft na verloop van tijd, waardoor later nog
terug kan worden gekeken naar de coupe. Een ander voordeel is dat de morfologie van de
cellen kan worden beoordeeld, dit omdat CISH onder een normale lichtmicroscoop beoordeelt
kan worden. Een ander voordeel is dat er geen autofluorecentie kan optreden die het signaal
kan verstoren. Het laatste voordeel is dat CISH gevoeliger is dan FICH, dit omdat er bij de
CISH versterkingsstappen zijn waardoor het signaal sterker zichtbaar kan worden gemaakt.
De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit
alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om
aspecifieke hybridisatie op andere chromosomen/genen te voorkomen. CISH probes binden
sterker aan homologe DNA sequenties dan conventionele DNA probes.
Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern. Deze
worden onderverdeeld in:
Normaal 1-2 stippen
Polysomie 3-5 stippen
Lichte amplificatie 6-10 stippen
Amplificatie >10 stippen of clusters

Figuur 8. Beoordeling EGFR CISH. A. geen amplificatie B. polysomie C. lichte amplificatie D.

Amplificatie/clustervorming

7
Hierbij worden normaal en polysomie niet beschouwd als amplificatie.
De resultaten van de CISH worden vergeleken met de immunohistochemische kleuringen en
de mutatieanalyse. Aan de hand hiervan wordt besloten of de patiënten met
Gefitinib/erlotinib behandeld gaan worden.

1.5.2 Centromeer probe

Centromeer probes zijn probes die gericht zijn tegen het centromeer regio. Met behulp van
deze probes kan worden uitgevonden hoeveel kopieën van een chromosoom aanwezig zijn.
Deze probes binden minder sterk aan het DNA dan een CISH probe. Dit komt doordat dit
gedeelte van het chromosoom voornamelijk bestaat uit repeterende gedeeltes. Deze bevatten
veel A-T verbindingen, deze zijn minder sterk dan de G-C bindingen. Hierdoor kunnen deze
er eerder afspoelen. Hierdoor was je deze probes minder sterk dan een normale CISH probe.
Met behulp van een centromeer probe kan zichtbaar gemaakt worden hoeveel chromosomen
in de cel aanwezig zijn.

1.6 Doel en opzet van het onderzoek

Momenteel wordt een CISH voorschrift gebruikt voor ingebed patiënten materiaal dat nog
niet optimaal is voor al het materiaal. Regelmatig is de morfologie te slecht geworden om nog
te beoordelen en de signalen zijn zwak of niet zichtbaar of bevat teveel aspecifieke
achtergrond.

Het is belangrijk om het CISH protocol te optimaliseren zodat aan de hand hiervan kan
worden besloten om de therapie te starten of aan te passen. Bij dit optimaliseren wordt
gebruik gemaakt van: een long adenocarcinoom als doeltumor met een open chromatine
patroon , een long plaveiselcelcarcinoom als doeltumor met een dicht chromatinepatroon en
een tonsil als milde fixatie en een dicht chromatinepatroon. Het chomatinepatoon is belangrijk
omdat het bepaald hoe toegankelijk het DNA is voor de probe. Hoe dichter het
chomatinepatroon hoe minder toegankelijk het DNA wordt voor de probe. De tonsil wordt
meergenomen als voorbeeld van een biopt die milder gefixeerd worden dan grotere stukken
weefsel. Voor het optimaliseren worden verschillende manieren van voorbehandelen getest,
hierbij wordt gevarieerd met de manier van koken en gebruik van digestiemiddel. Bij de
beoordeling wordt gekeken welke methode het beste signaal geeft en waarbij de morfologie
ook nog goed te beoordelen is. Verder wordt ook gevarieerd in detectiemethode om zo te
kijken welke het sterkste signaal geeft zonder teveel achtergrondkleuring.
Als het protocol voor paraffinecoupes optimaal is zal de EGFR CISH worden uitgevoerd op
de te onderzoeken patiëntengroep.

De resultaten van de CISH zullen worden vergeleken met de resultaten van de EGFR eiwit
kleuring en de mutatieanalyse met behulp van een zelf ontworpen database. Hierbij is
gekozen voor een Access database, omdat hierbij geen dubbele records kunnen voorkomen en
dat het hierbij gemakkelijker is om gegevens in te voeren en later te analyseren.

Tevens zal worden getest of EGFR CISH kan worden gedaan op cytologisch materiaal. Als
testmateriaal wordt gebruik gemaakt van een A431 cellijn. De A431 cellijn is een humane
plaveiselcelcarcinoom van de huid. De A431 cellijn heeft een EGFR mutatie die voor een
amplificatie zorgt en is hierdoor een goede positieve controle. Het gebruik van cytologisch
materiaal heeft al voordeel dat het nemen van puncties minder belastend is voor de patiënt dan

8
het nemen van biopten. Verder wordt onderzocht of de EGFR immunokleuring van het
protocol werkt op cytologisch materiaal. De mutatieanalyse zal niet optimaal werken op
cytologisch materiaal doordat je niet kunt bepalen welke cellen je wil gebruiken, maar de
volledige suspensie moet gebruiken waar ook normale cellen in voorkomen. Hierdoor zal in
veel gevallen het percentage tumorcellen laag zijn (< 50%)

9
2 Materiaal en methode.
2.1 EGFR procedure
De EGFR procedure wordt door de patholoog aangevraagd waarna deze wordt gestart.
Als de procedure is gestart worden een reeks van coupes gesneden van verschillende diktes en
geplakt op glaasjes. Voor en na het snijden van de reeks worden coupes opgevangen voor een
standaard HE kleuring. De patholoog bepaald welke gedeelte van het weefsel gebruikt moet
worden voor de mutatieanalyse en bepaald het percentage tumorcellen. De twee HE coupes
worden gebruikt om te kunnen kijken waar de tumor zit in de coupe en of in beide nog
tumorcellen zitten. Dit is belangrijk omdat het anders mogelijk is dat de uitslagen vals
negatief zijn en de patholoog bepaald de locatie in de coupe voor mutatie analyse.
Voor de reeks bestaat uit de volgende coupes:
 Eerst worden 4 coupes van 3μm gesneden die gebruikt worden voor de TTF-1, EGFR
en ALK-1 kleuringen. Bij deze dikte word voorkomen dat de coupes uit meerdere
cellagen bestaan waardoor het signaal of achtergrond te sterk of onduidelijk wordt om
te bepalen welke cel aankleurt.
 Hierna worden 4 coupes van 10μm gesneden die gebruikt worden voor de EGFR en
K-ras mutatieanalyse. Coupes van 10μm bestaan uit ongeveer 2 cellagen, hierdoor
zitten in 1 coupe meer tumorcellen en is de opbrengst per coupe hoger. Dikkere coupes
zijn niet mogelijk doordat de coupes dan tijdens het snijden gaan brokkelen.
 Waarna nog 6 coupes van 5μm gesneden worden. Coupes van 5μm bestaan uit
ongeveer 1 cellaag. Dit zorgt ervoor dat de cellen in de coupes bijna de gehele kern
bevatten en voorkomt het dat een te groot gedeelte van het DNA mist waardoor deze
vals negatief kan worden voor de DNA In Situ Hybridisatie.

2.2 Immunohistochemie
Bij de immunohistochemie worden de TTF-1, EGFR, ALK-1 kleuring uitgevoerd. Hierbij
wordt gebruik gemaakt van het PowerVision-HRP Detection System van Immunologic.
PowerVision is een tweestaps detectiemethode waarmee antigenen in paraffinecoupes van
weefsels zichtbaar gemaakt kunnen worden.
Eerst worden de coupes gedeparaffineerd via alcohol
naar water, endogene peroxidase geremd en
voorbehandeld om de antigenen beter bereikbaar te
maken voor het antilichaam.
Nu wordt het weefsel geïncubeerd met het
specifiek primaire antilichaam (TTF-1, EGFR of ALK-
1). Na spoelen wordt het weefsel geincubeerd met Post-
antibody blocking, dit is een antilichaam dat bind aan het
primaire antilichaam als een tussenstap. Waarna het
wordt geincubeerd met PowerVision-HRP complex. Dit
zijn dextraansulfaatmoleculen met daaraan gekoppelde
antilichaamen en peroxidase. Deze binden aan de Post-
antibody blocking antilichamen. De visualisatie vind Figuur 9. schematische weergave van de
plaats door toevoeging van substraat/chromogeen- PowerVision Detection System.
oplossing (DAB). (figuur 5) Voor het volledige protocol
zie bijlage 1.

10
Deze immunologisch kleuringen alleen geven niet aan of er een EGFR mutatie met
amplificatie heeft, maar heeft een ondersteunende rol. Om deze rede worden er nog andere
testen gedaan zoals de EGFR en K-ras mutatieanalyse.

2.3 Mutatieanalyse
Met behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden
opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen
als op het K-ras gen.
De mutatieanalyse wordt uitgevoerd op paraffine gefixeerd materiaal waarvan coupes van
10μm worden gesneden. Aan de hand van de HE- kleuring en/of het aanvraagformulier wordt
bepaald welk gedeelte van de coupe wordt gebruikt voor de mutatieanalyse. Dit gedeelte
wordt verwijdert en gebruikt voor de mutatieanalyse.
De eerste stap van de procedure is het behandelen van het weefsel met een mix van Proteïnase
K, TrisHCl en SDS. Deze stap verwijdert de DNases uit het weefsel. Na deze stap wordt door
verhitting het paraffine uit het weefsel verwijdert en de cellen in suspensie gebracht.
Deze suspensie wordt gelyseerd met lysisbuffer zodat de cellen kapot gaan en het DNA
vrijkomt.
Daarna wordt een genestelde PCR gedaan
die bestaat uit twee PCR reacties. De eerste
wordt gedaan met primers die zich buiten
het doel DNA bevinden. De tweede wordt
gedaan met primers die specifiek het doel
DNA vermeerdert (figuur 4). Hierdoor
wordt het monster zeer zuiver. Dit wordt
afzonderlijk gedaan voor alle exonen.
Hierop volgt een PCR sequence-reactie.
Deze maakt het mogelijk om de specifieke
aminozuur volgorde in de exonen zichtbaar
te maken. Door deze te vergelijken met de
aminozuur volgorde van het wildtype EGFR
gen kunnen mutaties worden vastgesteld.
Van veel mutaties is bekent welk effect de
Gefitinib/erlotinib therapie op de tumor Figuur 10 schematisch weergave van de genestelde
heeft. Waardoor men eenvoudiger kan PCR-reactie.(10)
besluiten of de therapie gestart kan worden.
Hoe hoger de percentage tumorcellen in de begincoupe hoe groter de kans is dat een eventuele
mutatie wordt gevonden. Als het percentage lager dan 50% is de kans groter dat mutaties niet
worden gevonden. Als dit het geval is moeten de mutaties met behulp van andere technieken
worden gedetecteerd. Zoals in de VUmc met behulp van CISH. De mutatieanalyse op
cytologisch materiaal gebeurt bijna op dezelfde manier. Alleen kunnen hierbij niet de
tumorcellen worden geselecteerd van de rest van de cellen.

2.4 CISH
Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van de CISH.
De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit
alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om
aspecifieke hybridisatie te voorkomen.

11
 Bij de CISH moeten de paraffine coupes eerst gedeparaffineerd worden, waarna zowel de
paraffine coupes als de cytologische preparaten worden gekookt (b.v. >95°C bij
paraffinecoupes in kookbuffer) en gedigesteerd met een mild digestiemiddel om zo het DNA
toegankelijk te maken. Tijdens het hybridiseren zal de gelabelde EGFR-CISH-probe zich
binden aan gedeelte van DNA dat complementair is aan het DNA van de probe. Hierna wordt
de aspecifieke gebonden probe weggespoeld door het weefsel stringent te wassen. Hierna
wordt het weefsel geïncubeerd met muis-anti-digoxigenin of muis-anti-biotim dat bind aan het
label, waarna het geïncubeerd wordt door anti-muis-HRP- polymeer (polymeer met daaraan
peroxidase) welke zich bind aan het muis-anti-
digoxigenin. Waarna het ontwikkeld wordt met DAB
chromogeen, licht tegengekleurd met Haematoxyline en
afgedekt. Hierna worden de coupes beoordeelt met
behulp van een lichtmicroscoop. Bij de beoordeling
wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties)
per kern.
Bij normale cellen worden 1-2 stippen per cel
gevonden, bij tumorcellen met een verhoogd aantal
chromosomen (polysomie) worden er 3-5 stippen per
cel gevonden. In beide gevallen wordt er geen
amplificatie gevonden. Bij lichte amplificatie worden er
6-10 stippen per cel gevonden en bij amplificatie
worden er meer dan 10 stippen of grote genclusters
gevonden per cel. Bij beide is er amplificatie.
Het resultaat wordt vergeleken met de
immunohistochemische kleuringen en de
Figuur 11. schematische weergave
mutatieanalyse, aan de hand hiervan wordt beoordeeld van de EGFR CISH detectie
welke mensen worden behandeld met
Gefitinib/erlotinib en welke niet.

Bij de optimalisatie wordt begonnen met het huidige protocol van het VU medisch Centrum
(VUmc), zie bijlage 1. Het protocol wordt getest op 3 soorten weefsel. Twee typen
longcarcinomen, een adenocarcinoom voor licht gefixeerd materiaal met open chromatine
patroon en een plaveiselcelcarcinoom voor sterk gefixeerd materiaal met gesloten chromatine
patroon, en een tonsil voor licht gefixeerd materiaal met een gesloten chomatinepatroon. Van
elk weefsel wordt het representatieve gedeelte uitgekozen, uit de coupe gesneden en alle drie
op een objectglaasje geplakt zodat ze alle drie onder een dekglaasje van 24x40 mm passen.
Eerst wordt de testcoupe gekleurd met behulp van het VUmc protocol. In het VUmc protocol
wordt gebruik gemaakt van de Zymed® probe. Aan de hand van de resultaten van deze
kleuring wordt besloten welke variaties gedaan worden. Ook worden ze vergeleken met de
Zymed protocol (bijlage 2) en de ZytoVision protocol (bijlage 3)
De verschillende variaties die per onderdeel getest kunnen worden zijn te zien in tabel 1.

Tabel 1: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH paraffine protocol
Kookvloeistof Kook- Digestiemiddel digestietijd Denatureren Probe wassen detectie Detectie
methode methode
Tris/EDTA pH9 Magnetron Pepsine 0,01 0, 2, 5, 10, 10min. 80ºC Zymed 75- Sigma PV+
/0,05 /0,1% bij 20, 30, 40 probe 80ºC 5 Muis-anti-
37ºC minuten min digoxigenin
Zymed Waterbad Zymed 5min. 95ºC Zytovision 70 ºC Zymed EV
kookvloeistof digestie-middel probe 5 min Muis-anti-
KT of 37ºC digoxigenin
Zytovision bekerglas Zytovision Zytovision

12
kookvloeistof digestie-middel Muis-anti-
KT of 37ºC digoxigenin

Tevens wordt onderzocht of het mogelijk is om de EGFR procedure uit te voeren op

cytologisch materiaal. Hiervoor worden cytologische preparaten gemaakt volgen drie
verschillende methodes, de TTF-1 methode (bijlage 4), Pelillycet (bijlage 5) en de ThinPrep
methode (bijlage 6). Als materiaal voor de testen wordt de cellijn A431 gebruikt waarvan
bekend is dat deze een EGFR mutatie en amplificatie bevat. De variaties die gestest kunnen
worden zijn te zien in tabel 2. Ook worden A431 cellen doorgevoerd en ingebed om de
positieve controle te dienen.

Tabel 2: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH cytologie protocol
kookvloeistof Kookmethode Digestiemiddel digestietijd Probe detectie
Zymed Niet koken Zymed digestie- 0, 2, 5, 10 min Zymed probe Sigma Muis-anti-
kookvloeistof middel KT of 37ºC digoxigenin
Zytovision Waterbad Zytovision digestie- Zytovision Zymed Muis-
kookvloeistof middel KT of 37ºC probe anti-digoxigenin
2xSSC bekerglas Zytovision Muis-
anti-digoxigenin

Het geoptimaliseerde EGFR CISH protocol wordt dan gebruikt om de EGFR CISH bepaling
die nog open staan van het EGFR protocol uit te voeren. Deze worden beoordeeld op de
morfologie, aankleuring en op de aanwezigheid van genamplificaties om zo de kwaliteit van
de hybridisaties te bepalen. De gegevens worden ook gebruikt om de effectiviteit van het
geoptimaliseerde protocol is. De resultaten worden vergeleken met de andere testen van het
EGFR protocol.
Hiervoor wordt een Access database gemaakt om alle gegevens te verzamelen. De database
gaat bestaan uit verschillende tabellen die onderling verbonden worden. De tabellen worden
onderverdeeld in verschillende onderdelen, een hoofdtabel met de basis gegevens, een tabel
met de immunohistochemische gegevens, een met de mutatieanalyse gegevens en een tabel
met de EGFR CISH gegevens.

13
Figuur 12 Schematische weergave relaties in Access database
14
3 Resultaten
3.1 Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal

3.1.1
Als beginpunt van de resultaten zijn deze van het VUmc protocol. De coupes zijn slecht te
beoordelen door een bruine achtergrond in de gehele kern waardoor het signaal niet goed
beoordeelbaar is. De morfologie is bij alle weefsels goed. Alleen bij de adenocarcinoom en de
plaveiselcelcarcinoom is nog enigsinds een signaal detecteerbaar.

3.1.2
Bij het vervolg werden de digestie aangepast met 0,01% en 0,1% pepsine in een waterbad bij
37°C. Ook werd een nieuwe batch digoxin gebruikt en een blanco meegenomen. Bij beide
aanpassingen werd geen signaal gedetecteerd. De morfologie is redelijk bij beide en geen
achtergrond gedetecteerd bij de plaveiselcelcarcinoom.

3.1.3
Als aanpassing werden toen de denaturatie temperatuur aangepast tot 95°C. Ook werd
gevarieerd in digestietijd, 7,5; 15 en 30 minuten. Alleen bij de tonsil werd signaal
waargenomen bij alle digestietijden en denaturatie temperaturen. Het signaal was sterker bij
de bij 95°C gedenatureerde tonsil. De morfologie van de tonsil en de adenocarcinoom wordt
beduidend minder hoe langer de digestietijd, na 30 minuten digesteren is de morfologie slecht
en moelijk te zien. Bij de adenocarcinoom is nog altijd veel achtergrond

3.1.4
Nu werd de 0,01% en 0,1% pepsine en de zymed voorbehandeling uitgetest en werden ze
voor de detectie geincubeerd met normaal geit serum tegen de achtergrond. Bij de zymed
voorbehandeling werd bij alle weefsel signalen waargenomen. De morfologie was overal
goed en alleen bij de adenocarcinoom was nog steeds achtergrond zichtbaar.

3.1.5
De 0,01% en 0,1% pepsine en de zymed voorbehandeling word nu uitgetest met de
chromosoom 1 probe. Bij alle weefsel bij alle voorbehandelingen was het signaal zeer sterk en
de morfologie goed. Ook is bij geen van de weefsel achtergrond zichtbaar.

3.1.6
Testen werden nu gedaan met zowel de egfr probe als de chromosoom 1 probe. Als
voorbehandeling werden de coupes 2, 5,10 minuten gedigesteerd met de zymed
voobehandeling en 7,5 en 15 minuten met 0,05% pepsine. Nu werd nergens signaal
waargenomen. En bij de tonsil was bij de EGFR probe achtergrond zichtbaar

15
3.1.7
Nu werd het volledige zymed protocol getest met 5 en 10 min digestie. Ook werd deze getest
met eigen nemarini anti-digoxigenin en de EGFR probe. De chomosoom 1 probe werd nu ook
getest met de zymed methode aangevuld met de powervision methode. De tonsil had bij alle
behandelingen signaal. De andere weefsels hadden geen signaal. Alleen bij de nemarini
detectie had de adenocarcinoom achtergrond. Bij de chromosoom 1 probe werd overal signaal
waargenomen. Bij zowel de plaveiselcelcarcinoom als de adenocarcinoom was achtergrond
zichtbaar.

3.1.8
De zymed methode werd nu getest bij 10 en 15 minuten digestie met detectie met zymed
digoxigenin, zymed digoxigenin met powervision en sigma digoxigenin. Bij de tonsil werd
signaal gedetecteerd bij zymed digoxigenin en zymed digoxigenin met powervision. Voor de
rest geen signaal gedetecteerd. En bij de adenocarcinoom met sigma achtergrond zichtbaar.

3.1.9
De zymed methode werd nu getest door te koken in waterbad of bekerglas, 10 minuten te
digesteren. De detectie gebeurd 1 keer normaal en 1 keer versterk met de powervision
detectie. Signaal was duidelijk zichtbaar bij tonsil in alle gevallen en bij de adenocarcinoom
bij bekerglas en normale detectie. Morfologie is overal duidelijk en bij de powervision
detectie is bij alle weefsels sterke achtergrond zichtbaar.

3.1.10
Testen Zytovision EGFR probe. Volledig zytovision protocol, zymed protocol met zytovision
probe en zymed met zymed probe. Bij de zytovision protocol en de zymed protocol met
zytovision probe was bij alle weefsels een duidelijk signaal detecteerbaar, was de morfologie
goed en was geen achtergrond zichtbaar. De zymed protocol met zymed probe gaf alleen met
de tonsil en adenocarcinoom reactie.

3.1.11
Testen zymed protocol met 20 min. Digestie en koken in bekerglas. En zymed protocol met
zytovision probe. Zymed protocol met zytovision probe gaf goed signaal bij alle weefsels en
de zymed protocol met 20 min digestie gaf zwak signaal bij tonsil en adenocarcinoom.

3.1.12
Testen zytovision protocol met zymed probe op testweefsels en biopten met 5 en 10 minuten
digestie. Signaal is goed bij de testweefsels bij 10 minuten en bij biopten bij zowel 5 als 10
minuten. Het signaal bij de testweefsels is bij 5 minuten zwak bij de adenocarcinoom en
plaveiselcelcarcinoom en bij de tonsil goed. Bij de biopten is de morfologie bij 10 minuten
slecht.

16
Figuur 13. Uitlagen EGFR CISH optimalisatie A. adenocarcinoom VUmc protocol B. plaveiselcelcarcinoom
VUmc protocol C. tonsil VUmc protocol D. adenocarcinoom optimaal zymed protocol E. plaveiselcel-
carcinoom optimaal zymed protocol F tonsil optimaal zymed protocol G. adenocarcinoom optimaal zytovision
protocol H. plaveiselcelcarcinoom optimaal zytovision protocol I. tonsil optimaal zytovision protocol.

3.2 Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal

3.2.1
Testen TTF1 coupes die 1 dag, 2 dagen 3dagen en 4 dagen gefixeerd zijn.

Tabel 3. Uitslagen ttf1 1dag gefixeerd

digestie signaal morfologie achtergrond
0 min Geen Goed Geen
1 min Goed Goed Licht
2 min goed redelijk licht

Tabel 4 uislagen 2 dagen digestie

digestie signaal morfologie achtergrond
0 min Geen Goed Geen
1 min zwak Goed Licht
2 min zwak redelijk licht

Tabel 5 Uitslagen 3 dagen gefixeerd

Digestie signaal morfologie achtergrond
10 min kt Redelijk Goed Geen
10 min 37°C Sterk Goed Licht

17
 20 min sterk redelijk licht

Tabel 6 Uitslagen 4 dagen gefixeerd

digestie signaal morfologie achtergrond
2 min kt Geen Goed Geen
2 min 37°C geen Goed Licht
10 min geen redelijk licht

3.2.2

3.3Patiënten materiaal
De resultaten van de EGFR CISH bepalingen tezamen met de andere uitkomsten van het
CISH protocol zijn te zien in tabel 7. Voor een volledig overzicht van de resultaten zie bijlage
7.
Tabel 7. Overzicht van de resultaten van de EGFR CISH bepaling tezamen met de andere gegevens van
het EGFR protocol.
Type tumor Totaal T EGFR imh Mutatieanalyse EGFR CISH
tf1 EGFR K- Cluster/ Lichte polysomy normaal
pos RAS amplificatie amplificatie
1+ 2+ 3+ Exon1 exon20 Exon2 Exon
9 1 1
Adenocarcinoom 25 25 6 7 8 5 1 1 8 3 1 3 13
Plaveiselcelcarcinoom 5 - - 2 1 - - - - - 1 1 2
Kleincellig carcinoom 2 1 1 - - - - - - - - - 2
Grootcellig 11 5 4 1 3 - - 1 1 2 - 5 2
carcinoom

4 Conclusie en discussie
Uit deze optimalisatie is gebleken dat de EGFR probe van zymed niet optimaal is om het
EGFR gen in het DNA aan te kleuren is hierdoor beter niet als standaard gebruikt dient te
worden. De EGFR probe van zymed is naar grote waarschijnlijkheid niet goed gelabeld
waardoor deze zeer weinig label bevat en dus weinig aankleuring geeft. De Zytovision probe
daarentegen kleurt goed aan in de meeste omstandigheden. De optimale digestietijd is voor
weefsels 10 minuten en voor biopten 5 minuten. Uit het kleuren van aanvragen is gebleken
dat enkele weefsels moeilijk aan te kleuren zijn dit kan komen doordat deze te lang gefixeerd
zijn waardoor de probe niet meer bij het DNA kan komen. Dit kon worden opmerken bij de
cytologie. De 1 en 2 dagen ttf1 fixeren waren nog goed zichtbaar te maken met hooguit 5 min
digesteren en bij 3 dagen bij 20 minuten. De 4 dagen moesten nog langer fixeren. Hieruit kan
worden vastgesteld dat hoe langer het gefixeerd is hoe moeilijker het is om het DNA
toegankelijker te maken.

18
Literatuur verwijzingen

Sholl LM, John Iafrate A, Chou YP, Wu MT, Goan YG, Su L, Huang YT,
Christiani DC, Chirieac LR.;Validation of chromogenic in situ
hybridization for detection of EGFR copy number amplification in
nonsmall cell lung carcinoma.; Modern Pathology 2007 nr.20, blz1028-
35;

Suzuki S, Dobashi Y, Sakurai H, Nishikawa K, Hanawa M, Ooi A., Protein

overexpression and gene amplification of epidermal growth factor
receptor in nonsmall cell lung carcinomas. An immunohistochemical
and fluorescence in situ hybridization study.; Cancer 2005 103, blz.
1265-73;

Vocaturo A, Novelli F, Benevolo M, Piperno G, Marandino F, Cianciulli

AM, Merola R, Donnorso RP, Sperduti I, Buglioni S, Mottolese M.;
Chromogenic in situ hybridization to detect HER-2/neu gene
amplification in histological and ThinPrep-processed breast cancer fine-
needle aspirates: a sensitive and practical method in the trastuzumab
era.; Oncologist. 2006 11: blz.878-86.

Gallegos Ruiz MI, Floor K, Vos W, Grünberg K, Meijer GA, Rodriguez JA,
Giaccone G.; Epidermal growth factor receptor (EGFR) gene copy
number detection in non-small-cell lung cancer; a comparison of
fluorescence in situ hybridization and chromogenic in situ
hybridization.; Histopathology. 2007 51(5):blz. 631-7.

3. http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:EGFR_signaling_pathway.png
4. http://www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment127.pdf
2. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1395807
7. http://www.atlasantibodies.com/datasheet/HPA007982

19
 Bijlage 1
EGFR CISH Methode VUmc
A-specifieke achtergrond in de kern ontstaat bij overdigestie.
Powervision Plus i.p.v. Envision: sterkere achtergrond

Stap Voorbewerking Tijd

1. Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken bij 60°C
2. Coupes deparaffineren 2x 10 min
3. Spoel met alcohol absoluut 2x 10 min
4. Spoel met Leidingwater
5. Kook met 1 mM EDTA /TRIS pH9 in een magnetron 10 min
6. Laat de coupes afkoelen en was daarna de coupes met leidingwater 2x 3 min
7. Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 0,1% 5 min
pepsine/0,2N HCl bij 37°C op een stoof van 37°C,
100µl/coupe onder dekglaasjes en afgedekt door kap
8. Was de coupes met leidingwater 3x 2 min
9. Dehydreer de coupes met Alc. 70% -85% -95% -100%
10. Droog de coupes aan de lucht
Denatureren en hybridiseren
11. Breng een druppel probe op een dekglaasje en dek de coupe af
Sluit de randen af met rubbercement
10µl voor een glaasje van 22x22mm
15µl voor een glaasje van 24x32mm
12. Denatureer bij 80°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 10 min
13. Plaats de coupes in een vochtige bak bij 37°C 16-24 uur
Stringent wassen
14. Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
15. Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in waterbad 5 min
Verhoog voor elke coupe meer de temperatuur met 1°C tot 80°C
16. Was de coupes met PBS/ 0,05% Tween 20 bij kamer temperatuur 3x 2 min
Detectie
17. Rem endogene peroxidase met 3%H2O2/PBS 10 min
18. Spoel de coupes goed met PBS 10 min
19. Incubeer met Muis anti-Digoxin (Sigma) 1:100 **) 60 min
20. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min
21. Incubeer met EnvisionHRP Dako 30 min
22. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min
23. DAB Envision 10 min
24. Spoel met leidingwater
25. Kleur tegen met Haematoxylin 30 sec
26. Spoel met leidingwater
27. Dehydreer in oplopende alcohol reeks
28. Xyleen
29. Afdekken

20
Bijlage 2
Zymed EGFR CISH protocol
Tabel 3
St Voorbewerking Tijd
1 ap Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat
bij 65°C
2 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10
3 Spoelen met alcohol absoluut min10
2x
4 Spoel in leidingwater min
5 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min
6 Was de coupes in leidingwater 2x 3min
7 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 10 min
digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes
*)
8 Was de coupes met leidingwater 3x 2min
9 Dehydreer met alcohol absoluut
10 Droog de coupes aan de lucht
Denatureren en hybridiseren
11 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.
10μl voor een glaasje van 22x22mm
15μl voor een glaasje van 24x32mm
Sluit de randen af met rubbercement
12 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min
13 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24
Stringent wassen uur
14 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
15 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. 5 min
Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C
16 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min
Detectie
17 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min
18 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min
19 Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min
20 Afgieten van blocking oplossing
21 Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min
22 Was met PBS/tween 2x 3min
23 Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min
24 Was met PBS/tween 2x3min
25 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min
26 Spoel met leidingwater 2min
27 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec
28 Spoel met leidingwater
29 Dehydreer met alcohol absoluut
30 Xyleen
31 Afdekken

21
Bijlage 3
Zytovision EGFR CISH protocol

St Voorbewerking Tijd
32 ap Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat
bij 65°C
33 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10
34 Spoelen met alcohol absoluut min
2x 10
35 Spoel in leidingwater min
36 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min
37 Was de coupes in leidingwater 2x 3min
38 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 10 min
digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes
*)
39 Was de coupes met leidingwater 3x 2min
40 Dehydreer met alcohol absoluut
41 Droog de coupes aan de lucht
Denatureren en hybridiseren
42 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.
10μl voor een glaasje van 22x22mm
15μl voor een glaasje van 24x32mm
Sluit de randen af met rubbercement
43 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min
44 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24
Stringent wassen uur
45 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
46 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. 5 min
Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C
47 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min
Detectie
48 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min
49 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min
50 Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min
51 Afgieten van blocking oplossing
52 Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min
53 Was met PBS/tween 2x 3min
54 Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min
55 Was met PBS/tween 2x3min
56 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min
57 Spoel met leidingwater 2min
58 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec
59 Spoel met leidingwater
60 Dehydreer met alcohol absoluut
61 Xyleen
62 Afdekken
*) Standaard is 10 minuten, Biopten 5 minuten

22