Föreläsning 3

Proteiner: källor, rening och karaktärisering

Ylva Ivarsson
Kemi – BMC
Ylva.ivarsson@kemi.uu.se
 Innehåll
• Proteinkällor

• Rening av proteiner

• Karaktärisering av proteiner
 Proteinrening
• Studier på, och användning av proteiner kräver att de
renas fram

Rening från ursprungskälla

• om det finns mycket av proteinet
• na3vt protein (med modifieringar)

Rekombinant u4ryck av proteiner

• mer protein, enklare & snabbare
• o;a modiferingar av proteiner för a>
underlä>a rening
• e3ska överväganden vad vi får producera och vad vi ska stoppa in det i
 Naturliga proteinkällor

Hasselnötter, rena fram protein för att testa allergier

LDH lab
Vi ska rena protein från grishjärta
 Rekombinant proteinuttryck
• Värdorganimser

E coli, råg(allergivänligt)

(Nästa föreläsning)
 Allmänt förfarande vid proteinrening
Djuruppfödning
Växtodling Proteinproduktion Cell odling
Se till att vi har protein i

Cell odling

Skörda celler/vävnad
Centrifugera etc.

Mekaniskt, ultrasonikering,
Lysering
Ta sönder cellerna för att späda ut i lösn
tryck, enzymer, kemikalier

Centrifugering/Extraktion

Anrikning & isolering av

önskade proteiner, Proteinrening
avlägsna orenheter
 Skörda och lösa upp proteiner
• Skörda bakterier/vävnad – centrifugering

• Tillsätt lämplig buffert:

som liknar det pH värdet som proteinet varit i innan

• Neutralt pH som liknar intracellulärmiljö

• Reduktionsmedel/antioxidant eftersom
intracellulärmiljö vanligen starkt reducerande (beta-
merkaptoetanol, DTT)
• Proteashämmare
Lösningen blir annars viskös

DNAse – för att bryta ner DNA. Viktigt vid rening från
E.coli
 Ta sönder cellerna
• Djurceller:
• Saknar yttre cellvägg, relativt lätta att ta sönder.

• Osmotisk chock
1. Buffert med högt osmotiskt tryck (15-25% sukros)
2. Svag buffert/vatten -> cellerna sprängs av inkommande
vatten
Bildas iskristaller som tar sönder cellerna.

• Frystining. Upprepade cykler. Cellerna skadas av

intracellulära iskristaller

• Homogenisering:
Mekanisk stress
 Ta sönder cellerna
• Bakterieceller
• Har yttre cellvägg -> svåra att
ta sönder

• I mindre labbskala
Gör inte för hårt, proteinet blir då varmt och kan denatuera, brukar ha proverna på is, slår sönder DNA

• Sonikering (ultraljud)
Nödvändigt att ta sönder DNA

• Lysozym behandling
• Högtryckspress (“French Ukrainian Journal of Ecology,2018, 8(1),671–679doi:10.15421/2018_26
press”)
• Detergentbehandling: Trition

• I större skala:
• Mekaniska metoder
• Homogenisatorer
• Kraftig omrörning/mixning
• Kulkvarn
 Avlägsna cellmembran och annat
olösligt material
• Centrifugering
Två centrifugeringssteg
Första: centrifugera mjukare
Andra: centrifugera hårdare och längre
Balansera noga

• Filtrering
För att få bort partiklar, pappersfilter i tratt
 Strategier för proteinrening

Egenskap Metod
Löslighet Salta in/ut
Jonladdning Jonbyteskromatografi Första labben

Molekylvikt Dialys
Gelfiltrering
Ultracentrifugering
Bindingsspecificitet Affinitetskromatografi andra labben
 Utfällning (salta in/salta ut)
• Ofta för proteiner som
renas från naturliga
källor som ett första
steg

• Salta in: ökar löslighet

Ammonium sulfat

dialys: som har en slang som har gelporer där

saltet går in och stannar, men proteinet åker

• Salta ut: fäller ut

- Dialys igenom, (störst går först)
- PD10 kolonn
- Centrifugera med filtreringsrör

• Ofta används (NH4) 2SO4 - Nödvändigt att avsalta innan

Billigt, enkelt att använda jonbyteskromatografi
- Ineffektivt vid låga koncentrationer
- Hög densitet på vätskan -> centrifugeringen
tar tid
 Gelfiltrering (Size exclusion chromatography)
Gelvolym måste vara mycket större än provvolymen
Häll inte på för mycket

• Störst går först

• Mycket stora
proteiner kommer I
dödvolymen (V0)
Vätskevolymen utanför= dödvolymen

• Mycket små
proteiner passerar
genom nästan hela
volymen (Vt)
Tar lång tid, gelen måste sedimentera, inga luftbubblor

• “Lagom” stora
proteiner eluerar
med Ve mellan V0
och Vt Beräkna molekylvikten

Kav=(Ve-V0)(Vt-V0)
 Eluering
• Isocratisk eluering: buffertförhållanden hålls konstant
under experimentet

From: http://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography
Ve och molekylstorlek

Molecular weight (logarithmic scale)

 Faktorer som påverkar
separationen
• Porstorlek på resinet
Gelerna har olika stora porer

• Flödeshastighet
Långsamt, för att inte förstöra gelen och inte förblanda proteinerna

• Prov/buffertvisokositet
• Hur mycket prov som laddas

Polyakrylamid eller Agaroskedjorna

dektrankedjor bildar bildar tjocka buntar -
separata kedjor > större porstorlek
 Analytisk gelfiltrering

• För att bestämma ett

proteins molekylvikt
MW

• Använder en
proteinstandard med
känd MW
Jonbyteskromatografi
 Inflytande av pI och buffert pH
Sänker pH värde:
Denatuera proteinet

+ +
- - - + - -
+ + H+ + - H+
+ + +

+ + - -
- - + -
+ - Ett pH värde över frö att vara säker
-
Ett pH värde under frö att vara säker

pH < pI pH = pI pH > pI
net charge: + net charge = 0 net charge: -
 Jonbyteskromatografi
• Den stationära fasen består av gel/resin med laddade grupper
• Anjonbytare: Binder negativa joner
Kvartenära (QAE, Q) aminogruppers eller diethyaminoethyl
(DEAE)

• Katjonbytarer: Binder positiva joner

Sulfopropyl (SP) grupper eller carboxymethyl (CM)
 Starka & svaga jonbytare
• Har inte med styrkan på interaktionerna

• Starka jonbytare (SP, Q, QAE) bibehåller laddning över

hela det användbara pH området

• Laddningen på svaga jonbytare är pH beroende

• CM tappar laddning över pH 3.5-4

• DEAE blir oladdad vid pH 9-10

 Elueringstrategier

• Öka jonstyrkan:
• Joner & proteiner tävlar om bindningsställen på gelen

• Ändra pH:
• Anjonbytare – sänk pH
• Katjonbytare - öka pH
• Påverkar laddning på proteinet
• Effektivare än att öka salthalten
• En varning: tänk på proteinets stabilitet vid högt/lågt pH värde

• Stegvis eluering
Först en buffer, sen en till eller ändra pH värdet
Manuellt

• Gradienteluering
Blandningskörl
 Jonbyteskromatografi med stegvis eluering
Page 134
 Affinitetskromatografi
Bindningsstyrka

• Bygger på bindingsaffinitet

Bioaffinitet –
biologisk
Affinitet för
interaktion
reningstagg

Antikropp - antigen
Receptor – ligand
Lectiner – glycoproteiner/socker
Enzym – hämmare/cofactor
 Affinitetskromatografi

Nästan vad som helst kan kopplas till gelkulor

Ligand i lösning och
ligand som sitter på
gelen (tävlig mellan
dem)
 Fusionsproteiner
Vit: protein av intresse

Se bild

• Fusionsproteiner som länkats till affinitetstagg på

genetisk väg

• Kan vara N- eller C-terminal, klyvbar eller inte

• Fördel: selektiv binding av protein till affinitetskolonn

• Nackdel: affinitetstaggen kan påverka proteinets funktion

Ofta använda reningstaggar
 IMAC - Immobilized metal ion
affinity chromatography
• Resinet kan chelatera olika metaller
som hexahistidin (His6) taggen binder
till

• Fördel: liten reningstagg, enkel rening

Imidazol används för

eluering
Tävlar för att interagera med nicklet
 Glutathione-S-transferas (GST) tag
• GST: Katalyserar reaktionen

h"ps://enzymefunc/on.org/about/groups/bridging-projects/gst-superfamily

• Klonat från schistosoma japonicum

 GST purification

Proteinet kan binda till glutation

Methods in Enzymology, Volume 559, 2015, Pages 127-139

Allmänt förfarande vid rening
Ta fram flödesschema, ta detta

Proteinkälla

Skörda celler/vävnad

mekaniskt, ultrasonikering,
Lysering tryck, enzymer, kemikalier

Centrifugering/ExtrakIon

Anrikning & isolering av

Proteinrening önskade proteiner,
avlägsna orenheter
 Hur rent, hur mycket, hur stabilit, hur
aktivt?
• Renhetsgrad
SDS PAGE

• Kvantitet
Kolorometrisk eller spektroskopisk konc. bestämning

• Har jag rätt protein?

Masspektrometri
Edmannedbrytning

• Hur stabilit är proteinet?

• Är proteinet funktionellt?
Enzymatisk aktivitet (MW föreläsning, labb 1)
Bindningsstudier (YI föreläsning, lab 2)
 SDS-PAGE
SDS bildar miceller som är negativt laddade

• PAGE - polyakrylamid
gelelektrofores

• För att studera massa

och renhet

• Laddat protein vandrar

i elektriskt fält, mot
anoden. Mindre
vandrar snabbare

• Gelen separerar efter

storlek
Analys av renhet och storlek

Rent protein med viss molekylvikt

Proteinkoncentration
absorbans vid 280 nm
 Lambert-Beer lag
• Varje protein har karaktäristisk extinktionskoefficient
• Kan beräknas om sekvensen är känd

transmission
[%] concentration
absorbance
[M]

Beräkna concentration
Mäter mha kyvett

intensity molar extinction path length

(incident and coefficient [cm]
transmitted) [M cm ]
-1 -1
 ProtParam
• ,,
Om mann inte renat proteinet blir det optiskt blint
 Bradford assay
• Generell, enkel, metod

• Coomassie Brilliant Blue, binder till Arg och Lys

• Vid lågt pH: Amax vid 470 och 650 nm

• Vid binding till protein: Amax vid 595 nm

h>p://www.mystrica.com/ApplicaGons/Bradford

• Används med standard med känd koncentration

 Masspektrometri (MS)
För att se fosforylering

• Analytisk metod som mäter kvoten mellan massa och laddning för laddade partiklar
• Kan användas för att bestämma identititet för ett protein
• Kan användas för att sekvensera peptider
• Kan identifera post-translationella modifieringar (dock ej glykosylering)

Method for Rapid Protein Identification in a Large Database, 2013, BMRI

 Edman nedbrytning
• Uppfanns av Pehr Edmann
• Fenylisotiocyanat reagerar med N-terminal aminogrupp

• Aminosyraderivatet separeras med kromatografi och man kan se vilken

aminosyra derivatet består av
• Proceduren upprepas för resten av kedjan
• Har automatiserats

• Begränsning: fungerar inte om den N-terminala kedjan är modifierad,

för 30-50 aminosyror
 Hur stabilt är mitt protein?
• Stabiliteten kan bestämmas genom att mäta hur stor del av
proteinmolekylerna som är veckade under det att man ändrar
förhållandena
TS

D N
[D]eq
Keq=
[N]eq D
ΔG
(kcal/mol)
N
Reaction coordinate

• Princip: Ett protein är antingen helt veckat (nativt, N)

eller helt oveckat (denaturat, D)
 Tillvägagångssätt för att
destabilisera proteiner
• Tillsatts av urea eller guanidiumklorid
- ökar entropin i systemet genom att störa icke-kovalenta
interaktioner (vätebindingar, van der Waals interaktioner &
hydropfoba effekter)
- Stör vätebindingar mellan vattenmolekyler

• Öka temperaturen
- ökar entropin. Bindningarna i proteinet (vätebindningar och
hydrofoba interaktioner) börjar vibrera och brister till slut

• Ändra pH värdet:
- förändrar sidokedjornas protonering (laddningar) vilket gör att
jonbindningar och vätebindningar upplöses
 Denaturering kan följas genom
förändring av tryptofanfluoresence

• Trp kan selektivt exciteras vid 295 nm

• Emissionen beror på omgivningen

Folded

unfolded
 Stabilitetsmätning genom
ureadenaturering
Stör jämvikten mellan nativt veckat protein (N) och oveckat (denaturerat
protein) genom att tillsätta urea. Bestäm fraktionen av veckat resp
oveckat protein.
[D]eq
Keq=
[N]eq

D N
Fluorescence (Rel. Units)

4 4
1 veckade
6,1
TS
2 2
DGD-N
2,1
0 0
0.5 8,0

-2 -2
D
4,0 ΔG
-4 (kcal/mol)
-4 uppveckade
N
0 0
0 2 4 6 8 10
0 8 2 6 4 4 6 28 10
0
Reaction coordinate

[urea] (M) [urea] (M)

 Nano -
Differential Scanning Fluorimetry (DSF)

• Dual-UV detektion (330 nm & 350 nm) mäter ändring i

Trp och Tyr fluorescens i kapilärsystem vid
temperaturförändring

Prometheus NT.48 Fördel: liten provåtgång (mindre än 10 micorliter)

 Nano -
Differential Scanning Fluorimetry
(DSF)
Går snabbare. Mäter stabiliteten

• Ändring i fluorescens vid 330 eller 350 nm (eller kvoten

mellan F350/F330) används för att bestämma
smälttemperaturen
 Läsanvisning

• Kapitel 3.1 + 3.8

• Kapitel 4