Professional Documents
Culture Documents
EGFR Verslag 8
EGFR Verslag 8
Datum: 23-07-08
B&M DO cytohistopathologie
Gabriëlle Pinkse
2-1-2008 → 31-6-2008
VU medisch centrum
Stagebegeleider: Wim Vos
1
Inhoudsopgave
1 Inleiding...................................................................................................................................3
1.1Longcarcinomen.................................................................................................................4
1.2EGFR Protocol...................................................................................................................5
1.3Immunohistochemie...........................................................................................................5
1.4Mutatieanalyse...................................................................................................................6
1.5DISH..................................................................................................................................7
1.5.1CISH ...........................................................................................................................8
1.5.2Centromeer probe........................................................................................................9
1.6Doel en opzet van het onderzoek.......................................................................................9
2 Materiaal en methode.............................................................................................................10
2.1 1 EGFR procedure..........................................................................................................10
2.2 Immunohistochemie........................................................................................................10
2.3 Mutatieanalyse................................................................................................................11
2.4 CISH................................................................................................................................11
3 Resultaten...............................................................................................................................14
3.1Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal............................................................14
3.1.1 Vumc protocol .........................................................................................................14
3.1.2 Zymed protocol .......................................................................................................14
3.1.3 Zymed en Zytovision vergelijking...........................................................................15
3.1.4 Zytovision protocol..................................................................................................16
3.2Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal .....................................................17
3.3 Patiënten materiaal..........................................................................................................18
4 Conclusie en discussie...........................................................................................................19
5. Literatuur verwijzingen.........................................................................................................20
Bijlage 1 ...................................................................................................................................21
Bijlage 2 ...................................................................................................................................22
Bijlage 3 ...................................................................................................................................23
Bijlage 4 ...................................................................................................................................24
Bijlage 5 ...................................................................................................................................25
Bijlage 8 ...................................................................................................................................28
2
1 Inleiding
Bij recente ontwikkelingen van anti-kanker therapieën worden middelen gebruikt die bij
voorkeur specifiek inwerken op kankercellen. Receptor eiwitten zijn daarvoor zeer geschikt,
op voorwaarde dat deze specifieke eiwitten aanwezig zijn op de tumorcellen.
Een voorbeeld van bij deze therapieën zijn van proteïne kinases, in de meeste gevallen
tyrosine kinase. Deze spelen een belangrijke rol in het reguleren van de veel celfuncties, zoals
celdeling/celcyclus, celoverleving/celdood (apoptose) en DNA reparatie.
Tyrosine kinase remmers zijn kleine moleculen, die ervoor zorgen dat de receptoren geen
signalen meer kunnen geven doorgeven aan de aan de cel waardoor de functie van de tyrosine
kinase verhinderd word. (1)
Normaal gesproken wordt het EGFR voor een korte tijd geactiveerd, waardoor deze cellen
kort tot deling worden aangezet. Hierna worden de receptoren gerecycled of afgebroken.
Een verhoogde EGFR activiteit kan verschillende oorzaken hebben.
1. Een verhoogd aantal EGF receptoren op het celoppervlak als gevolg van een verhoogt
aantal EGFR genen in het DNA (gen amplificatie).
2. een gestegen aantal EGFR gen transcripties en translaties, waardoor er een
overexpressie ontstaat van mRNA, met als gevolg een verhoogt aantal EGF receptoren.
1. wijziging in turnover. Over dit laatste is weinig bekend.
Gefitinib/erlotinib bindt aan het intracellulaire gedeelte van de receptor, waardoor het
intracytoplasmatische domein niet meer gefosforyleerd wordt, hierdoor worden geen signalen
meer naar het cytoplasma en de kern doorgeven. Daardoor vindt de activatie van de
celproliferatie geremd en de apoptose remming niet plaats.
Bij patiënten met EGFR amplificatie als het aantal receptoren verhoogd en dit is klinisch
geassocieerd met een reactie op de Gefitinib/erlotinib (EGFR TKR) therapie. De respons op
deze behandeling komt bij circa 10% van de longcarcinomen, met name adenocarcinomen
3
voor. Vaker is dat bij vrouwen met name van het Oosterse ras, en vrouwen die niet gerookt
hebben,
Om deze redenen is het belangrijk dat er amplificaties kunnen worden aangetoond.
Figuur 2: Gefitinib/erlotinib zorg ervoor dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden,
hierdoor word geen signaal meer naar het cytoplasma en de kern doorgegeven. Dit zorgt ervoor dat de
celproliferatie geremd wordt en dat de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden. (4)
1.1 Longcarcinomen
Longcarcinomen zijn tumoren die ontstaan uit de bedekkende (epitheliale) laag van de longen
en bronchiën. Deze worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen
• Het kleincellig longcarcinoom
• Het niet-kleincellig longcarcinoom
Ongeveer 20% van de longcarcinomen behoord tot het kleincellige type. Deze worden zo
genoemd doordat de cellen zeer klein zijn en weinig cytoplasma bevatten.
De groep niet-kleincellige longcarcinoom bestaat uit 3 verschillende typen:
• Plaveiselcelcarcinoom (figuur 3A)
• Adenocarcinoom (figuur 3B)
• grootcellig carcinoom (figuur 3C)
A B C
4
Het plaveiselcelcarcinoom is het meest voorkomende type van longcarcinomen. Het
plaveiselcelcarcinoom ontwikkelt zich vanuit een morfologisch voorstadium plaveiselcellige
metaplasie met dysplasie.
Het adenocarcinoom heeft soms een morfologisch voorstadium: atypische adenomateuse
hyperplasie. Het adenocarinoom heeft als kenmerk dat het buizen kanvormen en
intracytoplasmatische vacuolen. In adenocarcinomen van de long komen EGFR of K-ras
mutaties voor in ongeveer 10 en 20-30% van de gevallen.
Tumoren waarbij het niet duidelijk is of het een plaveiselcelcarcinoom of een adenocarcinoom
is worden ze ingedeeld in de groep grootcellige carcinomen. Hiermee wordt duidelijk
gemaakt dat de tumor niet kleincellig is en dus behandeld moet worden als een niet-
kleincellig longcarcinoom. De stamcel van de long is niet bekend.
1.3 Immunohistochemie
Als onderdeel van de immunohistologische kleuringen van het
EGFR protocol worden de TTF-1(Thyroid transcription
factor-1), EGFR en ALK-1 (anaplastic lymphoma kinase-1)
gedaan.
Het TTF-1 eiwit komt voor inde kern en wordt gebruikt om
normaal schildklierweefsel aan te kleuren, maar waarvan is
gebleken dat het ook longtumoren aankleurt (figuur 4). De
TTF-1 is in het EGFR protocol opgenomen omdat men wilde
Figuur 4 TTF-1 kleuring
kijken naar de relatie met EGFR mutatie en amplificatie.
5
Het EGFR eiwit komt voor in het membraan van de cel en kleurt het intrinsieke gedeelte van
het EGF receptor aan. Bij de aanwezigheid van grote hoeveelheden receptoren komen deze
ook in het cytoplasma voor en wordt ook het cytoplasma aangekleurd. De EGFR kleuring
zorgt voor het zichtbaar maken van de receptoren, maar laat niet zien of het een EGFR gen
mutatie is of een andere mutatie in een ander gen. De coupes worden beoordeeld met behulp
van een scoringsschema. Deze gaat van 0, negatief, tot 3+, sterk positief. Hierbij wordt
gekeken naar de cytoplasmatische aankleuring en de membraan aankleuring (figuur 5)
6
wel opgenomen in het protocol en exon18 niet. Als uit verdere testen blijkt dat een EGFR
mutatie aanwezig zou moeten zijn wordt alsnog een exon18 mutatieanalyse aangevraagd.
Figuur 7 schematisch weergave van de verschillende EGFR mutaties in niet kleincellige longtumoren en
hun gevoeligheid voor Gefitinib/erlotinib therapie. (1)
1.5 DISH
7
1.5.1 CISH
Om het aantal genkopieën per cel te bepaling is een EGFR DNA In Situ Hybridisatie nodig
Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van chromogene ISH (CISH). Dit omdat
CISH een aantal voordelen heeft ten opzichte van FISH. Het belangrijkste voordeel is dat de
coupes te archiveren zijn, dit omdat het signaal niet uitdooft na verloop van tijd, waardoor
later nog terug kan worden gekeken naar de coupe. Een ander voordeel is dat de morfologie
van de cellen kan worden beoordeeld onder een normale lichtmicroscoop. Een ander voordeel
is dat er geen autofluorecentie kan optreden die het signaal kan verstoren. Het laatste voordeel
is dat CISH gevoeliger is dan FICH, dit omdat er bij de CISH versterkingsstappen zijn
waardoor het signaal sterker zichtbaar kan worden gemaakt.
De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit
alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om
aspecifieke hybridisatie op andere chromosomen/genen te voorkomen. CISH probes binden
sterker aan homologe DNA sequenties dan conventionele DNA probes.
Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern, zie figuur
8. Deze worden onderverdeeld in:
Normaal 1-2 stippen
Polysomie 3-5 stippen
Lichte amplificatie 6-10 stippen
Amplificatie >10 stippen of clusters
8
1.5.2 Centromeer probe
Centromeer probes zijn probes die gericht zijn tegen het centromeer regio. Met behulp van
deze probes kan worden uitgevonden hoeveel kopieën van een chromosoom aanwezig zijn.
Deze probes binden minder sterk aan het DNA dan een CISH probe. Dit komt doordat dit
gedeelte van het chromosoom voornamelijk bestaat uit repeterende gedeeltes. Deze bevatten
veel A-T verbindingen(GGAAT, AATGN), deze zijn minder sterk dan de G-C bindingen.
Hierdoor kunnen deze er eerder afspoelen. Hierdoor was je deze probes minder stringent dan
een normale CISH probe.
Met behulp van een centromeer probe kan zichtbaar gemaakt worden hoeveel chromosomen
in de cel aanwezig zijn.
Momenteel wordt een CISH voorschrift gebruikt voor formaline gefixeerd en paraffine
ingebed patiënten materiaal, dat nog niet optimaal is voor al het materiaal. Regelmatig is de
morfologie te slecht geworden om nog te beoordelen en de signalen zijn zwak of niet
zichtbaar of bevat teveel aspecifieke achtergrond.
Het is belangrijk om het CISH protocol te optimaliseren zodat aan de hand hiervan kan
worden besloten om de therapie te starten of aan te passen. Bij dit optimaliseren wordt
gebruik gemaakt van: een long adenocarcinoom als doeltumor met een open chromatine
patroon, een long plaveiselcelcarcinoom als doeltumor met een dicht chromatinepatroon en
een tonsil als milde fixatie en een dicht chromatinepatroon. Het chomatinepatoon is belangrijk
omdat het bepaald hoe toegankelijk het DNA is voor de probe. Hoe dichter het
chomatinepatroon hoe minder toegankelijk het DNA wordt voor de probe. De tonsil wordt
meergenomen als voorbeeld van een biopt die milder gefixeerd worden dan grotere stukken
weefsel. Voor het optimaliseren worden verschillende manieren van voorbehandelen getest,
hierbij wordt gevarieerd met de manier van koken en gebruik van digestiemiddel. Bij de
beoordeling wordt gekeken welke methode het beste signaal geeft en waarbij de morfologie
ook nog goed te beoordelen is. Verder wordt ook gevarieerd in detectiemethode om zo te
kijken welke het sterkste signaal geeft zonder teveel achtergrondkleuring.
Als het protocol voor paraffinecoupes optimaal is zal de EGFR CISH worden uitgevoerd op
de te onderzoeken patiëntengroep.
De resultaten van de CISH zullen worden vergeleken met de resultaten van de EGFR eiwit
kleuring en de mutatieanalyse met behulp van een zelf ontworpen database. Hierbij is
gekozen voor een Access database, omdat hierbij geen dubbele records kunnen voorkomen en
dat het hierbij gemakkelijker is om gegevens in te voeren en later te analyseren.
Tevens zal worden getest of EGFR CISH kan worden gedaan op cytologisch materiaal. Als
testmateriaal wordt gebruik gemaakt van een A431 cellijn. De A431 cellijn is een humane
plaveiselcelcarcinoom van de huid. De A431 cellijn heeft een EGFR mutatie die voor een
amplificatie zorgt en is hierdoor een goede positieve controle. Het gebruik van cytologisch
materiaal heeft al voordeel dat het nemen van puncties minder belastend is voor de patiënt dan
het nemen van biopten. Verder wordt onderzocht of de EGFR immunokleuring van het
protocol werkt op cytologisch materiaal. De mutatieanalyse zal niet optimaal werken op
cytologisch materiaal doordat je niet kunt bepalen welke cellen je wilt gebruiken, maar de
volledige suspensie moet gebruiken waar ook normale cellen in voorkomen. Hierdoor zal in
veel gevallen het percentage tumorcellen laag zijn (< 50%)
9
2 Materiaal en methode.
2.1 1 EGFR procedure
De EGFR procedure wordt door de patholoog aangevraagd waarna deze wordt gestart.
Als de procedure is gestart worden een reeks van coupes gesneden van verschillende diktes en
geplakt op glaasjes. Voor en na het snijden van de reeks worden coupes opgevangen voor een
standaard HE kleuring. De patholoog bepaald welke gedeelte van het weefsel gebruikt moet
worden voor de mutatieanalyse en bepaald het percentage tumorcellen. De twee HE coupes
worden gebruikt om te kunnen kijken waar de tumor zit in de coupe en of in beide nog
tumorcellen zitten. Dit is belangrijk omdat het anders mogelijk is dat de uitslagen vals
negatief zijn en de patholoog bepaald de locatie in de coupe voor mutatie analyse.
Voor de reeks bestaat uit de volgende coupes:
Eerst worden 4 coupes van 3μm gesneden die gebruikt worden voor de TTF-1, EGFR
en ALK-1 kleuringen. Bij deze dikte wordt voorkomen dat de coupes uit meerdere
cellagen bestaan waardoor het signaal of achtergrond te sterk of onduidelijk wordt om
te bepalen welke cel aankleurt.
Hierna worden 4 coupes van 10μm gesneden die gebruikt worden voor DNA extractie
ten behoeve van de EGFR en K-ras mutatieanalyse. Coupes van 10μm bestaan uit
ongeveer 2 cellagen, hierdoor zitten in 1 coupe meer tumorcellen en is de opbrengst
per coupe hoger. Dikkere coupes zijn niet mogelijk doordat de coupes dan tijdens het
snijden gaan brokkelen.
Waarna nog 6 coupes van 5μm gesneden worden. Coupes van 5μm bestaan uit
ongeveer 1 cellaag. Dit zorgt ervoor dat de cellen in de coupes bijna de gehele kern
bevatten en voorkomt het dat een te groot gedeelte van het DNA mist waardoor deze
vals negatief kan worden voor de DNA In Situ Hybridisatie.
2.2 Immunohistochemie
Bij de immunohistochemie worden de TTF-1, EGFR, ALK-1 kleuring uitgevoerd. Hierbij
wordt gebruik gemaakt van het PowerVision-HRP Detection System van Immunologic.
PowerVision is een tweestaps detectiemethode waarmee antigenen in paraffinecoupes van
weefsels zichtbaar gemaakt kunnen worden.
Eerst worden de coupes gedeparaffineerd via alcohol
naar water, endogene peroxidase geremd en
voorbehandeld om de antigenen beter bereikbaar te
maken voor het antilichaam.
Nu wordt het weefsel geïncubeerd met het
specifiek primaire antilichaam (TTF-1, EGFR of ALK-
1). Na spoelen wordt het weefsel geïncubeerd met Post-
antibody blocking, dit is een antilichaam dat bind aan het
primaire antilichaam als een tussenstap. Waarna het
wordt geïncubeerd met PowerVision-HRP complex. Dit
zijn dextraansulfaatmoleculen met daaraan gekoppelde
antilichamen en peroxidase. Deze dextraan tussen stap
geeft een veelvoudige versterking van het signaal. De Figuur 9. schematische weergave van de
dextraansulfaatmoleculen binden aan de Post-antibody PowerVision Detection System.
blocking antilichamen. De visualisatie vindt plaats door
10
toevoeging van substraat/chromogeen-oplossing (DAB). (figuur 9) Voor het volledige
protocol zie bijlage 1.
Deze immunologisch kleuringen alleen geven niet aan of er een EGFR mutatie met
amplificatie heeft, maar heeft een ondersteunende rol. Om deze rede worden er nog andere
testen gedaan zoals de EGFR en K-ras mutatieanalyse.
2.3 Mutatieanalyse
Met behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden
opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen
als op het K-ras gen.
De mutatieanalyse wordt uitgevoerd op paraffine gefixeerd materiaal waarvan coupes van
10μm worden gesneden. Aan de hand van de HE- kleuring en/of het aanvraagformulier wordt
bepaald welk gedeelte van de coupe wordt gebruikt voor de mutatieanalyse. Dit gedeelte
wordt verwijderd en gebruikt voor de mutatieanalyse.
De eerste stap van de procedure is het behandelen van het weefsel met een mix van Proteïnase
K, TrisHCl en SDS. Deze stap verwijdert de DNases uit het weefsel. Na deze stap wordt door
verhitting het paraffine uit het weefsel verwijderd en de cellen in suspensie gebracht.
Deze suspensie wordt gelyseerd met lysisbuffer zodat de cellen kapot gaan en het DNA
vrijkomt.
Daarna wordt een genestelde PCR gedaan
die bestaat uit twee PCR reacties. De eerste
wordt gedaan met primers die zich buiten
het doel DNA bevinden. De tweede wordt
gedaan met primers die specifiek het doel
DNA vermeerderd (figuur 10). Hierdoor
wordt het monster zeer zuiver. Dit wordt
afzonderlijk gedaan voor alle exonen.
Hierop volgt een PCR sequence-reactie.
Deze maakt het mogelijk om de specifieke
aminozuur volgorde in de exonen zichtbaar
te maken. Door deze te vergelijken met de
aminozuur volgorde van het wildtype EGFR
gen kunnen mutaties worden vastgesteld.
Van veel mutaties is bekend welk effect de
Gefitinib/erlotinib therapie op de tumor kan Figuur 10 schematisch weergave van de genestelde
hebben. Waardoor men eenvoudiger kan PCR-reactie.
besluiten of de therapie gestart kan worden.
Hoe hoger de percentage tumorcellen in de begincoupe hoe groter de kans is dat een eventuele
mutatie wordt gevonden. Als het percentage lager dan 50% is, is de kans groter dat mutaties
niet worden gevonden. Als dit het geval is moeten de mutaties met behulp van andere
technieken worden gedetecteerd. Zoals in de VUmc met behulp van CISH. De mutatieanalyse
op cytologisch materiaal gebeurt bijna op dezelfde manier. Alleen kunnen hierbij niet de
tumorcellen worden geselecteerd van de rest van de cellen.
2.4 CISH
Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van de CISH.
De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit
alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om
aspecifieke hybridisatie te voorkomen.
11
Bij de CISH moeten de paraffine coupes eerst gedeparaffineerd worden, waarna zowel de
paraffine coupes als de cytologische preparaten worden gekookt (b.v. >95°C bij
paraffinecoupes in kookbuffer) en gedigesteerd met een mild digestiemiddel om zo het DNA
toegankelijk te maken. Tijdens het hybridiseren zal de gelabelde EGFR-CISH-probe zich
binden aan gedeelte van DNA dat complementair is aan het DNA van de probe. Hierna wordt
de aspecifieke gebonden probe weggespoeld door het weefsel stringent te wassen. Vervolgens
wordt het weefsel geïncubeerd met muis-anti-digoxigenin of muis-anti-biotin dat bind aan het
label, waarna het geïncubeerd wordt door anti-muis-HRP- polymeer (polymeer met daaraan
peroxidase) welke zich bindt aan het muis-anti-
digoxigenin. Waarna het ontwikkeld wordt met DAB
chromogeen, licht tegengekleurd met Haematoxyline en
afgedekt (figuur 11) Hierna worden de coupes
beoordeeld met behulp van een lichtmicroscoop. Bij de
beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen
(hybridisaties) per kern.
Bij normale cellen worden 1-2 stippen per cel
gevonden, bij tumorcellen met een verhoogd aantal
chromosomen (polysomie) worden er 3-5 stippen per
cel gevonden. In beide gevallen wordt er geen
amplificatie gevonden. Bij lichte amplificatie worden er 6-
10 stippen per cel gevonden en bij amplificatie worden er
meer dan 10 stippen of grote genclusters gevonden per Figuur 11. schematische weergave
cel. Bij beide is er amplificatie. van de EGFR CISH detectie
Het resultaat wordt vergeleken met de
immunohistochemische kleuringen en de mutatieanalyse, aan de hand hiervan wordt
beoordeeld welke mensen worden behandeld met Gefitinib/erlotinib en welke niet.
Bij de optimalisatie wordt begonnen met het huidige protocol van het VU medisch Centrum
(VUmc), zie bijlage 1. Het protocol wordt getest op 3 soorten weefsel. Twee typen
longcarcinomen, een adenocarcinoom voor licht gefixeerd materiaal met open chromatine
patroon en een plaveiselcelcarcinoom voor sterk gefixeerd materiaal met gesloten chromatine
patroon, en een tonsil voor licht gefixeerd materiaal met een gesloten chomatinepatroon. Van
elk weefsel wordt het representatieve gedeelte uitgekozen, uit de coupe gesneden en alle drie
op een objectglaasje geplakt zodat ze alle drie onder een dekglaasje van 24x40 mm passen.
Eerst wordt de testcoupe gekleurd met behulp van het VUmc protocol. In het VUmc protocol
wordt gebruik gemaakt van de Zymed® probe. Aan de hand van de resultaten van deze
kleuring wordt besloten welke variaties gedaan worden. Mocht blijken dat het VU protocol
niet optimaliseren is zal worden overgegaan op het protocol van Zymed® (bijlage 2). Ook kan
het zijn dat de probe van een andere firma uitgetest zal worden (bijlage 3).
De verschillende variaties die per onderdeel getest kunnen worden zijn te zien in tabel 1.
Tabel 1: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH paraffine protocol
Kook- Kook- Digestiemiddel Digestie- Denatureren Probe wassen detectie Detectie
vloeistof methode tijd methode
Tris/EDTA Magnetron Pepsine 0,01 0, 2, 5, 10, 10min. 80ºC Zymed 75-80ºC Sigma Muis- PV+
pH9 /0,05 /0,1% bij 20, 30, 40 probe 5 min anti-
37ºC minuten digoxigenin
Zymed Waterbad Zymed digestie- 5min. 95ºC Zytovision 70 ºC Zymed Muis- EV
kook- middel KT of probe 5 min anti-
buffer 37ºC digoxigenin
Zytovision bekerglas Zytovision Zytovision
kook- digestie-middel Muis-anti-
buffer KT of 37ºC digoxigenin
12
Tevens wordt onderzocht of het mogelijk is om de EGFR procedure uit te voeren op
cytologisch materiaal. Hiervoor worden cytologische preparaten gemaakt volgen drie
verschillende methodes, de TTF-1 methode (bijlage 4), Pelillycet (bijlage 5) en de ThinPrep
methode (bijlage 6). Als materiaal voor de testen wordt de cellijn A431 gebruikt waarvan
bekend is dat deze een EGFR mutatie en amplificatie bevat. De variaties die gestest kunnen
worden zijn te zien in tabel 2. Ook worden A431 cellen doorgevoerd en ingebed om de
positieve controle te dienen.
Tabel 2: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH cytologie protocol
kookvloeistof Kookmethode Digestiemiddel digestietijd Probe detectie
Zymed Niet koken Zymed digestie- 0, 2, 5, 10 min Zymed probe Sigma Muis-anti-
kookvloeistof middel KT of 37ºC digoxigenin
Zytovision Waterbad Zytovision digestie- Zytovision Zymed Muis-
kookvloeistof middel KT of 37ºC probe anti-digoxigenin
2xSSC bekerglas Zytovision Muis-
anti-digoxigenin
Het geoptimaliseerde EGFR CISH protocol wordt dan gebruikt om de EGFR CISH bepaling
die nog open staan van het EGFR protocol uit te voeren. Deze worden beoordeeld op de
morfologie, aankleuring en op de aanwezigheid van genamplificaties om zo de kwaliteit van
de hybridisaties te bepalen. De gegevens worden ook gebruikt om de effectiviteit van het
geoptimaliseerde protocol is. De resultaten worden vergeleken met de andere testen van het
EGFR protocol.
Hiervoor wordt een Access database gemaakt om alle gegevens te verzamelen. De database
gaat bestaan uit verschillende tabellen die onderling verbonden worden. De tabellen worden
onderverdeeld in verschillende onderdelen, een hoofdtabel met de basis gegevens, een tabel
met de immunohistochemische gegevens, een met de mutatieanalyse gegevens en een tabel
met de EGFR CISH gegevens (figuur 12).
Hoofdtabel
14
Tabel 5 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol
varianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom
signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achter
5min digestie + + - - + - - + -
10 min digestie + + - - + - - + -
10 min digestie sigma anti digoxgenin + + - - + - - + -
10 min digestie pv+ + + - - + - - + -
15 min digestie pv+ + + - - + - - + -
Bekerglas 10 min. digestie + + - + + - - + -
Bekerglas 10 min digestie pv+ + + + - + + - + +
Bekerglas 20 min digestie +- + - +- + - - + -
10 min digestie stringent wassen 70° + + - + + - +- + -
15 min digestie stringent wassen 70° + + - + + - +- + -
De chromosoom 1 probe geeft goede tot sterke signalen bij alle variaties, waarbij alleen
achtergrond ontstaat bij het gebruik van PV+. Hieruit kan worden vastgesteld dat de
voorbehandeling optimaal is.(Tabel 6)
Tabel 6 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol en de chromosoom 1 probe
varianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom
signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achter
5 min 0,01% pepsine ++ + - ++ + - ++ + -
5 min 0,1%pepsine ++ + - ++ + - ++ + -
10 min Zymed ++ + - ++ + - ++ + -
7,5 min digestie 0,05 pepsine + + - + + - + + -
15 min digestie 0,05% pepsine + + - + + - + + -
10 min Zymed pv+ + + - + + + + + +
Uit de resultaten van tabel 4 en 5 blijkt dat het weefsel wel hybridiseerbaar is en denken we
dat de EGFR CISH probe van Zymed niet goed is. Daarom hebben we 10 testcoupes
opgestuurd naar Zymed voor consult en zijn we de EGFR CISH probe gaan testen wan een
andere firma (Zytovision).
15
3.1.4 Zytovision protocol
In tabel 8 is te zien dat het Zytovision protocol het beste werkt door het koken in een
waterbad en de digestietijd 10 minuten is, figuur 13 G, H en I. Deze zal worden gebruikt bij
de bepalingen op patiëntmateriaal. Bij 5 minuten digestie is het signaal bij de plaveisel-
celcarcinoom minder sterk. Het koken in een bekerglas zorgt ervoor dat de morfologie van de
adenocarcinoom minder wordt. Om de digestietijd bij biopten vast te stellen is er een random
biopt genomen en 5 en 10 minuten gedigesteerd (tabel 9). Hieruit blijkt dat het signaal bij
beide sterk is, maar dat bij langere digestie de morfologie duidelijk minder word. Biopten
worden om deze rede 5 minuten gedigesteerd bij de bepalingen op patiëntmateriaal.
Tabel 9 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol op biopten
tonsil
signaal morf achter
5 min digestie ++ + -
10 min digestie ++ +- -
Figuur 13. Uitlagen EGFR CISH optimalisatie VUmc protocol: A. adenocarcinoom B. plaveiselcelcarcinoom
C. tonsil. Optimaal Zymed protocol D. adenocarcinoom E. plaveiselcelcarcinoom F tonsil. Optimaal Zytovision
protocol G. adenocarcinoom H. plaveiselcelcarcinoom I. tonsil
16
3.2Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal
In tabel 10 is te zien dat de peliLyset en de Thinprep een geen tot zwak signaal geven met
enige achtergrond. Door de slecht resultaten zijn we hiermee niet verder gegaan.
De TTF-1 gefixeerde preparaten zijn goed te hybridiseren als deze 1 dag zijn gefixeerd. Bij 2
dagen fixatie is al te zien dat deze duidelijk minder goed te hybridiseren zijn, zie tabel 11.
Hierna zijn de 4 dagen gefixeerde preparaten getest, deze gaven bij geen van de geteste
condities een signaal, zie tabel 12. Doordat we geen preparaten meer hebben zijn we
doorgegaan met de 3 dagen gefixeerde preparaten
De 3 dagen gefixeerde preparaten gaven bij alle digestietijden een signaal, zie tabel 13.
Hieruit is op te maken dat de preparaten langer gedigesteerd moeten worden hoe langer ze
gefixeerd zijn.
17
3.3 Patiënten materiaal
Bij de beoordeling van het patiënt materiaal hebben we 51 cases getest. 10 van de
beoordeelde patiënten,5.1%, waren positief voor de EGFR mutatieanalyse en/of EGFR CISH.
Vier hiervan waren positief voor zowel de EGFR mutatieanalyse als de EGFR CISH, deze
waren altijd TTF1 positief en hadden indien getest een positieve EGFR immunokleuring. Dit
is in overeenstemming met de verwachtingen.
Vijf patiënten hadden een positieve mutatieanalyse, maar een negatieve CISH. In 1 geval had
deze helemaal geen signaal, dus zou positief kunnen zijn. 3 van deze 5 patiënten had een
positieve TTF1, 1 een negatieve en was deze bij 1 niet getest. De EGFR immunokleuring was
in alle gevallen positief, behalve bij 1 die niet getest was. Deze uitkomsten zijn grotendeels in
overeenstemming met verwachtingen, behalve bij 1 patiënt die negatief is voor de TTF1
kleuring.
Twee patiënten hadden een negatieve mutatieanalyse, maar een positieve CISH. Deze waren
negatief voor de TTF1 kleuring en 1 ervan was positief bij de EGFR immunokleuring, de
ander was negatief. Dit is dus niet in overeenstemming met de verwachtingen.
9 patiënten hadden een K-ras mutatie, geen van deze had een EGFR mutatie wat in
overeenstemming is met de verwachtingen.
Verder waren er 9 patiënten, 4,59% , die geen signaal kregen bij de EGFR CISH. Hiervan is
dus niet bekent of deze een mutatie kunnen bevatten.
Voor een volledig overzicht zie bijlage 8
Tabel 7. Samenvatting van de resultaten van de EGFR CISH bepaling tezamen met de andere gegevens
van het EGFR protocol.
Type tumor Adeno- Plaveiselcel- Kleincellig Grootcellig
carcinoom carcinoom carcinoom carcinoom
Totaal N= 33 5 2 11
TTF1 pos N= 25 - 1 5
EGFR imh 1+ 6 - 1 4
2+ 7 2 - 1
3+ 8 1 - 3
mutatieanalyse EGFR exon19 5 - - -
EGFR exon20 1 - - -
EGFR exon21 1 - - 1
K-ras exon1 8 - - 1
EGFR CISH Cluster/ amplificatie 3 - - 2
Lichte amplificatie 1 1 - -
polysomy 3 1 - 5
normaal 13 2 2 2
Geen signaal 5 1 - 2
18
4 Conclusie en discussie
Uit deze optimalisatie is gebleken dat de EGFR probe van Zymed niet optimaal is om het
EGFR gen in het DNA aan te kleuren is hierdoor beter niet als standaard gebruikt dient te
worden. De EGFR probe van Zymed is naar grote waarschijnlijkheid niet goed gelabeld
waardoor deze zeer weinig label bevat en dus weinig aankleuring geeft. De firma heeft recent
te kennen gegeven dat de probe inderdaad suboptimaal is. De Zytovision probe daarentegen
kleurt goed aan in de meeste omstandigheden. De optimale digestietijd is voor weefsels 10
minuten en voor biopten 5 minuten. Uit het kleuren van aanvragen is gebleken dat enkele
weefsels moeilijk aan te kleuren zijn dit kan komen doordat deze te lang gefixeerd zijn
waardoor de probe niet meer bij het DNA kan komen. Dit kon worden opmerken bij de EGFR
CISH op cytologie. De 1 en 2 dagen ttf1 fixeren waren nog goed zichtbaar te maken met
hooguit 5 min digesteren en bij 3 dagen bij 20 minuten. De 4 dagen moesten waarschijnlijk
nog langer digesteren. Hieruit kan worden vastgesteld dat hoe langer het gefixeerd is hoe
moeilijker het is om het DNA toegankelijker te maken. Doordat de EGFR immunokleuring nu
ook op cytologisch materiaal kan, is het mogelijk om de EGFR procedure ook uit te voeren op
cytologisch materiaal.
In de toekomst zou het mogelijk zijn om te testen of de slechte EGFR CISH resultaten bij
sommige patiënten komt doordat deze een langere tijd gefixeerd hebben. Ook zou kunnen
worden getest of deze nummers Met behulp van de FISH kan worden gedaan omdat deze
moleculen kleiner zijn en makkelijker de cel binnen kunnen dringen. Ook kan worden
gekeken of de EGFR CISH op peliLyset en Thinprep gefixeerde cellen ook geoptimaliseerd
kan worden.
19
5. Literatuur verwijzingen
1. Sreenath V. Sharma*, Daphne W. Bell*‡, Jeffrey Settleman* and Daniel A. Haber*,
Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer, Nature reviews. 2007 3:
Blz. 169-181
2. Kris Novak, PhD, Conference Report – Protein Kinase Inhibitors in Cancer Treatment:
Mixing and Matching?, MedGenMed. 2004; 6(2): 25
3. http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:EGFR_signaling_pathway.png
4. http://www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment127.pdf
20
Bijlage 1
EGFR CISH Methode VUmc
A-specifieke achtergrond in de kern ontstaat bij overdigestie.
Powervision Plus i.p.v. Envision: sterkere achtergrond
21
Bijlage 2
Zymed EGFR CISH protocol
Tabel 3
St Voorbewerking Tijd
1 ap Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat
bij 65°C
2 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10
3 Spoelen met alcohol absoluut min10
2x
4 Spoel in leidingwater min
5 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min
6 Was de coupes in leidingwater 2x 3min
7 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 10 min
digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes
*)
8 Was de coupes met leidingwater 3x 2min
9 Dehydreer met alcohol absoluut
10 Droog de coupes aan de lucht
Denatureren en hybridiseren
11 Breng een druppel EGFR CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe
af.
10μl voor een glaasje van 22x22mm
15μl voor een glaasje van 24x32mm
12 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min
13 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24
Stringent wassen uur
14 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
15 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. 5 min
Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C
16 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min
Detectie
17 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min
18 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min
19 Incubeer met caseïne blocking oplossing bij KT 10 min
20 Afgieten van caseïne blocking oplossing
21 Incubeer met muis-anti-digoxigenin bij KT 30 min
22 Was met PBS/tween 2x 3min
23 Incubeer met anti-muis-HRP polymeer bij KT 30 min
24 Was met PBS/tween 2x3min
25 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min
26 Spoel met leidingwater 2min
27 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec
28 Spoel met leidingwater
29 Dehydreer met alcohol absoluut
30 Xyleen
31 Afdekken
22
Bijlage 3
Zytovision EGFR CISH protocol
St Voorbewerking Tijd
32 ap Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat
bij 65°C
33 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10
34 Spoelen met alcohol absoluut min
2x 10
35 Spoel in leidingwater min
36 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min
37 Was de coupes in leidingwater 2x 3min
38 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 10 min
digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes
*)
39 Was de coupes met leidingwater 3x 2min
40 Dehydreer met alcohol absoluut
41 Droog de coupes aan de lucht
Denatureren en hybridiseren
42 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.
10μl voor een glaasje van 22x22mm
15μl voor een glaasje van 24x32mm
Sluit de randen af met rubbercement
43 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min
44 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24
Stringent wassen uur
45 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
46 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. 5 min
Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C
47 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min
Detectie
48 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min
49 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min
50 Incubeer met caseïne blocking oplossing bij KT 10 min
51 Afgieten van caseïne blocking oplossing
52 Incubeer met muis-anti-digoxigenin bij KT 30 min
53 Was met PBS/tween 2x 3min
54 Incubeer met anti-muis-HRP polymeer bij KT 30 min
55 Was met PBS/tween 2x3min
56 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min
57 Spoel met leidingwater 2min
58 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec
59 Spoel met leidingwater
60 Dehydreer met alcohol absoluut
61 Xyleen
62 Afdekken
*) Standaard is 10 minuten, Biopten 5 minuten
23
Bijlage 4
TTF-1 methode
24
Bijlage 5
PeliLyset methode
25
Bijlage 6
Thinprep methode
26
Bijlage 7
EGFR CISH cytologisch materiaal
S Voorbewerking Tijd
1. t Maak cytospins volgens de TTF1 procedure(zie 2x 10
2. BIJLAGE:IMHCYT00005/BL02
Kook met 2XSSC in een waterbad) bij 37°C 1min
uur
3. Was de coupes in leidingwater 2x 3min
4. Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met middel bij 2 min
KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes
5. Was de coupes met leidingwater 3x 2min
6. Dehydreer met alcohol absoluut
7. Droog de coupes aan de lucht
8. Denatureren en hybridiseren
9. Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af. Sluit
de randen af met rubbercement
10μl voor een glaasje van 22x22mm
10. Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min
11. Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24
12. Stringent wassen uur
13. Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een
cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur
14. Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. 5 min
Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C
15. Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min
16. Detectie
17. Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min
18. Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min
19. Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min
20. Afgieten van blocking oplossing
21. Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min
22. Was met PBS/tween 2x 3min
23. Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min
24. Was met PBS/tween 2x3min
25. Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min
26. Spoel met leidingwater 2min
27. Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec
28. Spoel met leidingwater
29. Dehydreer met alcohol absoluut
30. xyleen
31. Afdekken
27
Bijlage 8
Volledig overzicht EGFR procedure patiënten.
28