Article 

Chemical Composition, Antibacterial and Antibiofilm Actions 
of Oregano (Origanum vulgare subsp. hirtum) Essential Oil 
against Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes 
Sonia Kolypetri 1, Dimitra Kostoglou 1, Anastasios Nikolaou 2, Yiannis Kourkoutas 2 and Efstathios Giaouris 1,* 

1  Laboratory of Food Microbiology and Hygiene, Department of Food Science and Nutrition,   
School of the Environment, University of the Aegean, 81400 Myrina, Lemnos, Greece 
2  Laboratory of Applied Microbiology and Biotechnology, Department of Molecular Biology and Genetics, 

School of Health Sciences, Democritus University of Thrace, 68100 Alexandroupolis, Greece 
*  Correspondence: stagiaouris@aegean.gr; Tel.: +30‐22540‐83115 

Abstract:  Essential  oils  (EOs)  are  plant  mixtures  that  are  known  to  present  strong  bioactivities, 
including a wide antimicrobial action. Biofilms are microbial sessile structures that represent the 
default  mode  of  growth  of  microorganisms  in  most  environments.  This  study  focused  on  the 
antimicrobial action of the EO extracted from one of the most representative oregano species, that 
is, Origanum vulgare (subsp. hirtum), against two important foodborne pathogens, Salmonella enterica 
(serovar Typhimurium) and Listeria monocytogenes. For this, the minimum inhibitory concentrations 
of  the  EO  against  the  planktonic  and  biofilm  growth  of  each  bacterium were  determined  (MICs, 
MBICs),  together  with  the  minimum  bactericidal  and  biofilm  eradication  concentrations  (MBCs, 
MBECs).  The EO  was  also  analyzed  for  its  chemical composition  by  gas  chromatography—mass 
spectrometry analysis (GC‐MS). The influence of EO exposure on the expression of some important 
virulence genes (hly, inlA, inlB and prfA) was also studied in L. monocytogenes. Results revealed a 
strong antibacterial and antibiofilm action with MICs and MBICs ranging from 0.03% to 0.06% (v/v) 
Citation: Kolypetri, S.; Kostoglou,  and  from  0.06%  to  0.13%  (v/v),  respectively.  The  application  of  the  EO  at  6.25%  (v/v)  for  15  min 
D.; Nikolaou, A.; Kourkoutas, Y.; 
resulted in the total eradication of the biofilm cells of both pathogens. The EO was mainly composed 
Giaouris, E. Chemical Composition, 
of thymol, p‐cymene, γ‐terpinene and carvacrol. The 3 h exposure of L. monocytogenes planktonic 
Antibacterial and Antibiofilm 
cells to the EO at its MBIC (0.06% v/v) resulted in the significant downregulation of all the studied 
Actions of Oregano (Origanum 
genes  (p  <  0.05).  To  sum,  the  results  obtained  advocate  for  the  further  exploitation  of  the 
vulgare subsp. hirtum) Essential Oil 
against Salmonella Typhimurium and 
antimicrobial action of oregano EO in food and health applications. 
Listeria monocytogenes. Foods 2023, 12, 
2893. https://doi.org/10.3390/  Keywords:  oregano  essential  oil;  foodborne  pathogenic  bacteria;  minimum  inhibitory  and 
foods12152893  bactericidal  concentrations;  biofilms;  minimum  biofilm  eradication  concentration;  GC‐MS;  gene 
expression; RT‐qPCR; virulence; food safety 
Academic Editors: Gary Dykes   
 
Received: 8 June 2023 
Revised: 29 June 2023 
Accepted: 28 July 2023  1. Introduction 
Published: 29 July 2023 
The genus Origanum L. comprises several species which differ in morphology and 
chemical characteristics, with most of them being originated in the Mediterranean region 
  [1]. One of the most notable species is Origanum vulgare subsp. hirtum, which is a widely 
Copyright:  ©  2023  by  the  authors.  used aromatic plant in foods, feeds, cosmetics, and daily care products, especially due to 
Licensee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  its content in essential oil (EO), mainly rich in carvacrol and thymol [2]. An increasing 
This  article  is  an  open  access  article  number of studies have examined various bioactivities of O. vulgare EO, including strong 
distributed  under  the  terms  and  antimicrobial  action  against  various  bacteria  and  fungi  [3].  Such  bioactivities  may, 
conditions of the Creative Commons  however,  differ  between  the  EO  of  the  same  species  due  to  differences  in  chemical 
Attribution  (CC  BY)  license  composition which in turn are due to parameters such as the soil and climate conditions 
(https://creativecommons.org/license of plant growth, cultivation method, harvesting period, anatomical part of the plant used 
s/by/4.0/). 
for extraction and method used to extract the oil [4]. 

 
Foods 2023, 12, 2893. https://doi.org/10.3390/foods12152893  www.mdpi.com/journal/foods 
Foods 2023, 12, 2893  2  of  14 
 

Biofilms  are  microbial  sessile  (surface‐attached)  structures  that  represent  the 

dominant  mode  of  growth  of  almost  all  microorganisms  in  most  environments,  both 
natural and man‐made [5]. Biofilm formation by bacterial pathogens is a worrying ability 
due to the increased tolerance and resistance of the enclosed cells to antimicrobials and 
other physicochemical stresses [6]. Such recalcitrance of biofilm cells is the result of many 
factors that act in concert and are related to biofilm growth, such as the limited penetration 
and/or the inactivation of some antimicrobials through the extracellular biofilm matrix, 
the  reduced  growth  rate,  the  altered  gene  expression  and  physiology  of  biofilm  cells, 
together with the increased presence of dormant and super‐durable cells called persisters 
[7]. Alarmingly, biofilm formation is considered a key virulence factor for a wide range of 
microorganisms that cause human infections [8]. 
Salmonella enterica and Listeria monocytogenes are two well‐known pathogenic bacteria 
that are responsible for foodborne infections [9]. Based on the latest epidemiological data 
for Europe, in 2021, salmonellosis remained the second most common foodborne zoonosis 
in  humans  after  campylobacteriosis.  That  year,  Salmonella  provoked  773  foodborne 
outbreaks  (FBOs),  which  is  the  largest  number  of  FBOs  recorded  for  2021  [10].  As  in 
previous years, the three most commonly reported Salmonella serovars were S. Enteritidis 
(54.6%), S. Typhimurium (11.4%) and monophasic S. Typhimurium (1,4,(5),12:i:‐) (8.8%), 
representing 74.8% of the 50,817 confirmed human cases. On the other hand, listeriosis 
concerned  2183  confirmed  human  cases,  provoked  196  deaths,  and  resulted  in  a  case 
fatality ratio of 13.7% which is the highest compared to all the other zoonoses monitored. 
Both  S.  enterica  and  L.  monocytogenes  can  form  robust  biofilms  on  various  surfaces 
encountered within the food production chain and in this way persist and contaminate 
foods [11,12].  Thus,  the ability  of  these bacteria to  form  biofilms  and/or  be  included in 
those formed by other species (e.g., those of spoilage microflora) is considered a strong 
contributing factor to their prevalence in foods and their virulence potential [13–15]. 
The increased tolerance and resistance of several pathogenic bacteria to antibiotics 
and/or disinfectants has led to the continuous search for novel antimicrobial agents [16–
18].  Plants  may  be  a  promising  source  for  such  compounds  mainly  due  to  their  great 
biological diversity, abundance, and safe and ecofriendly nature [19,20]. In the past few 
years, there have been numerous studies published on the antimicrobial and antibiofilm 
actions of various EOs including those of oregano species [21–24]. Given that the EOs have 
multiple targets against microbial cells (e.g., rupture of the cell membrane, coagulation of 
the  cytoplasm,  interference  with  DNA  transcription,  protein  synthesis  and  enzymatic 
activity,  disturbance  of  the  proton  motive  force  etc.),  it  is  believed  that  this  lowers  the 
possibility for microorganisms to develop resistance [1]. In this study, we evaluated the 
antimicrobial  action  of  the  EO  extracted  from  plants  of  O.  vulgare  subsp.  hirtum, 
organically  cultured  on  Lemnos  Island  (north‐eastern  Greece),  against  both  planktonic 
and biofilm cells of S. Typhimurium and L. monocytogenes. The EO was also analyzed for 
its chemical composition by gas chromatography—mass spectrometry analysis (GC‐MS). 
The influence of EO sublethal exposure on the expression of some important virulence 
genes  (hly,  inlA,  inlB,  and  prfA)  was  also  studied  in  planktonic  L.  monocytogenes  cells 
through reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT‐qPCR). 

2. Materials and Methods 
2.1. Bacterial Strains and Preparation of Their Working Cultures 
The bacterial strains that were used in this study were S. enterica str. FMCC_B137, 
which  was  kindly  provided  by  Prof.  George‐John  Nychas  (Agricultural  University  of 
Athens, Athens, Greece), and L. monocytogenes str. AAL 20107, which was kindly supplied 
by Dr. Nikolaos Andritsos (Athens Analysis Laboratories S.A., Microbiology Laboratory, 
Metamorfosi, Greece). The strain of S. enterica belongs to serovar Typhimurium; it is an 
epidemic  strain  of  phage  type  DT193  and  was  originally  isolated  from  a  human 
salmonellosis  outbreak  [25].  The  strain  of  L.  monocytogenes  belongs  to  serovar  1/2b  and 

 
Foods 2023, 12, 2893  3  of  14 
 

was  originally  isolated  from  a  mixed  green  salad  [26].  Before  use,  both  strains  were 
maintained frozen at −80 °C in BHI broth (Lab M, Heywood, Lancashire, UK) containing 
15% v/v glycerol. When needed, each strain was streaked on Tryptone Soya Agar (TSA; 
Oxoid, Thermo Fisher Specialty Diagnostics Ltd., Hampshire, UK) and incubated at 37 °C 
for 24 h (preculture). Working cultures were prepared by inoculating a single colony from 
each preculture into 10 mL of fresh TSB (Condalab, Torrejón de Ardoz, Madrid, Spain) 
and then incubating at 37 °C for 18 h. The final concentration of each working culture was 
ca. 109 CFU/mL and its purity was always confirmed by streaking on TSA and incubating 
it at 37 °C for 24 h. 

2.2. O. vulgare EO 
The EO that was used in this work was extracted from dried plant material by hydro‐
distillation  procedure  as  previously  described  [27]  and  was  kindly  donated  by  Dr. 
Nikolaos Paterakis, owner of the essential oil production and trading company Aegean 
Organics  (Agios  Dimitrios,  Lemnos,  Greece).  The  year  of  harvest  was  2022.  Besides 
oregano, this company produces EOs and decoctions of various other aromatic plants that 
are all grown under a certified organic culture. Upon receipt, the EO was kept in a dark 
glass vial in the refrigerator (4 °C). 

2.3. Determination of Minimum Inhibitory and Bactericidal Concentrations of EO against 
Planktonic Bacteria (MICs, MBCs) 
The  MIC  of  the  EO  against  the  planktonic  growth  of  each  bacterial  strain  was 
determined  following  the  broth  microdilution  method  as  previously  described  [27].  In 
brief,  ten  different  concentrations  were  tested  for  the  EO  which  were  prepared  by 
successive two‐fold dilutions in TSB and ranged from 0.5 to 0.001% v/v (a stock solution 
of the EO at 1% v/v was initially prepared in TSB also containing 9% v/v ethanol). Then, 
360 μL of each of those dilutions were placed in duplicate in the wells of a sterile 100‐well 
Bioscreen honeycomb plate (Oy Growth Curves Ab Ltd., Turku, Finland), and inoculated 
with the tested bacteria so as to have an initial concentration of ca. 104−5 CFU/mL. The plate 
was incubated at 37 °C for 24 h in the Bioscreen Co Pro instrument, which was adjusted to 
record the absorbance of the contents of each well every 30 min at 600 nm (A600 nm). Pure 
sterile  growth  medium  (TSB)  was  used  as  a  negative  control  (NC).  For  each  bacterial 
strain,  the  MIC  of  the  EO  was  calculated  as  its  lowest  concentration,  resulting  in  no 
increase  in  absorbance  with  respect  to  the  NC.  To  determine  the  MBC,  10  μL  of  broth 
cultures were aspirated from all the non‐growth wells of the MIC assay and spotted (in 
duplicate) on TSA plates, which were then incubated at 37 °C for 24 h. For each bacterial 
strain, the MBC of the EO was determined as its lowest concentration that reduced the 
initial inoculum by more than 99.9% (no appearance of colonies). Each experiment was 
repeated three times starting from independent bacterial cultures. 

2.4. Determination of Minimum Biofilm Inhibitory Concentrations (MBICs) 
The  MBIC  of  the  EO  against  the  biofilm  growth  of  each  bacterial  strain  was 
determined following the crystal violet (CV) staining method as previously described [27]. 
In  brief, eight  different  concentrations were tested  for  the  EO  which  were  prepared  by 
successive two‐fold dilutions and ranged from 0.25 to 0.002% v/v. These dilutions were 
done in the respective growth medium for each strain (see below). Each bacterium was 
left to form biofilm on 96‐well polystyrene (PS) microtiter plates (transparent, flat, Cat. 
No. 30096, SPL Life Sciences, Gyeonggi‐do, Korea) for 96 h in the presence of each EO 
concentration. For that assay, biofilm formation took place under the optimum (biofilm‐
maximizing)  conditions  for  each  strain  (with  respect  to  medium,  time  and  incubation 
temperature), as these had been previously determined [27]. Thus, S. Typhimurium was 
grown in 1/10 diluted TSB (dTSB) at 20 °C, whereas L. monocytogenes was grown in BHI 
broth at 37 °C. For both bacteria, the growth medium was renewed at 48 h of incubation. 

 
Foods 2023, 12, 2893  4  of  14 
 

At  the  end  of  incubation,  the  accumulated  biomasses  were  quantified  through  their 
staining with CV (0.1% w/v) and subsequently measuring absorbance at 590 nm (A590 nm). 
For each bacterial strain, the MBIC of the EO was determined as its lowest concentration 
that completely inhibited biofilm formation (biomass accumulated did not significantly 
differ from the negative control). Each experiment was repeated three times starting from 
independent bacterial cultures. 

2.5. Determination of Minimum Biofilm Eradication Concentrations (MBECs) 
The MBEC of the EO against the already 96 h preformed biofilms of each bacterial 
strain was determined as previously described [27]. In brief, five different concentrations 
were  tested  for  the  EO  which  were  all  prepared  in  sterile  distilled  water  (dH2O)  by 
successive  two‐fold  dilutions  and  ranged  from  6.25  to  0.39%  v/v.  Each  EO  disinfection 
solution was left to act against the biofilm cells for 15 min at room temperature. For each 
disinfection  treatment,  the  survivors  were  enumerated  by  plate  counting  on  TSA 
following their removal from surfaces through scratching (with a plastic pipette tip). For 
each  bacterial  strain,  the  MBEC  of  the  EO  was  determined  as  its  lowest  concentration 
leading  to at least  six log  reductions  of the  biofilm  population  compared to  that  of  the 
negative control (dH2O also containing 10% v/v ethanol). Each experiment was repeated 
three times starting from independent bacterial cultures. 

2.6. Chemical Analysis of EO (GC‐MS) 
Oregano EO was diluted in pure hexane (1:9) and the mixture was then chemically 
characterized by GC‐MS analysis on a 6890N system (Agilent Technologies, Santa Clara, 
CA, USA) equipped with an HP‐5MS column (30 m, 0.25 mm inner diameter, 0.25 μm film 
thickness)  (Agilent  Technologies)  and  coupled  with  a  5973Network  mass  detector 
(Agilent Technologies), as previously described [27]. 

2.7. Sublethal Exposure of Planktonic L. monocytogenes Cells to EO and RNA Extraction 
L. monocytogenes bacteria from the final 18 h working culture were used to inoculate 
10 mL of sterile BHI broth at 1:100 dilution (so as to have an initial concentration of ca. 107 
CFU/mL). The new culture was incubated at 37 °C for 6 h and its cells were then collected 
by centrifugation (5000× g for 10 min at 4 °C) and the obtained pellet was subsequently 
suspended  in  4  mL  of  quarter‐strength  Ringer’s  solution  (Lab  M).  That  freshly  saline 
cellular  suspension  was  aliquoted  in  two  Eppendorf®  tubes  (2  mL  in  each  one)  and 
centrifuged  (5000×  g  for  10  min  at  4  °C).  One  of  the  two  bacterial  pellets  was  then 
suspended in 1 mL of the EO solution (0.063% v/v; equal to the MBIC), while the second 
pellet was suspended in 1 mL of dH2O to be used as the untreated control sample. The 
dH2O of the control sample also contained absolute ethanol at 0.56% v/v. This latter was 
the concentration that existed in the EO solution (and was used to disolve the oil). Both 
samples were incubated in a heating dry block for 3 h at 37 °C (sublethal EO exposure) 
and were then immediately centrifuged (5000× g for 10 min at 4 °C). Supernatants were 
discarded and each pellet was washed with dH2O through an additional centrifugation 
step (5000× g for 10 min at 4 °C) to remove any EO residues. Washed pellets were then 
suspended in 1 mL of RNAlater™ Stabilization Solution (AM7021, Invitrogen™, Thermo 
Fisher  Scientific,  Carlsbad,  CA,  USA)  and  incubated  overnight  at  4  °C.  Next  day, 
RNAlater™ Solution was removed by centrifugation (5000× g for 10 min at 4 °C) and each 
bacterial  pellet  was  then  resuspended  in  100  μL  of  TE  buffer  (10  mM  Tris‐HCl,  1  mM 
EDTA;  pH  8)  also  containing  2.5  mg/mL  lysozyme  (native,  chicken  egg  white,  4403, 
Calbiochem®, Merck KGaA) and incubated at 37 °C for 10 min. Following this enzymatic 
digest of the bacterial cell walls, the resulting homogenates were directly used for RNA 
extraction using the NucleoSpin® RNA Mini Kit (740955, MACHEREY‐NAGEL GmbH & 
Co. KG, Düren, Germany). 

 
Foods 2023, 12, 2893  5  of  14 
 

2.8. cDNA Synthesis and qPCR 
The cDNA synthesis was executed starting from 500 ng of each RNA sample (i.e., 
exposed and not exposed to the EO) using PrimeScript™ RT reagent Kit (RR037A, Takara 
Bio Inc., Shiga, Japan), according to the manufacturer’s instructions. Each cDNA template 
was  then  used  as  substrate  in  qPCR  prepared  using  the  FastGene®  IC  Green  2  ×  qPCR 
Universal Mix (LS4005, NIPPON Genetics EUROPE GmbH). Four virulence genes of L. 
monocytogenes were selected (hly, inlA, inlB and prfA) for this analysis, which was done as 
previously described [28]. Two reference (internal control) genes (tuf, gap) were included 
in each assay for the normalization of the qPCR data. Each experiment was repeated three 
times starting from independent bacterial cultures and each reaction was performed in 
triplicate. 

2.9. Statistics 
Biofilm plate counts (CFU/cm2) were transformed to logarithms before means and 
standard  deviations  were  computed.  The  derived  data  on  biofilm  biomasses  (A590  nm), 
planktonic  absorbances  (A600  nm),  and  biofilm  populations  (log10  CFU/cm2)  were  all 
submitted to analyses of variance (ANOVA), followed by Tukey’s multiple range post hoc 
honestly  significant  difference  (HSD)  tests  for  mean  comparison,  using  the  statistical 
software  STATISTICA®  (StatSoft  Inc.,  Tulsa,  OK,  USA).  In  ANOVA,  the  dependent 
variables were the biofilm biomasses (A590 nm), planktonic absorbances (A600 nm) and biofilm 
populations (log10 CFU/cm2), while the categorical factor was always the treatment (EO 
concentration). Regarding gene expression, the data derived from a total of 108 reactions 
were analyzed.  These  were  the  result  of  six different  cDNA  samples  (i.e.,  one bacterial 
strain × two treatments (exposed and not exposed to the EO) × three biological repetitions) 
× six genes (four targets plus two references)/sample × three technical replicates/gene. For 
each bacterial strain and target gene, unpaired two‐tailed Student’s t‐tests were applied 
to  check  for  any  significant  difference  in  gene  expression  (expressed  as  log2(fold 
difference)) between the two treatments. These tests were performed using the relevant 
function of Excel® module of the Microsoft® Office 365 suite (Redmond, WA, USA). For 
all statistical analyses, significant differences were reported at a p level of <0.05. 

3. Results and Discussion 
3.1. Antimicrobial Actions of O. vulgare EO against Planktonic and Biofilm Cells 
The minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations (MICs, MBCs) of 
O. vulgare EO against the planktonic cells of S. Typhimurium and L. monocytogenes were 
initially  determined.  The  MICs  were  found  equal  to  0.06  and  0.03%  v/v  against  S. 
Typhimurium and L. monocytogenes, respectively (Table 1; equal to 0.55 and 0.27 mg/mL, 
respectively). No differences between the MICs and MBCs were observed, indicating the 
strong bactericidal action of the EO. 

Table 1. Antibacterial (MIC and MBC values) and antibiofilm (MBIC and MBEC values) actions of 
O.  vulgare  EO  against  S.  Typhimurium  and  L.  monocytogenes  strains  expressed  as  either  EO 
percentages by volume (% v/v) or μL/mL. 

Antibacterial Action  Antibiofilm Action 
Bacterial Species    MIC 1  MBC 2  MBIC 3  MBEC 4 
% (v/v)  μL/mL  % (v/v)  μL/mL  % (v/v)  μL/mL  % (v/v)  μL/mL 
S. Typhimurium  0.06  0.6  0.06  0.6  0.13    1.3  6.25 (= 104.2 × MΒC)  62.5 
L. monocytogenes  0.03  0.3  0.03  0.3  0.06    0.6  6.25 (= 208.4 × MΒC)  62.5 
1 Minimum Inhibitory Concentration;  2 Minimum Bactericidal Concentration;  3 Minimum Biofilm 
Inhibitory Concentration; 4 Minimum Biofilm Eradication Concentration. 

Oregano EO, such as many other EOs, may present multiple modes of action against 
microbial cells. The reader is referred to specialized reviews on the mode of actions of EOs 

 
Foods 2023, 12, 2893  6  of  14 
 

for more info [1,2]. Many other studies have in the past analyzed the antimicrobial action 
of  O.  vulgare  EOs  against  planktonic  bacteria.  For  instance,  Mazzarrino  et  al.  (2015) 
determined the MICs of Italian O. vulgare EO against Salmonella spp. and L. monocytogenes 
and found values ranging from 0.6 to 1.2 μL/mL [29]. Assiri et al. (2016) determined the 
minimal  lethal  concentration  (MLC)  of  O.  vulgare  EO  from  Saudi  Arabia  against  S. 
Enteritidis  and  L.  monocytogenes  and  found  values  equal  to  0.16  and  0.32  mg/mL  [30]. 
Elansary  et  al.  (2108)  found  MIC  and  MBC  of  Egyptian  O.  vulgare  EO  against  L. 
monocytogenes equal to 0.40 and 0.83 mg/mL, respectively [31]. Barbosa et al. (2020) found 
maximum sublethal concentration (MSC) of Brazilian O. vulgare EO against S. Enteritidis 
equal to 0.13 mg/mL [32]. Torabian Kakhki et al. (2020) found MIC and MBC of Iranian O. 
vulgare  EO  against  L.  monocytogenes  equal  to  1.28  and  2.56  mg/mL,  respectively  [33]. 
Solarte et al. (2020) determined the MIC of Spanish O. vulgare EO against one reference S. 
Typhimurium strain and two porcine isolates equal to 0.31 mg/mL [34]. It is clear that the 
EO  from  the  Greek  organically  cultured  oregano  plants  tested  in  the  current  study 
presents  strong  antimicrobial  action  that  is  similar  or  even  superior  to  that  previously 
described for O. vulgare EOs from some other countries. 
Following  the  calculation  of  the  MICs  and  MBCs  of  the  O.  vulgare  EO  against  the 
planktonic S. Typhimurium and L. monocytogenes bacteria, we determined its minimum 
biofilm  inhibitory  concentrations  (MBICs)  against  the  biofilm  growth  of  those  bacteria. 
This is  because  both  pathogens are  known  to  form robust  biofilms  on  various  surfaces 
(both  food‐contact  and  non‐food‐contact  ones)  that  display  increased  tolerance  to 
antimicrobial agents and other stresses [35,36]. The protocol we followed to form biofilms 
had  been  previously  optimized  to  maximize  the  sessile  growth  by  each  of  these  two 
bacterial  strains  [27].  However,  and  despite  that  optimization,  the  determined  MBICs 
were  still  quite  small  and  equal  to  0.13  and  0.06%  v/v  against  S.  Typhimurium  and  L. 
monocytogenes,  respectively  (Table  1).  This  indicates  the  ability  of  the  O.  vulgare  EO  to 
efficiently inhibit biofilm formation by the tested pathogens at very low concentrations 
and thus its high antibiofilm potential. Figure 1 presents the biofilm biomasses (A590 nm) 
accumulated on the PS surface for each one of the eight tested EO concentrations (0.25–
0.002% v/v). The densities of the surrounding planktonic suspensions (A600 nm) found in the 
same wells at the time of sampling (96 h) are also shown for each treatment (as dotted 
curved lines). It is worth noting that in the case of L. monocytogenes, the application of the 
EO at its MBIC (0.06% v/v) resulted in the total inhibition of biofilm formation, whereas 
the surrounding planktonic cells were still able to multiply, although to a lesser extent 
compared to the  positive  control  (Figure  1B).  This is  quite interesting  since it probably 
indicates that the observed inhibition of biofilm formation should not be a sole result of 
the reduced growth rate of the bacteria (before and after their attachment to the surfaces), 
but  it  could  also  be  associated  with  the  inhibition  of  some  other  biofilm‐specific 
mechanisms,  such  as  intercellular  interactions  and  aggregation,  motility,  production  of 
extracellular polymeric substances (EPS), altered gene expression etc. It is indeed known 
that  various  phytochemicals  and  plant  extracts  may  display  antivirulence  abilities  and 
anti‐quorum sensing behavior upon their application at sub‐MICs [37,38]. Such targeted 
antibiofilm  action  at  sub‐MICs  is  believed  to  limit  the  possibilities  of  the  bacteria  to 
develop resistance [39]. 

 
Foods 2023, 12, 2893  7  of  14 
 

c c c c c 0.25
c
A 4.0

3.5
0.2

Planktonic culture (A600 nm)
3.0

b
Biofilm (A590 nm)
2.5 0.15

2.0

0.1
1.5

1.0
0.05

0.5 a a
a
0.0 0

c c 0.7
B 4.0
c
0.6
3.5
c bc

Planktonic culture (A600 nm)
3.0 0.5
Biofilm (A590 nm)

2.5
b 0.4

2.0
0.3

1.5

0.2
1.0 a
0.1
0.5
a a a

0.0 0
0.25% 0.125% 0.063% 0.031% 0.016% 0.008% 0.004% 0.002% PC NC
Treatment
 
Figure 1. Biofilm formation (A590 nm) by S. Typhimurium (A) and L. monocytogenes (B) strains on the 
PS  surface  of  the  96‐well  microtiter  plates,  in  the  presence  of  eight  different  O.  vulgare  EO 
concentrations (two‐fold dilutions ranging from 0.25 to 0.002% v/v). The bars represent the mean 
values ± standard deviations. The accumulated biofilm biomasses of the positive (PC) and negative 
control (NC) are also shown. For each bacterial strain, the MBIC of the EO (resulting in the total 
inhibition of biofilm formation) is indicated by the vertical arrow. The absorbances of planktonic 
suspensions (A600 nm) found in the same wells at the time of sampling (96 h) are also shown for each 
treatment  (dotted  curved  lines).  The  bars  of  standard  deviations  of  the  planktonic  means  were 
omitted  for  clarity.  In  each  graph  (bacterial  strain),  mean  biofilm  values  followed  by  different 
superscript letters (abc) differ significantly (p < 0.05). 

Besides the determination of the MBICs, we also determined the Minimum Biofilm 
Eradication Concentrations (MBECs) of O. vulgare EO against the 96 h preformed biofilms 
of each target pathogen. Results revealed that the oil needed to be applied at 6.25% v/v to 
destroy the biofilm communities of both pathogens (Figure 2). Undoubtedly, this is a quite 
high  concentration  that  clearly  denotes  the  great  recalcitrance  of  biofilm  cells.  This  is 
however  not  surprising  since  it  is  well  known  that  the  inclusion  of  bacteria  in  biofilm 
structures can greatly increase their tolerance and resistance to biocides, including known 
antibiotics [40,41]. Thus, in the current experimental setup, O. vulgare EO needed to be 
applied more than one hundred times more than its MBC to kill S. Typhimurium biofilm 
cells,  while  in  the  case  of  L.  monocytogenes  biofilm  cells,  the  required  increase  in 
concentration was even more spectacular (more than two hundred times more than its 
MBC)  (Table  1).  Another  probably  interesting  observation  is  that  a  dose‐response 

 
Foods 2023, 12, 2893  8  of  14 
 

behavior does not seem to exist in the case of the killing of biofilm cells (Figure 2). This is 
more  evident  in  the  case  of  L.  monocytogenes  where  the  application  of  O.  vulgare  EO  at 
0.39% v/v provoked a ca. five‐log reduction in the number of biofilm cells, whereas the 
further ten‐fold increase of the EO concentration to 3.13% v/v did not further improve its 
killing  action.  The  reasons  lying  behind  this  last  observation  are  not  known  but  we 
speculate that these may be somehow related to the presence of EPS and/or the complex 
biofilm  tertiary  structure  [42,43].  A  similar  behavior  has  been  previously  observed  in 
another similar older study of our group where an increase in the concentrations of sage 
and  spearmint  EOs  from  5%  to  15%  v/v  did  not  improve  their  efficiency  against 
Staphylococcus aureus biofilm bacteria [44]. 

10
A
9

8 d A d S. Typhimurium
Biofilm (Log10CFU/cm2)

7
L. monocytogenes
6

5 bc
c
4 B B
ab
B a
3 B

1
detection limit                  e C
(0.21 log10 CFU/cm2) 0
before NC 0.39% 0.78% 1.56% 3.13% 6.25%
disinfection EO concentration (% v/v)
after disinfection
Treatment  
Figure 2. Biofilm populations (log10 CFU/cm ) found in the wells of the 96‐well microtiter plates for 
2

the two bacterial strains (S. Typhimurium and L. monocytogenes) before and after disinfection with 
the O. vulgare EO. For each bacterial strain, the EO was tested in five different concentrations, two‐
fold dilutions ranging from 0.39 to 6.25% v/v. The biofilm population of the negative disinfection 
control (NC; sterile distilled water also containing 10% v/v ethanol) is also shown. The bars represent 
the mean values ± standard deviations. For each bacterial strain separately, mean values followed 
by different superscript letters differ significantly (p < 0.05). For each bacterial strain, the MBEC of 
the EO (resulting in more than six log reductions of its biofilm population with respect to that of the 
NC)  is  indicated  with  the  vertical  arrow.  The  detection  limit  of  the  plate  counting  method  (0.21 
log10CFU/cm2) is indicated with the horizontal dashed line. 

A few other studies have been published in the previous years testing the antibiofilm 
efficiency  of  O.  vulgare  EO  against  biofilm  formation  and/or  preformed  biofilms  of 
Salmonella spp. or L. monocytogenes. In such a study, Čabarkapa et al. (2019) tested the 
effectiveness  of  O.  vulgare  EO  against  planktonic  and  biofilm  cells  of  two  strains  of  S. 
Enteritidis  [21].  In  that  study,  O.  vulgare  EO  demonstrated  (as  expected)  a  significant 
antimicrobial  action  against  the  planktonic  cells  (MIC/MBC  =  0.16/0.31  μL/mL). 
Supplementation  of  EO  at  concentration  0.25xMIC  caused  50%  inhibition  of  biofilm 
formation for both the tested strains, while its supplementation at 2xMIC resulted in 90% 
inhibition of their biofilm formation. Contrary to our results, the study on the effectiveness 
of  EO  on  eradication  of  preformed  48  h‐old  biofilms  indicated  that  biofilm  reduction 
occurred in a dose‐dependent manner over time (the time of exposure ranged from 15 to 
60  min).  In  another  study,  Di  Vito  et  al.  (2020)  compared  the  in  vitro  antibiofilm 
effectiveness of Italian O. vulgare EO against 29 strains of Salmonella spp. isolated from 
poultry and pig farms belonging to two serotypes (S. Typhimurium and S. Infantis) [45]. 
O. vulgare EO was active on the disaggregation of mature biofilms of both serotypes, but 
no inhibiting activity was exerted on biofilm formation. Soni et al. (2013) evaluated EOs 

 
Foods 2023, 12, 2893  9  of  14 
 

of  thyme  and  oregano  and  their  antimicrobial  phenolic  constituent  carvacrol  for  their 
ability to inhibit biofilm formation and inactivate preformed Salmonella biofilms [46]. The 
presence of nonbiocidal concentrations of thyme oil, oregano oil and phenolic carvacrol 
at 0.006 to 0.012% v/v suppressed Salmonella spp. biofilm formation two‐ to four‐fold, but 
could not completely eliminate biofilm formation. Treatment of 1‐day‐old biofilms with 
thyme oil, oregano oil or carvacrol at 0.05 or 0.1% v/v significantly reduced the amount of 
preformed biofilms. In a recent study, Vidaković Knežević et al. (2023) determined the 
antibiofilm activity of O. vulgare EO from Serbia against five L. monocytogenes strains [47]. 
The MIC values of oregano EO ranged from 0.09 to 0.72 μL/mL. The exposure of 48 h‐old 
L. monocytogenes biofilms on PS to the oregano EO at its MBC (2xMIC) for 48 h reduced L. 
monocytogenes biofilm biomasses in the range of 42.9% to 78.6%. Desai et al. (2012) tested 
oregano EO for its ability to eliminate L. monocytogenes biofilms on PS and stainless steel 
(SS) surfaces [48]. For 1‐day old biofilms of mixed L. monocytogenes strains produced at 22 
oC on PS microtiter plates, only 0.1% v/v of EO was needed to eliminate 7 log CFU per 

well.  On  the  SS  coupons,  0.5%  v/v  was  adequate  to  completely  eliminate  4‐day‐old 
biofilms at 7 log CFU per coupon. However, in that older study, the EO was left to act for 
24 h against the preformed biofilms, something that probably explains its high efficiency. 
In  our  study,  we  chose  a  short  exposure  time  (15  min)  to  try  to  imitate  a  short 
disinfection/biocidal protocol that could be applied in the food industry and/or clinical 
settings. 

3.2. Chemical Composition of O. vulgare EO 
The  GC–MS analysis  of the  O. vulgare EO  revealed the  presence of 28  compounds 
representing  98.1%  of  the  total  oil  (Table  2).  The  EO  was  mainly  composed  of  the 
monoterpenes thymol (31.5%), p‐cymene (23.7%), γ‐terpinene (13.9%), and carvacrol (8%). 
All these  compounds  are  commonly  found  as  main  constituents  of  O. vulgare  EOs  and 
contribute  to  their  bioactivities  [2,3,49].  However,  in  most  other  studies,  the  EOs  are 
mainly composed of carvacrol, whereas the EO analyzed in the current study was mainly 
composed of thymol. This is not strange since some other studies have also described O. 
vulgare EOs of thymol chemotypes [50–54]. 

Table 2. Chemical composition of O. vulgare EO, as characterized by GC‐MS analysis. 

Compounds Detected  LRΙ  % Area 

Methyl‐cyclopentane  <700  0.8 
Methyl α‐methylbutanoate  781  0.1 
α‐Thujene  930  2.6 
α‐Pinene  936  2.3 
Camphene  949  0.6 
β‐Pinene  977  0.4 
1‐Octen‐3‐ol  997  0.2 
β‐Myrcene  999  3.4 
α‐Phellandrene  1008  0.7 
3‐Carene  1012  0.2 
α‐Terpinene   
1020  4.4 
(1‐methyl‐4‐(1‐methylethyl)‐1,3‐cyclohexadiene) 
p‐Cymene 
1034  23.7 
(1‐methyl‐4‐(1‐methylethyl)‐benzene) 
Sylvestrene 
1035  2.4 
((R)‐ 1‐methyl‐5‐(1‐methylethenyl)‐cyclohexene) 
p‐Cymenene 
1044  0.1 
(1‐methyl‐4‐(1‐methylethenyl)‐benzene) 
β‐cis‐Ocimene  1062  0.1 

 
Foods 2023, 12, 2893  10  of  14 
 

γ‐Terpinene 
1070  13.9 
(1‐methyl‐4‐(1‐methylethyl)‐1,4‐cyclohexadiene) 
α‐Terpinolene 
1095  0.3 
(1‐methyl‐4‐(1‐methylethylidene)‐cyclohexene) 
Linalool 
1123  0.1 
(3,7‐dimethyl‐1,6‐octadien‐3‐ol) 
Borneol  1183  0.4 
Terpinen‐4‐ol 
1191  0.7 
(4‐methyl‐1‐(1‐methylethyl)‐3‐cyclohexen‐1‐ol) 
α‐Terpineol 
1209  0.1 
(α,α‐4‐trimethyl‐3‐cyclohexene‐1‐methanol) 
1‐methoxy‐4‐methyl‐2‐(1‐methylethyl)‐benzene  1262  0.8 
Thymol  1341  31.5 
Carvacrol 
1346  8.0 
(2‐methyl‐5‐(1‐methylethyl)‐phenol) 
Caryophyllene  1439  0.8 
α‐Caryophyllene  1475  0.1 
β‐Bisabolene 
((S)‐1‐methyl‐4‐(5‐methyl‐1‐methylene‐4‐hexenyl)‐ 1532  0.1 
cyclohexene) 
Caryophyllene oxide  1610  0.1 
Total    98.1 
LRI: Linear retention index. 

3.3. Effect of O. vulgare EO on Virulence Gene Expression of Planktonic L. monocytogenes Cells 
The expression of the four target genes (hly, inlA, inlB, and prfA) by the planktonic L. 
monocytogenes bacteria following their sub‐lethal exposure to the O. vulgare EO is shown 
in  Figure  3.  All  the  studied  genes  were  significantly  downregulated  following  the 
exposure of the cells to the EO at its MBIC (0.06% v/v). This is an intriguing result and 
seems to agree with and is probably related to the inhibition of biofilm formation that was 
noticed for that  EO  concentration (Figure 1B).  Interestingly,  in  a  previous study  of  our 
group, all these four genes were found to be significantly overexpressed when the same 
L. monocytogenes strain (AAL 20107) was left to form biofilm on a PS surface [28]. The hly 
gene encodes in L. monocytogenes the hemolysin Listeriolysin O (LLO) which is crucial in 
the  manifestation  of  listeriosis  by  boosting  the  cell‐to‐cell  spread  and  thus  successful 
dissemination of the pathogen during infection [55]. Both inlA and inlB genes encode in L. 
monocytogenes for important surface proteins that are known to interact with distinct host 
receptors to cause infection of human cells and crossing of the intestinal, blood–brain or 
placental  barriers  [56].  PrfA  encodes  in  L.  monocytogenes  for  the  master  regulator  of 
virulence  that  controls  the  expression  of  multiple  virulence  factors  that  altogether 
facilitate the transition from extra‐ to intracellular environments [57]. Rather in agreement 
with our results, some other previous studies have shown the involvement of all these 
four genes in attachment, sessile growth, and biofilm formation by L. monocytogenes [58–
61]. In addition, the reduced expression of hly and prfA genes in L. monocytogenes following 
exposure to some other EOs has been shown in some other previous studies as well [62–
64]. 

 
Foods 2023, 12, 2893  11  of  14 
 

log2 (fold difference)
1

‐1
*
* *
‐2
*
‐3
hly inlA inlB prfA
gene
 
Figure 3. Relative quantification (log2(fold differences)) of the expressions of the four target genes 
(hly,  inlA,  inlB,  and  prfA)  by  the  planktonic  L.  monocytogenes  bacteria  following  their  sub‐lethal 
exposure to the O. vulgare EO at its MBIC (0.06% v/v). Each bar represents the mean ± standard errors 
(n  =  9).  The  statistically  significant  differences  in  genes’  expressions  between  the  two  treatments 
(exposed and not exposed to the EO) are indicated with asterisks (*) (p < 0.05). 

4. Conclusions 
Origanum vulgare subsp. hirtum EO, extracted from organically cultivated plants on 
the  Greek  island  of  Lemnos  was  found  to  present  strong  antimicrobial and antibiofilm 
actions  against  two  important  foodborne  pathogenic  bacteria  (S.  Typhimurium  and  L. 
monocytogenes). Its application at 0.13% v/v and 0.06% v/v was sufficient to inhibit biofilm 
formation by S. Typhimurium and L. monocytogenes, respectively, whereas this needed to 
be  applied  at  6.25%  v/v  (for  15  min)  to  eradicate  the  preformed  biofilms  of  the  same 
species. The EO was mainly composed of thymol, p‐cymene, γ‐terpinene and carvacrol. 
The sub‐lethal exposure of L. monocytogenes planktonic cells to the EO at its MBIC (0.06% 
v/v)  resulted  in  the  significant  downregulation  of  four  important  virulence  genes  (hly, 
inlA, inlB, and prfA). To sum, the results obtained advocate for the further exploitation of 
the  antimicrobial  action  of  oregano  EO  in  food  and  health  applications.  Future  studies 
could be conducted on some such applications. In addition, the specific mode of action of 
this EO against microbial cells could be tested by applying either the crude extract or some 
of its individual components. 

Author Contributions: Conceptualization, E.G.; methodology, D.K., A.N. and E.G.; validation, S.K., 
D.K. and A.N.; formal analysis, S.K, D.K., A.N. and E.G.; investigation, S.K. and A.N.; resources, 
Y.K.  and  E.G.;  data  curation,  D.K.,  A.N.  and  E.G.;  writing—original  draft  preparation,  E.G.; 
writing—review and editing, A.N., Y.K. and E.G.; visualization, D.K. and E.G.; supervision, D.K. 
and E.G.; project administration, E.G.; funding acquisition, Y.K. and E.G. All authors have read and 
agreed to the published version of the manuscript. 
Funding: This research received no external funding. 
Data Availability Statement: The data presented in this study are available upon reasonable request 
form the corresponding author. 
Acknowledgments: We thank George‐John Nychas (Agricultural University of Athens, Greece) for 
providing  us  with  S.  enterica  str.  FMCC_B137,  and  Nikolaos  Andritsos  (Athens  Analysis 
Laboratories  S.A.,  Microbiology  Laboratory,  Metamorfosi,  Greece)  for  providing  us  with  L. 
monocytogenes  str.  AAL  20107.  We  also  thank  Nikolaos  Paterakis  from  Aegean  Organics  for 
providing us the oregano essential oil. 
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. 

   

 
Foods 2023, 12, 2893  12  of  14 
 

References 
1. Sakkas, H.; Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. J. Microbiol. Biotechnol. 2017, 27, 
429–438. https://doi.org/10.4014/jmb.1608.08024. 
2. Lombrea, A.; Antal, D.; Ardelean, F.; Avram, S.; Pavel, I.Z.; Vlaia, L.; Mut, A.M.; Diaconeasa, Z.; Dehelean, C.A.; Soica, C.; et al. 
A recent insight regarding the phytochemistry and bioactivity of Origanum vulgare L. essential oil. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 9653. 
https://doi.org/10.3390/ijms21249653. 
3. Rodriguez‐Garcia,  I.;  Silva‐Espinoza,  B.A.;  Ortega‐Ramirez,  L.A.;  Leyva,  J.M.;  Siddiqui,  M.W.;  Cruz‐Valenzuela,  M.R.; 
Gonzalez‐Aguilar, G.A.; Ayala‐Zavala, J.F. Oregano essential oil as an antimicrobial and antioxidant additive in food products. 
Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1717–1727. https://doi.org/10.1080/10408398.2013.800832. 
4. Soltani, S.; Shakeri, A.; Iranshahi, M.; Boozari, M. A review of the phytochemistry and antimicrobial properties of Origanum 
vulgare L. and subspecies. Iran. J. Pharm. Res. 2021, 20, 268–285. https://doi.org/10.22037/ijpr.2020.113874.14539. 
5. Tolker‐Nielsen,  T.  Biofilm  development.  Microbiol.  Spectr.  2015,  3,  MB‐0001‐2014.  https://doi.org/10.1128/microbiolspec.MB‐
0001‐2014. 
6. Hall, C.W.; Mah, T.F. Molecular mechanisms of biofilm‐based antibiotic resistance and tolerance in pathogenic bacteria. FEMS 
Microbiol. Rev. 2017, 41, 276–301. https://doi.org/10.1093/femsre/fux010. 
7. Bridier, A.; Sanchez‐Vizuete, P.; Guilbaud, M.; Piard, J.C.; Naïtali, M.; Briandet, R. Biofilm‐associated persistence of food‐borne 
pathogens. Food Microbiol. 2015, 45 Pt B, 167–178. https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.04.015. 
8. Koo,  H.;  Allan,  R.N.;  Howlin,  R.P.;  Stoodley,  P.;  Hall‐Stoodley,  L.  Targeting  microbial  biofilms:  Current  and  prospective 
therapeutic strategies. Nat. Rev. Microbiol. 2017, 15, 740–755. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.99. 
9. Chlebicz,  A.;  Śliżewska,  K.  Campylobacteriosis,  salmonellosis,  yersiniosis,  and  listeriosis  as  zoonotic  foodborne  diseases:  A 
review. Int. J. Environ. Res. Public Health 2018, 15, 863. https://doi.org/10.3390/ijerph15050863. 
10. EFSA (European Food Safety Authority); ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control). The European Union 
One Health 2021 Zoonoses Report. EFSA J. 2022, 20, e07666. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7666. 
11. Bai, X.; Nakatsu, C.H.; Bhunia, A.K. Bacterial biofilms and their implications in pathogenesis and food safety. Foods 2021, 10, 
2117. https://doi.org/10.3390/foods10092117. 
12. Giaouris,  E.;  Heir,  E.;  Desvaux,  M.;  Hébraud,  M.;  Møretrø,  T.;  Langsrud,  S.;  Doulgeraki,  A.;  Nychas,  G.J.;  Kačániová,  M.; 
Czaczyk,  K.;  et  al.  Intra‐  and  inter‐species  interactions  within  biofilms  of  important  foodborne  bacterial  pathogens.  Front. 
Microbiol. 2015, 6, 841. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00841. 
13. Fàbrega,  A.;  Vila,  J.  Salmonella  enterica  serovar  Typhimurium  skills  to  succeed  in  the  host:  Virulence  and  regulation.  Clin. 
Microbiol. Rev. 2013, 26, 308–341. https://doi.org/10.1128/CMR.00066‐12. 
14. Galié, S.; García‐Gutiérrez, C.; Miguélez, E.M.; Villar, C.J.; Lombó; F. Biofilms in the food industry: Health aspects and control 
methods. Front. Microbiol. 2018, 9, 898. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00898. 
15. Matereke, L.T.; Okoh, A.I. Listeria monocytogenes virulence, antimicrobial resistance and environmental persistence: A review. 
Pathogens 2020, 9, 528. https://doi.org/10.3390/pathogens9070528. 
16. Chang, R.Y.K.; Nang, S.C.; Chan, H.K.; Li, J. Novel antimicrobial agents for combating antibiotic‐resistant bacteria. Adv. Drug. 
Deliv. Rev. 2022, 187, 114378. https://doi.org/10.1016/j.addr.2022.114378. 
17. McEwen,  S.A.;  Collignon,  P.J.  Antimicrobial  resistance:  A  one  health  perspective.  Microbiol.  Spectr.  2018,  6,  521–547. 
https://doi.org/10.1128/microbiolspec.ARBA‐0009‐2017. 
18. Rozman, U.; Pušnik, M.; Kmetec, S.; Duh, D.; Šostar Turk, S. Reduced susceptibility and increased resistance of bacteria against 
disinfectants: A systematic review. Microorganisms 2021, 9, 2550. https://doi.org/10.3390/microorganisms9122550. 
19. Abass,  S.;  Parveen,  R.;  Irfan,  M.;  Jan,  B.;  Husain,  S.A.;  Ahmad,  S.  Synergy  based  extracts  of  medicinal  plants:  Future 
antimicrobials  to  combat  multidrug  resistance.  Curr.  Pharm.  Biotechnol.  2022,  23,  1527–1540. 
https://doi.org/10.2174/1389201023666220126115656. 
20. Sakarikou,  C.;  Kostoglou,  D.;  Simões,  M.;  Giaouris,  E.  Exploitation  of  plant  extracts  and  phytochemicals  against  resistant 
Salmonella spp. in biofilms. Food Res. Int. 2020, 128, 108806. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2019.108806. 
21. Čabarkapa, I.; Čolović, R.; Đuragić, O.; Popović, S.; Kokić, B.; Milanov, D.; Pezo, L. Anti‐biofilm activities of essential oils rich 
in  carvacrol  and  thymol  against  Salmonella  Enteritidis.  Biofouling  2019,  35,  361–375. 
https://doi.org/10.1080/08927014.2019.1610169. 
22. Kerekes, E.B.; Vidács, A.; Takó, M.; Petkovits, T.; Vágvölgyi, C.; Horváth, G.; Balázs, V.L.; Krisch, J. Anti‐biofilm effect of selected 
essential  oils  and  main  components  on  mono‐  and  polymicrobic  bacterial  cultures.  Microorganisms  2019,  7,  345. 
https://doi.org/10.3390/microorganisms7090345. 
23. Lira, M.C.; Rodrigues, J.B.; Almeida, E.T.C.; Ritter, A.C.; Tondo, E.; Torres, S.M.; Schaffner, D.; de Souza, E.L.; Magnani, M. 
Efficacy of oregano and rosemary essential oils to affect morphology and membrane functions of noncultivable sessile cells of 
Salmonella  Enteritidis  86  in  biofilms  formed  on  stainless  steel.  J.  Appl.  Microbiol.  2020,  128,  376–386. 
https://doi.org/10.1111/jam.14423. 
24. Rossi, C.; Maggio, F.; Chaves‐López, C.; Valbonetti, L.; Berrettoni, M.; Paparella, A.; Serio, A. Effectiveness of selected essential 
oils and one hydrolate to prevent and remove Listeria monocytogenes biofilms on polystyrene and stainless steel food‐contact 
surfaces. J. Appl. Microbiol. 2022, 132, 1866–1876. https://doi.org/10.1111/jam.15376. 

 
Foods 2023, 12, 2893  13  of  14 
 

25. Kostaki, M.; Chorianopoulos, N.; Braxou, E.; Nychas, G.J.; Giaouris, E. Differential biofilm formation and chemical disinfection 
resistance  of  sessile  cells  of  Listeria  monocytogenes  strains  under  monospecies  and  dual‐species  (with  Salmonella  enterica) 
conditions. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 2586–2595. https://doi.org/10.1128/AEM.07099‐11. 
26. Kostoglou,  D.;  Tsaklidou,  P.;  Iliadis,  I.;  Garoufallidou,  N.;  Skarmoutsou,  G.;  Koulouris,  I.;  Giaouris,  E.  Advanced  killing 
potential  of  thymol  against  a  time  and  temperature  optimized  attached  Listeria  monocytogenes  population  in  lettuce  broth. 
Biomolecules 2021, 11, 397. https://doi.org/10.3390/biom11030397. 
27. Maniki, E.; Kostoglou, D.; Paterakis, N.; Nikolaou, A.; Kourkoutas, Y.; Papachristoforou, A.; Giaouris, E. Chemical composition, 
antioxidant, and antibiofilm properties of essential oil from Thymus capitatus plants organically cultured on the Greek Island of 
Lemnos. Molecules 2023, 28, 1154. https://doi.org/10.3390/molecules28031154. 
28. Toliopoulos, C.; Giaouris, E. Marked inter‐strain heterogeneity in the differential expression of some key stress response and 
virulence‐related genes between planktonic and biofilm cells in Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 2023, 390, 110136. 
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2023.110136. 
29. Mazzarrino, G.; Paparella, A.; Chaves‐López, C.; Faberi, A.; Sergi, M.; Sigismondi, C.; Compagnone, D.; Serio, A. Salmonella 
enterica and Listeria monocytogenes inactivation dynamics after treatment with selected essential oils. Food Control 2015, 50, 794–
803. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.10.029. 
30. Assiri,  A.M.A.;  Elbanna,  K.;  Al‐Thubiani,  A.;  Ramadan,  M.F.  Cold‐pressed  oregano  (Origanum  vulgare)  oil:  A  rich  source  of 
bioactive  lipids  with  novel  antioxidant  and  antimicrobial  properties.  Eur.  Food  Res.  Technol.  2016,  242,  1013–1023. 
https://doi.org/10.1007/s00217‐015‐2607‐7. 
31. Elansary,  H.O.;  Abdelgaleil,  S.A.M.;  Mahmoud,  E.A.;  Yessoufou,  K.;  Elhindi,  K.;  El‐Hendawy,  S.  Effective  antioxidant, 
antimicrobial  and  anticancer  activities  of  essential  oils  of  horticultural  aromatic  crops  in  northern  Egypt.  BMC  Complement. 
Altern. Med. 2018, 18, 214. https://doi.org/10.1186/s12906‐018‐2262‐1. 
32. Barbosa, L.N.; Alves, F.C.B.; Andrade, B.F.M.T.; Albano, M.; Rall, V.L.M.; Fernandes, A.A.H.; Buzalaf, M.A.R.; Leite, A.L.; de 
Pontes,  L.G.;  Dos  Santos,  L.D.;  et  al.  Proteomic  analysis  and  antibacterial  resistance  mechanisms  of  Salmonella  Enteritidis 
submitted  to  the  inhibitory  effect  of  Origanum  vulgare  essential  oil,  thymol  and  carvacrol.  J.  Proteomics  2020,  214,  103625. 
https://doi.org/10.1016/j.jprot.2019.103625. 
33. Torabian Kakhki, M.; Sedaghat, N.; Mohsenzadeh, M. Chemical composition, antioxidative, antibacterial, and time‐kill activities 
of some selected plant essential oils against foodborne pathogenic and spoilage organisms. Vet. Res. Forum 2020, 11, 339–346. 
https://doi.org/10.30466/vrf.2018.91902.2223. 
34. Solarte,  A.L.; Astorga,  R.J.; de  Aguiar,  F.C.;  Tarradas,  C.;  Luque, I.; Gómez‐Gascón,  L.;  Huerta, B.  Reduced  susceptibility  of 
Salmonella Typhimurium strains to oregano essential oil and enrofloxacin: An in vitro assay. Foodborne Pathog. Dis. 2020, 17, 29–
34. https://doi.org/10.1089/fpd.2019.2635. 
35. Colagiorgi, A.; Bruini, I.; Di Ciccio, P.A.; Zanardi, E.; Ghidini, S.; Ianieri, A. Listeria monocytogenes biofilms in the wonderland of 
food industry. Pathogens 2017, 6, 41. https://doi.org/10.3390/pathogens6030041. 
36. Merino, L.; Procura, F.; Trejo, F.M.; Bueno, D.J.; Golowczyc, M.A. Biofilm formation by Salmonella sp. in the poultry industry: 
Detection, control and eradication strategies. Food Res. Int. 2019, 119, 530–540. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.11.024. 
37. Bhattacharya,  S.P.;  Karmakar,  S.;  Acharya,  K.;  Bhattacharya,  A.  Quorum  sensing  inhibition  and  antibiofilm  action  of 
triterpenoids: An updated insight. Fitoterapia 2023, 167, 105508. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2023.105508. 
38. Gonçalves, A.S.C.; Leitão, M.M.; Simões, M.; Borges, A. The action of phytochemicals in biofilm control. Nat. Prod. Rep. 2023, 
40, 595–627. https://doi.org/10.1039/d2np00053a. 
39. Das, R.; Mehta, D.K. Microbial biofilm and quorum sensing inhibition: Endowment of medicinal plants to combat multidrug‐
resistant bacteria. Curr. Drug Targets 2018, 19, 1916–1932. https://doi.org/10.2174/1389450119666180406111143. 
40. Rather,  M.A.; Gupta,  K.; Mandal,  M.  Microbial  biofilm:  Formation,  architecture,  antibiotic  resistance,  and  control strategies. 
Braz. J. Microbiol. 2021, 52, 1701–1718. https://doi.org/10.1007/s42770‐021‐00624‐x. 
41. Yan, J.; Bassler, B.L. Surviving as a community: Antibiotic tolerance and persistence in bacterial biofilms. Cell Host Microbe 2019, 
26, 15–21. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.06.002. 
42. Bridier, A.; Piard, J.C.; Pandin, C.; Labarthe, S.; Dubois‐Brissonnet, F.; Briandet, R. Spatial organization plasticity as an adaptive 
driver of surface Microbial Communities. Front. Microbiol. 2017, 8, 1364. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01364. 
43. Okshevsky,  M.;  Meyer,  R.L.  The  role  of  extracellular  DNA  in  the  establishment,  maintenance  and  perpetuation  of  bacterial 
biofilms. Crit. Rev. Microbiol. 2015, 41, 341–352. https://doi.org/10.3109/1040841X.2013.841639. 
44. Vetas,  D.;  Dimitropoulou,  E.;  Mitropoulou,  G.;  Kourkoutas,  Y.;  Giaouris,  E.  Disinfection  efficiencies  of  sage  and  spearmint 
essential oils against planktonic and biofilm Staphylococcus aureus cells in comparison with sodium hypochlorite. Int. J. Food 
Microbiol. 2017, 257, 19–25. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2017.06.003. 
45. Di Vito, M.; Cacaci, M.; Barbanti, L.; Martini, C.; Sanguinetti, M.; Benvenuti, S.; Tosi, G.; Fiorentini, L.; Scozzoli, M.; Bugli, F.; et 
al. Origanum vulgare essential oil vs. a commercial mixture of essential oils: In vitro effectiveness on Salmonella spp. from poultry 
and swine intensive livestock. Antibiotics 2020, 9, 763. https://doi.org/10.3390/antibiotics9110763. 
46. Soni, K.A.; Oladunjoye, A.; Nannapaneni, R.; Schilling, M.W.; Silva, J.L.; Mikel, B.; Bailey, R.H. Inhibition and inactivation of 
Salmonella  Typhimurium  biofilms  from  polystyrene  and  stainless  steel  surfaces  by  essential  oils  and  phenolic  constituent 
carvacrol. J. Food Prot. 2013, 76, 205–212. https://doi.org/10.4315/0362‐028X.JFP‐12‐196. 

 
Foods 2023, 12, 2893  14  of  14 
 

47. Vidaković  Knežević,  S.;  Knežević,  S.;  Vranešević,  J.;  Kravić,  S.Ž.;  Lakićević,  B.;  Kocić‐Tanackov,  S.;  Karabasil,  N.  Effects  of 
selected  essential  oils  on  Listeria  monocytogenes  in  biofilms  and  in  a  model  food  system.  Foods  2023,  12,  1930. 
https://doi.org/10.3390/foods12101930. 
48. Desai, M.A.; Soni, K.A.; Nannapaneni, R.; Schilling, M.W.; Silva, J.L. Reduction of Listeria monocytogenes biofilms on stainless 
steel and polystyrene surfaces by essential oils. J. Food Prot. 2012, 75, 1332–1337. https://doi.org/10.4315/0362‐028X.JFP‐11‐517. 
49. Leyva‐López, N.; Gutiérrez‐Grijalva, E.P.; Vazquez‐Olivo, G.; Heredia, J.B. Essential oils of oregano: Biological activity beyond 
their antimicrobial properties. Molecules 2017, 22, 989. https://doi.org/10.3390/molecules22060989. 
50. Betancourt,  L.;  Phandanauvong,  V.;  Patiño,  R.;  Ariza‐Nieto,  C.;  Afanador‐Téllez,  G.  Composition  and  bactericidal  activity 
against beneficial and pathogenic bacteria of oregano essential oils from four chemotypes of Origanum and Lippia genus. Rev. 
Med. Vet. Zootec. 2012, 59, 21–31. 
51. Bonfanti, C.; Iannì, R.; Mazzaglia, A.; Lanza, C.M.; Napoli, E.M.; Ruberto, G. Emerging cultivation of oregano in Sicily: Sensory 
evaluation  of  plants  and  chemical  composition  of  essential  oils.  Ind.  Crops  Prod.  2012,  35,  160–165. 
https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2011.06.029. 
52. Gong, H.Y.; Liu, W.H.; Lv, G.Y.; Zhou, X. Analysis of essential oils of Origanum vulgare from six production areas of China and 
Pakistan. Rev. Bras. Farmacogn. 2014, 24, 25–32. https://doi.org/10.1590/0102‐695X2014241434. 
53. Mechergui, K.; Coelho, J.A.; Serra, M.C.; Lamine, S.B.; Boukhchina, S.; Khouja, M.L. Essential oils of Origanum vulgare L. subsp. 
glandulosum (Desf.) Ietswaart from Tunisia: Chemical composition and antioxidant activity. J. Sci. Food Agric. 2010, 90, 1745–
1749. https://doi.org/10.1002/jsfa.4011. 
54. Spagnoletti, A.; Guerrinia, A.; Tacchini, M.; Vinciguerra, V.; Leone, C.; Maresca, I.; Simonetti, G.; Sacchetti, G.; Angiolella, L. 
Chemical composition and bio‐efficacy of essential oils from Italian aromatic plants: Mentha suaveolens, Coridothymus capitatus, 
Origanum hirtum and Rosmarinus officinalis. Nat. Prod. Commun. 2016, 11, 1517–1520. 
55. Osborne, S.E.; Brumell, J.H. Listeriolysin O: From bazooka to Swiss army knife. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2017, 372, 
20160222. https://doi.org/10.1098/rstb.2016.0222. 
56. Ireton, K.; Mortuza, R.; Gyanwali, G.C.; Gianfelice, A.; Hussain, M. Role of internalin proteins in the pathogenesis of Listeria 
monocytogenes. Mol. Microbiol. 2021, 116, 1407–1419. https://doi.org/10.1111/mmi.14836. 
57. Gaballa,  A.;  Guariglia‐Oropeza,  V.;  Wiedmann,  M.;  Boor,  K.J.  Cross  talk  between  SigB  and  PrfA  in  Listeria  monocytogenes 
facilitates  transitions  between  extra‐  and  intracellular  Environments.  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.  2019,  83,  e00034‐19. 
https://doi.org/10.1128/MMBR.00034‐19. 
58. Chen,  B.Y.;  Kim,  T.J.;  Silva,  J.L.;  Jung,  Y.S.  Positive  correlation  between  the  expression  of  inlA  and  inlB  genes  of  Listeria 
monocytogenes and its attachment strength on glass surface. Food Biophys. 2009, 4, 304–311. https://doi.org/10.1007/s11483‐009‐
9128‐5. 
59. de Grandi, A.Z.; Pinto, U.M.; Destro, M.T. Dual‐species biofilm of Listeria monocytogenes and Escherichia coli on stainless steel 
surface. World J. Microbiol. Biotechnol. 2018, 34, 61. https://doi.org/10.1007/s11274‐018‐2445‐4. 
60. Luo, Q.; Shang, J.; Feng, X.; Guo, X.; Zhang, L.; Zhou, Q. PrfA led to reduced biofilm formation and contributed to altered gene 
expression patterns in biofilm‐forming Listeria monocytogenes. Curr. Microbiol. 2013, 67, 372–378. https://doi.org/10.1007/s00284‐
013‐0377‐7. 
61. Price, R.; Jayeola, V.; Niedermeyer, J.; Parsons, C.; Kathariou, S. The Listeria monocytogenes key virulence determinants hly and 
prfA  are  involved  in  biofilm  formation  and  aggregation  but  not  colonization  of  fresh  produce.  Pathogens  2018,  7,  18. 
https://doi.org/10.3390/pathogens7010018. 
62. Huang, Y.; Xue, C.; He, W.; Zhao, X. Inhibition effect of Zedoary turmeric oil on Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus 
growth and exotoxin proteins production. J. Med. Microbiol. 2019, 68, 657–666. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000949. 
63. Liu, Z.; Meng, R.; Zhao, X.; Shi, C.; Zhang, X.; Zhang, Y.; Guo, N. Inhibition effect of tea tree oil on Listeria monocytogenes growth 
and exotoxin proteins listeriolysin O and p60 secretion. Lett. Appl. Microbiol. 2016, 63, 450–457. https://doi.org/10.1111/lam.12666. 
64. Marini,  E.;  Magi,  G.;  Ferretti,  G.;  Bacchetti,  T.;  Giuliani,  A.;  Pugnaloni,  A.;  Rippo,  M.R.;  Facinelli,  B.  Attenuation  of  Listeria 
monocytogenes  virulence  by  Cannabis  sativa  L.  essential  oil.  Front.  Cell.  Infect.  Microbiol.  2018,  8,  293. 
https://doi.org/10.3389/fcimb.2018.00293. 

Disclaimer/Publisher’s  Note:  The  statements,  opinions  and  data  contained  in  all  publications  are  solely  those  of  the  individual 
author(s) and contributor(s) and not of MDPI and/or the editor(s). MDPI and/or the editor(s) disclaim responsibility for any injury 
to people or property resulting from any ideas, methods, instructions or products referred to in the content.