ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRƯỜNG HÓA VÀ KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 5: Phân tích thành phần đường/oligosaccarit bằng phương
pháp sắc kí bản mỏng (TLC)

Họ và tên: Hoàng Thị Tú Uyên - 20211570

Lớp: KTTP 02 – K66
Mã lớp: 728605
Giảng viên hướng dẫn: TS. Đỗ Biên Cương
ThS. Lê Thị Lan Chi
Bài 5: Phân tích thành phần đường/oligosaccarit bằng phương pháp
sắc kí bản mỏng (TLC)

I. Nguyên tắc
- Sắc ký: là quá trình phân tách dựa vào sự phân bố khác nhau giữa pha
động và pha tĩnh
- Dựa trên sự tương tác giữa chất cần phân tích với pha tĩnh và pha
động
+ Pha động: chất lỏng, giúp chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp
thụ. Pha động thường là hệ dung môi ( n butanol : axit acetic : nước
được pha theo tỷ lệ) . Nếu dung môi phân cực mạnh thì di chuyển
chậm hơn trên bản sắc ký và ngược lại.
+ Pha tĩnh: lớp silicagel, có khả năng hấp thụ tốt
- Bản chất của pha động và pha tĩnh ảnh hướng đến độ dịch chuyển của
chất cần phân tích. Nếu chất cần phân tích tương tác mạnh với pha
động thì được kéo ra sớm. Nếu chất cần phân tích tương tác mạnh với
pha tĩnh sẽ bị giữ lại.
- Hệ số dịch chuyển (Rf)

Rf = khoảng chạy của vệt mẫu

khoảng chạy của dung môi
II. Tiến hành thí nghiệm
1. Chuẩn bị
- Mẫu phân tích: + R: Rafinose
+ G: Glucose
+ H: hỗn hợp R và G
- Bản sắc ký mỏng kích thước 4 x 10cm (PTN chuẩn bị)
- Hệ dung môi (n butanol : axit acetic : nước) pha theo tỷ lệ ( PTN
chuẩn bị)
2. Chấm mẫu
- Đi găng tay, hạn chế chạm vào bề mặt phủ silicagel, cầm nhẹ hoặc
dùng nhíp kẹp một góc bản sắc ký
 - Dùng bút chì kẻ đường chấm mẫu ( cách mép dưới 1.5cm – 2cm),
đánh dấu vị trí 3 điểm chấm mẫu (cách đều nhau)
( Trái: Rafinose; Phải: Glucose ; Giữa: Hỗn hợp Rafinose và glucose)
- Lấy 10ul mẫu bằng ống mao quản thuỷ tinh hoặc đầu côn 10ul
- Chấm mẫu vào vị trí đã đanh dấu, đường kính vết loang ko vượt quá
0.5cm
3. Chạy sắc ký
- Đặt bản sắc ký đã chấm mẫu vào bình sắc ký có chứa dung môi hữu cơ
đã bão hoà hơi dung môi, mép dưới bản sắc kí được nhúng vào dung môi
sao cho không ngâm ngập mẫu trong dung môi, mặt chấm mẫu hướng
xuống phía dưới.
- Quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên
của bản sắc kí 1cm
- Lấy bản sắc kí ra, dùng bút chì đánh dấu vị trí của vệt dung môi
- Sấy khô bản sắc ký
4. Phát hiện mẫu
- Phun đều dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối lên bản sắc kí
(hoặc nhúng nhanh bản sắc kí vào khay đựng dung dịch hiện màu trên)
- Sấy khô bản sắc ký ở 110 độ C trong 5 phút (hoặc hơ bản mỏng trên
bếp điện), xuất hiện dần các vết màu
III. Kết quả thí nghiệm

Rafinose (R) Glucose (G) Hỗn hợp (R và G)

a 2.7 3.7 2.7 3.7
b 6.6 6.6 6.6 6.6
Rf = a/b 0.409 0.561 0.409 0.561

Trong đó: a là khoảng chạy của vệt mẫu (cm)

b là khoảng chạy của dung môi (cm)
Nhận xét:
 Rf nằm trong khoảng từ 0 đến 1
 Khoảng chạy của vệt mẫu Rafinose nhỏ hơn khoảng chạy của vệt mẫu
Glucose. Do Rafinose là hỗn hợp của đường (glucose, fructose, galactose),
có nhiều liên kết mạnh như (liên kết cộng hóa trị, liên kết hidro) nên bị giữ
lại lâu hơn, độ dịch chuyển sẽ chậm hơn so với glucose.
 Rf ≤ 0,2, vệt mẫu phân tích không bị kéo đi. Muốn tăng Rf thì cần tăng dung
môi không phân cực
 Rf ≥ 0.8, vệt mẫu phân tích kéo đi nhanh. Muốn giảm Rf thì cần giảm lượng
dung môi không phân cực

III. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả và khó khăn khi làm thực nghiệm

1. Một số yếu tố ảnh hưởng

- Tốc độ dung môi có ảnh hưởng đến Rf: dung môi chạy nhanh thì khả
năng tách tốt hơn.
- Nếu trong mẫu phân tích còn chứa các loại tạp chất sẽ ảnh hưởng đến
kết quả, vì vậy mẫu cần tinh khiết
- Bản sắc ký phải đồng đều tránh trường hợp dung môi không vượt qua
mà bị bám lại
- Bản sắc ký phải khô trước khi tiến hành TN vì silicagel có khả năng
hấp thụ tốt nên có thể gây sai số
- Ở mẫu H sau khi phân tách khó thấy được màu có thể do lượng mẫu
lấy quá ít nên các vệt màu xuất hiện mờ nhạt
- Trong quá trình làm các nhóm làm TN sau mở nắp, di chuyển bình sắc
ký. Điều này làm cho dung môi lệch, chạy lên tấm bản bị lệch

2. Một số khó khăn khi làm thí nghiệm

- Dùng Micropipet để lấy lượng mẫu rất nhỏ và chấm mẫu còn khó
khăn, có thể thay bằng ống mao quản nhỏ để thao tác dễ dàng hơn
- Khi chấm mẫu lên tấm bản mỏng thì nhận thấy tấm bản mỏng đồng
màu với chất cần phân tích nên khó để quan sát lượng mẫu xem đã
đúng vị trí hay chưa
- Để có thể phát hiện vệt đường có thể dùng buồng soi sắc ký sẽ tiện lợi
và cho kết quả chính xác cao nhưng chi phí khá cao.
- Phương pháp này chỉ áp dụng phân tích một lượng nhỏ mẫu