Practica 2

UdG Pràctiques Medicina – Introducció a l’estudi de la medicina: Homeòstasi i regulació
Departament de Biologia
PRÀCTICA
Medicina
Curs 2021-2022
Introducció a l’estudi de la medicina: Homeòstasi i regulació
1
Objectiu general:
Les pràctiques intenten reforçar alguns aspectes representatius de l'assignatura
presentats a teoria, incidint en qüestions tècniques i en la interpretació i anàlisi de
resultats.
Avaluació de les pràctiques:

3 % de la nota final del mòdul, equivalent a 1/10è de l’avaluació dels coneixements. Es
determinarà amb un examen d’1-3 preguntes curtes abans de començar la pràctica (1.5
% de la nota final per cada pràctica).
Es valorarà l’assistència, la participació, i el treball en grup.
A l'examen final de mòdul hi haurà preguntes sobre les pràctiques.
Material que haurà de portar l'alumne:

Bata i mascareta (imprescindible)
Guió de pràctiques
Llibreta de laboratori (opcional)
Retolador per vidre (opcional)
Ulleres de laboratori – indicat al guió per requeriment legal
El guió d’aquest curs s’ha dissenyat per a pràctiques de forma totalment

PRESENCIAL.
En el cas improbable que s’hagi de tornar a un entorn SEMI-PRESENCIAL, de manera
excepcional la pràctica durarà ~ 2 h. En tal cas, els estudiants de cada grup s’hauran
dividit en 2 subgrups de 10-11 estudiants cadascun. Per altra part, a la sessió caldrà
que es col·loquin deixant entre mig un espai a utilitzar per un estudiant de l’altre
subgrup.
En qualsevol cas, és molt important tenir en compte i complir amb les Indicacions per
a l’accés i estada als laboratoris descrites en el document sobre aquest curs tramès
als estudiants des de Deganat.
Sobretot, recordeu portar la bata de casa.
2
Pràctica 2A: PCR per la determinació del factor Rh de la sang
OBJECTIUS
1. Familiaritzar-se amb les tècniques de biologia molecular.
2. Veure una aplicació de la tècnica de la PCR en el laboratori i aprendre a
interpretar els resultats.
INTRODUCCIÓ
Els grups sanguinis

Els grups sanguinis són classificacions de la sang que depenen de la presència de
determinats antígens (proteïnes o carbohidrats) a la membrana de les cèl·lules
sanguínies, principalment dels eritròcits (glòbuls vermells). Hi ha diferents
classificacions, essent les clínicament més importants el sistema ABO i el factor Rh.
El factor Rh
El factor Rh (Rhesus) va ser descrit el 1940 en una espècie de mono de la Índia, el
macaco rhesus (Macaca mulatta). El factor Rh està determinat per unes proteïnes
integrals de membrana de les cèl·lules sanguínies. Aquestes proteïnes estan
codificades per gens molt homòlegs que donen lloc a diferents tipus d’antígens Rh: C,
D, i E. De tots ells, l’antigen RhD és el més immunogènic i és el que s’utilitza per a
determinar el factor Rh. Un 85% de la població presenta l’antigen RhD als eritròcits,
corresponent per tant al grup Rh positiu. En l’altre 15% de la població la proteïna RhD
està absent, essent així el grup Rh negatiu.
3
cromosoma 1p36.11
La determinació del factor Rh és de gran importància en les transfusions sanguínies,
ja que les persones Rh positives només poden donar sang a les també Rh positives. Si
una persona Rh negativa és exposada a cèl·lules sanguínies Rh positives, ràpidament
produeix anticossos que reaccionen contra l’antigen RhD, ja que és reconegut com a
estrany per l’organisme, i es genera una reacció de rebuig aguda que pot produir
l’hemòlisi de les cèl·lules de la sang. Per contra, les persones amb Rh negatiu poden
donar sang a tothom, tant Rh positiu com negatiu, ja que no presenten l’antigen RhD a
la membrana.
La determinació del genotip RhD és també de gran utilitat en el diagnòstic prenatal
d’una incompatibilitat Rh materno-fetal. Durant l’embaràs, un fetus Rh positiu pot
provocar en una mare Rh negativa la formació d’anticossos anti-RhD que poden causar
la malaltia hemolítica del nounat i fins i tot la mort fetal intrauterina.
4
La proteïna transmembrana RhD està codificada pel gen RHD, localitzat en el
cromosoma 1 dins de l’anomenat locus RH. En aquest locus també s’hi troba adjacent el
gen RHCE, altament homòleg al gen RHD, que codifica per altres antígens del sistema
Rh (C i E). El coneixement de la seqüència de nucleòtids dels gens RHD i RHCE ha
permès el desenvolupament de diferents mètodes per a la determinació del genotip
Rh(D).
En aquesta pràctica la determinació del genotip RhD es realitzarà mitjançant el
mètode descrit per Arce i col·laboradors (Blood 1993; 82: 651-655). Aquest mètode
es basa en l’amplificació simultània de dos fragments dels gens RHD i RHCE
mitjançant la tècnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction):
- Un fragment específic del gen RHD (de 600 parells de bases)  només està
present en les persones Rh(D) positives.
- Un altre fragment del gen RHCE (de 1200 parells de bases)  present tant en
persones Rh(D) positives com negatives.
El gen RHD és més curt que el gen RHCE degut a l’existència d’una deleció d’unes 600
pb. Aquesta diferència permet identificar clarament els individus portadors del gen
RHD fent una electroforesi del producte amplificat (veure les figures adjuntes).
5
6
Anàlisi electroforètic del producte amplificat per PCR:
D-D+D-
1200 bp
600 bp
La Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacció en cadena de la polimerasa ( Polymerase Chain Reaction o PCR ) és un tècnica
que permet obtenir de forma ràpida milions de còpies d’una determinada regió del
DNA. Mitjançant cicles repetits de desnaturalització i replicació, la PCR pot
amplificar una regió concreta del DNA pel seu posterior anàlisi o clonatge a partir
d’una mostra biològica molt petita: una gota de sang, un fol·licle capil·lar, gotes de
saliva, una cèl·lula, etc. Aquesta tècnica és molt utilitzada en medicina en el
diagnòstic de malalties genètiques i infeccioses, diagnòstic prenatal de malalties
hereditàries, tècniques forenses (identificació d’individus a partir d’una mostra
biològica), proves de paternitat i també en recerca científica.
7
En una PCR hi participen diferents components:
- La mostra de DNA que conté la regió que interessa amplificar. Aquest DNA
s’anomena DNA motllo, ja que proporciona la seqüència de bases nitrogenades que es
van amplificant durant el procés de PCR.
- 2 fragments curts de DNA de cadena senzilla (normalment, de 20 nucleòtids)
anomenats encebadors (en anglès, primers). Cada un d’aquests fragments de DNA és
complementari a una de les cadenes del DNA motllo en els extrems de la regió que
volem amplificar. Els encebadors s’hibriden amb seves les regions complementàries del
DNA motllo i funcionen com a punts d’iniciació per a la síntesi de les noves cadenes de
DNA.
- Desoxinucleòsids trifosfat (A, C, G, T); són els components bàsics per a la síntesi de
cadenes noves de DNA.
- Un enzim DNA polimerasa estable al calor; la més comú és la Thermus aquaticus
(Taq) polimerasa. Les DNA polimerases s’uneixen als extrems de l’encebador hibridat
al DNA motllo i enllacen els desoxinucleòsids per formar noves cadenes de DNA
complementàries al DNA motllo.

2+
- Ions magnesi (Mg ); son necessaris perquè la DNA polimerasa pugui realitzar la
seva activitat enzimàtica. S’afegeixen a la reacció en forma de MgCl2.
- Un tampó per mantenir un pH òptim per l’activitat de l’enzim DNA polimerasa.
La PCR es produeix mitjançant una sèrie de reaccions cícliques que es van repetint,
normalment, entre 30 i 40 vegades. Cada cicle de la PCR consta de 3 processos
seqüencials que es produeixen a diferents temperatures:
8
1) Desnaturalització: Consisteix en la
separació de les dues cadenes del DNA
motllo mitjançant l’escalfament a elevades
temperatures (94-95ºC). Cicle 1
2) Hibridació dels encebadors
(annealing): S’afegeixen els encebadors.
Cada encebador s’uneix a la seva seqüència
complementària a les cadenes senzilles del
DNA motllo. Per això és necessari que la Cicle 2

temperatura disminueixi (normalment, la
hibridació dels encebadors es produeix
entre els 45ºC i 65ºC), de manera que es
poden establir enllaços tipus ponts
d’hidrogen entre els encebadors i la
cadena de DNA motllo. Tot i que el DNA
del genoma humà conté bilions de parells Cicle 3
de bases, els encebadors només
necessiten segons per localitzar i
hibridar-se amb la seva seqüència
complementària.
3) Extensió de la cadena de DNA: En aquesta etapa la DNA polimerasa
sintetitza la cadena de DNA complementària al DNA motllo partint de l’encebador. La
temperatura augmenta fins a 72ºC (en el cas de la Taq Polimerasa), ja que és la
temperatura a la qual aquest enzim presenta el seu màxim d’activitat.
9
Un cop s’han completat tots els cicles, la PCR acaba amb una etapa de síntesi
addicional (72ºC) durant 5 minuts que permet que la DNA polimerasa completi
totalment la síntesi del nou DNA.
Cada vegada que es repeteix un d’aquests cicles es dobla el nombre de molècules de
DNA. Després de 25-40 cicles, s’han produït milions de còpies de DNA.
Els diferents cicles de la PCR es realitzen de forma automatitzada en un aparell
anomenat termociclador, que permet escalfar i refredar de forma molt ràpida els
tubs de reacció. El termociclador consta d’un bloc de resistència elèctrica que
distribueix una temperatura homogènia (amb un rang de 4-96ºC) a través d’una placa
on s’hi disposen els tubs de reacció. Tant la temperatura, el temps de reacció, així com
el nombre de cicles, es poden programar.
1
Per a confirmar que la PCR ha amplificat el fragment de DNA previst, es fa una
electroforesi (veure la INTRODUCCIÓ de la Pràctica 2B; pg. 15) en un gel d’agarosa
per a separar els fragments de DNA segons la seva mida, la qual és inversament
proporcional a la distància recorreguda. Al ser el DNA de càrrega negativa, per la
presencia dels grups fosfat, migrarà cap al pol positiu, o ànode. Per determinar la
longitud del producte de la PCR s’utilitza un marcador de pesos moleculars ( DNA
ladder), el qual conté fragments de DNA de mides conegudes i es fa córrer en
paral·lel a la mostra.
Si voleu ampliar la informació sobre la PCR, podeu accedir als següents
enllaços: https://dnalc.cshl.edu/view/15625-Polymerase-chain-reaction-
PCR-.html https://dnalc.cshl.edu/resources/3d/19-polymerase-chain-
reaction.html https://dnalc.cshl.edu/resources/animations/pcr.html
https://www.youtube.com/watch?v=JRAA4C2OPwg
1
MATERIAL I REACTIUS
- Microcentrífuga
- Micropipetes i puntes autoclavades (estèrils).
- Encebadors: Rh-D1: 5’- TGT TCG CAG CCT ATT TTG GG - 3’
Rh-D2: 5’- TGA CAC TTG GCC AGA ACA TC -3’
- Taq DNA polimerasa (Biotools)
- Tampó polimerasa i solució de MgCl2 (Biotools)
- Desoxinucleòsids trifosfat (dNTPs)
- Aigua bidestil·lada autoclavada
- Vòrtex
- Termociclador
- Electroforesi: Agarosa,
Tampó TBE (Tris-Borat-EDTA),
Cubeta d’electroforesi
Font d’alimentació
Marcador de pesos moleculars:

(Fermentas Gene Ruler 100 bp Plus DNA ladder)
- Tinció del DNA: SYBR® Safe.
- Tampó de càrrega per gels de DNA (6X)
1
U Pràctiques Medicina – Introducció a l’estudi de la medicina: Homeòstasi i
PROTOCOL
L’extracció de DNA genòmic a partir de sang de donants (punt 1, a continuació) ha

estat realitzada prèviament pels professors. A la pràctica es començarà directament
per la PCR (punt 2).
1) Extracció de DNA genòmic a partir de sang total:

El DNA genòmic s’extreu a partir d’una mostra de 200 l sang (recollida en un tub amb
EDTA com anticoagulant), emprant columnes QIAamp DNA Blood Mini Kit de
QIAGEN, on el DNA s’hi uneix específicament, evitant solvents orgànics.
2) PCR:
 En un tub Eppendorf de 0’2 ml convenientment identificat, preparar la barreja de
reactius per a la PCR (Volum final: 25 μl). – Mantenir els reactius en gel.
Reactiu – afegir en aquest ordre – Vol. per mostra Concentració Final

- H2O bidestil·lada......................................................................15,5 μl
- Tampó: Taq DNA Polimerasa buffer 10x ........................... 2,50 μl........................x
- Mg Cl2 (50 mM) ........................................................................ 1 μl.............................2 mM
- dNTPs (10 mM) ......................................................................... 0,5 μl.........................0,2 mM
- Primer D1 (12,5 µM) ................................................................ 1 μl.............................0,5 µM
- Primer D2 (12,5 µM) ............................................................... 1 μl.............................0,5 µM
- DNA Taq polimerasa (1U/µl)**...............................................1 μl
**Abans d’afegir la Taq DNA Polimerasa (que es troba conservada a -20ºC), fer una
centrifugada curta de la barreja amb la microcentrífuga.
A continuació, afegir a la barreja 2,5 µl de DNA de la mostra que correspongui (Rh

negatiu o Rh positiu) – pipetejar amunt i avall suaument.
 Termociclador:
Programar el termociclador amb les condicions d’amplificació:
1) 1 cicle 94ºC - 3 minuts desnaturalització

2) 30 cicles: 94ºC - 20 segons “
64ºC - 20 segons annealing
72ºC - 1 minut síntesi de DNA
3) 1 cicle 72ºC - 5 minuts “
4) constant 4ºC refredament
- 13
3) Anàlisi dels productes d’amplificació mitjançant electroforesi.
 Preparació d’un gel d’agarosa al 1.5% (fer-ho per duplicat):
Mesurar 50 ml de tampó TBE amb una proveta i transferir-lo a un erlenmeyer. Afegir-

hi 0,75 g d’agarosa. Barrejar i escalfar al microones fins a l’ebullició. Deixar refredar
(amb aigua corrent i/o en gel). A continuació, afegir-hi 7 µL del colorant SYBR® Safe.
Precintar el suport d’electroforesi. Col·locar la pinta a un extrem. Afegir-hi l’agarosa

dissolta i deixar solidificar.
Un cop el gel ha solidificat, treure la pinta i col·locar-lo amb el suport dins de la

cubeta d’electroforesi. Afegir-hi tampó TBE de manera que el gel quedi cobert. Els
pous formats per la pinta han de quedar al pol ( – ).
Tampó
Gel
Suport pel Cubeta
 Carregar les mostres al gel:
Primer cal afegir el tampó de càrrega 6x a la mostra: Als 25 µl de producte de la PCR,

afegir-hi 5 µl de tampó de càrrega 6x. Barrejar pujant i baixant el líquid amb la pipeta.
Transferir les mostres al gel agarosa:

Al primer pou s’hi carrega 5 µl de marcador de pesos moleculars i a continuació les
diferents mostres (vol. total: 30 µl).
- 14
 Electroforesi:
Connectar el gel a la font de corrent i deixar córrer durant 30 minuts a 100 Volts.
+
 Observació dels gels:
En un transil·luminador de llum UV observar la intensitat de les bandes i obtenir una
fotografia del gel.
4) Interpretació dels resultat:
Pren una imatge o fes un esquema del teu gel.
Quin pes molecular tenen les bandes que hi apareixen?
Segons els resultats del gel, quin seria el factor Rh de la teva mostra? Com ho has
deduït?
1
Pràctica 2B: Proteïnograma: Fraccionament electroforètic de

les proteïnes del sèrum.
OBJECTIUS
1. Aprendre els conceptes d’electroforesi i proteïnograma.
2. Introduir en l’anàlisi electroforètic de les proteïnes del sèrum i en la
interpretació dels resultats.
INTRODUCCIÓ
El sèrum és la porció líquida de la sang. No conté cèl·lules sanguínies, però si moltes

proteïnes, que tenen diferents funcions: manteniment del pH sanguini, transport de
molècules, equilibri osmòtic, defensa en front d’infeccions, regulació, etc.
Les proteïnes estan integrades per aminoàcids que tenen grups ionitzables,
principalment grups carboxil (càrrega negativa) o grups amino (càrrega positiva),
però també altres grups funcionals de les cadenes laterals. Quan les proteïnes es
troben en solució estan ionitzades i, per tant, tenen càrrega elèctrica. El grau
d’ionitzacions dependrà del pH del medi i de les constants d'ionització específiques
dels grups funcionals de la proteïna.
+ -
El punt isoelèctric de la proteïna és el pH en el qual les càrregues negatives i

positives estan presents en quantitats iguals i, per tant, la càrrega neta de la
proteïna és nul·la. Al baixar el pH per sota del seu punt isoelèctric (pH àcid), la
proteïna queda carregada positivament, mentre que al pujar-lo per sobre del punt
isoelèctric (pH bàsic), queda carregada negativament. Això és degut,
+
respectivament, al guany o pèrdua neta de protons (H ).
- 16
Les proteïnes del sèrum poden separar-se mitjançant una electroforesi.

L’electroforesi consisteix en la separació de molècules carregades per aplicació d’un
camp elèctric, de tal manera que cada molècula carregada es desplaça cap a
l’elèctrode amb càrrega oposada. La mobilitat electroforètica d’una molècula depèn
directament de la seva càrrega i inversament de la seva mida. També depèn del pH
del medi, ja que aquest determina la càrrega neta de les molècules.
A Bioquímica s’utilitzen majoritàriament tècniques d’electroforesi zonal, en les que

el camp elèctric s’aplica a un suport on es diposita la mostra amb les molècules a
separar (són molècules amb grups ionitzables: aminoàcids, pèptids, proteïnes, àcids
nucleics, etc.). El suport està en contacte amb el tampó d’electroforesi, que
consisteix en una solució d’ions que transmet la càrrega elèctrica a un pH adequat.
Els principals suports per l’electroforesi zonal són el paper de filtre, les membranes
d’acetat de cel·lulosa, i els gels d’agarosa, midó, i poliacrilamida. Per separar les
proteïnes del sèrum per electroforesi s’utilitzen habitualment les membranes
d’acetat de cel·lulosa, ja que: 1- són de fàcil manipulació,
2- permetent fer una separació ràpida de proteïnes en bandes ben definides partint
d’un volum molt petit de mostra.
3- A més, permeten tenyir específicament les proteïnes (l’acetat de cel·lulosa es
pot fer transparent)
4- i poden dissoldre’s, el que fa possible recuperar les proteïnes un cop separades.
Els punts isoelèctrics de les proteïnes del sèrum varien entre 4,7 (albúmina) i 7,3
(- globulines). A pH 7,35 (pH del sèrum sanguini), i a valors de pH més elevats, les
proteïnes del sèrum estan presents com anions (carregades negativament), per la
qual cosa totes migren en la mateixa direcció (cap al pol positiu, o ànode).
S’acostuma a examinar els sèrums en una solució amortidora de pH 8,6, amb la qual
totes les proteïnes estaran carregades negativament, si bé ho estaran més aquelles
que tinguin un punt isoelèctric més distant del pH de l'amortidor, essent les que
migraran més ràpidament, en particular, l’albúmina.
Després de l’electroforesi, les proteïnes del sèrum es separen en 5 fraccions

proteiques diferents: albúmina i globulines 1, 2,  i  (en ordre decreixent de
mobilitat), originant un perfil electroforètic, o proteïnograma. En la figura següent
es mostra el proteïnograma del sèrum. Cada pic o fracció proteica inclou un grup de
proteïnes sèriques amb una velocitat de migració similar. L’alçada i gruix dels pics,
és a dir, l’àrea, és proporcional a la concentració de les proteïnes (a major àrea,
major concentració).
- 17
migració
+ Ànode Càtode -
A la següent taula es representa els rangs de percentatges de cada fracció

respecte al total amb les principals proteïnes que les composen:
Fracció Percentatge Principals proteïnes que la integren

albúmina 54,7-68,7% albúmina, pre-albúmina
1-globulines 3,7-7,8% 1-glicoproteïna àcida, 1-antitripsina, 1-fetoproteïna
2-globulines 5,2-10,7% 2-macroglobulina, ceruloplasmina, haptoglobina
-globulines 8,6-13,7% transferrina, fibronectina, complement (C3, C4)
-globulines 10,7-19,3% immunoglobulines: IgG, IgA, IgD, IgE, IgM
L’anàlisi electroforètic de les proteïnes del sèrum s’utilitza habitualment en el

diagnòstic mèdic. La presència de patrons electroforètics anòmals indica
alteracions en concentració de les proteïnes sèriques i es pot associar a
patologies:
- Una disminució en la fracció d’albúmina sol indicar una hipoproteïnèmia. Pot
estar associada a diferents patologies, com alteracions hepàtiques i malnutrició.
- Les proteïnes que constitueixen les fraccions 1 i 2 es troben
incrementades quan hi ha una lesió activa en un teixit (reacció de fase aguda).
Així, s’observa un increment d’aquestes fraccions en processos inflamatoris o
d’estrès als teixits com a conseqüència d’infeccions, traumatismes, en
postoperatoris, infarts, necrosis, o en malalties autoimmunitàries.
- La fracció de -globulines té un increment moderat en cirrosis hepàtiques,
inflamació crònica, i síndrome nefròtic.
- Les -globulines o immunoglobulines augmenten en episodis d’infecció aguda
o crònica, en malalties autoimmunitàries – en especial en artritis reumàtica i lupus
eritematós – i en malalties hepàtiques cròniques (cirrosis). Un increment
d’immunoglobulines també es pot associar a una malaltia hematològica (leucèmies,
limfomes, i mielomes). Una disminució d’immunoglobulines (hipogammaglobulinèmia)
sol indicar trastorns hereditaris en la síntesi d’immunoglobulines.
En la següent figura es mostren exemples de proteïnogrames observats en
- 18
individus sans i en pacients amb concentracions anormals de proteïnes sèriques:
- 19
e) Cirrosi hepàtica
a)
Patró normal
b) Reacció de fase aguda f) Mieloma
c) Infecció crònica g) Síndrome nefròtic
d) Hipogammaglobulinèmia h) Enteropatia amb

pèrdua de proteïnes
Esquema de l’anàlisi de proteïnes sèriques per electroforesi en acetat de cel·lulosa.
- 20
Punt Aplicació Avanç

Preparació:
Electroforesi Tinció
Aplicació de la mostra de sèrum
Perfil Electroforètic (Proteinograma)
Tira d’acetat de cel·lulosa impregnada Totes les proteïnes adquireixen amb els extrems submergits en el tampó càrrega negativa i avancen cap a
Distància avançada
major càrrega negativa
menor punt isoelèctric
MATERIALS I REACTIUS
- Cubeta d'electroforesi amb alimentador.

- Densitòmetre automàtic.
- Tires perforades d’Acetat de Cel·lulosa.
- Aplicador AP4
- Cubetes Tinció
- Pinces
- Estufa
- Sèrums problema
- Solució Amortidora (Simacel “N”)
- Solució del colorant vermell: Ponceau S al 5%
- Solució decolorant: àcid acètic al 5%
- Solució decolorant transparentadora
PROTOCOL:
1. Preparació de la tira
 Introduir la solució amortidora dins la cambra electroforètica, omplint un dels
costats fins al límit superior. Submergir la tira d'acetat de cel·lulosa en la solució
amortidora durant uns 5-10 min amb l’ajuda d’unes pinces o amb les mans
- 21
protegides
- 22
amb guants. Aquesta immersió facilitarà el pas del corrent a través de les tires.
Eliminar l’excés de l’amortidor assecant la tira entre dos fulls de paper de filtre.
**Molt important: Mai es pot tocar la zona central de la tira d’acetat de cel·lulosa.
 Fer una petita marca a l’extrem dret de la tira d’acetat de cel·lulosa i

col·locar- la sobre el pont de la cambra – amb la cara mate cap amunt – encaixant-
la primer sobre la part mòbil del suport i després sobre la part fixa. La tira ha de
quedar plana i ben estirada.
2. Aplicació del sèrum

 Aplicar 13 µl de sèrum a l’espai corresponent del suport de mostres (mòdul
d’aplicació). Esperar 5 minuts. Llavors, amb l’aplicador, transferir les mostres a la
tira d’acetat de cel·lulosa (properes al pol negatiu). Deixar absorbir la mostra
durant 10 segons.
 Repartir la solució amortidora entre els dos costats de la cubeta. Introduir el

pont a la cambra electroforètica. La tira ha de quedar submergida pels dos
extrems en la solució amortidora. Tapar la cubeta i connectar-la al corrent
elèctric (la cambra ja porta la font de corrent incorporada). Es genera un voltatge
de 200 V.
3. Electroforesi:
 Fer córrer l’electroforesi durant 30 minuts.
4. Revelat:
 Tinció: Es treuen les tires i s’introdueixen en el bany amb el colorant vermell
Ponceau S durant 5 minuts, en agitació suau.
 Destinció: Transferir les tires en un bany de solució decolorant (àcid acètic al

5%) fins eliminar l’excés de colorant per agitació.
 Transparentació: Deixar les tires en la solució decolorant transparentadora

durant 5 minuts. Després, treure les tires eliminant l’excés de solució i col·locar-
les sobre un suport de vidre, vigilant que no quedin bombolles. Aquí, cal assegurar-
se de situar l’albúmina (banda més gruixuda) a ~ 1 cm de l’extrem, atès que ha
d’anar alineada al “0” en el densitòmetre. Retallar els extrems de la tira que
sobresurtin. Assecar-la totalment a l’estufa (20-30 minuts).
 Les tires ja estan llestes per a ser llegides en el densitòmetre.
- 23
5. Interpretació dels resultats:

 Comparar el proteïnograma obtingut amb el proteïnogrames corresponent a un
sèrum sa (veure la pàg. 17).
- Detectes alguna anomalia? Quina?
- Pots associar-la a alguna de les patologies que hem descrit?
- 24

Practica 2

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Practica 2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UdG Pràctiques Medicina – Introducció a l’estudi de la medicina: Homeòstasi i regulació

Introducció a l’estudi de la medicina: Homeòstasi i regulació

Avaluació de les pràctiques:

Es valorarà l’assistència, la participació, i el treball en grup.

A l'examen final de mòdul hi haurà preguntes sobre les pràctiques.

Material que haurà de portar l'alumne:

El guió d’aquest curs s’ha dissenyat per a pràctiques de forma totalment

Sobretot, recordeu portar la bata de casa.

Pràctica 2A: PCR per la determinació del factor Rh de la sang

1. Familiaritzar-se amb les tècniques de biologia molecular.

2. Veure una aplicació de la tècnica de la PCR en el laboratori i aprendre a

interpretar els resultats.

Els grups sanguinis

determinats antígens (proteïnes o carbohidrats) a la membrana de les cèl·lules

sanguínies, principalment dels eritròcits (glòbuls vermells). Hi ha diferents

integrals de membrana de les cèl·lules sanguínies. Aquestes proteïnes estan

D, i E. De tots ells, l’antigen RhD és el més immunogènic i és el que s’utilitza per a

està absent, essent així el grup Rh negatiu.

La determinació del factor Rh és de gran importància en les transfusions sanguínies,

una persona Rh negativa és exposada a cèl·lules sanguínies Rh positives, ràpidament

La determinació del genotip RhD és també de gran utilitat en el diagnòstic prenatal

d’una incompatibilitat Rh materno-fetal. Durant l’embaràs, un fetus Rh positiu pot

la malaltia hemolítica del nounat i fins i tot la mort fetal intrauterina.

La proteïna transmembrana RhD està codificada pel gen RHD, localitzat en el

Rh (C i E). El coneixement de la seqüència de nucleòtids dels gens RHD i RHCE ha

permès el desenvolupament de diferents mètodes per a la determinació del genotip

En aquesta pràctica la determinació del genotip RhD es realitzarà mitjançant el

es basa en l’amplificació simultània de dos fragments dels gens RHD i RHCE

mitjançant la tècnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction):

present en les persones Rh(D) positives.

persones Rh(D) positives com negatives.

Anàlisi electroforètic del producte amplificat per PCR:

La Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)

DNA. Mitjançant cicles repetits de desnaturalització i replicació, la PCR pot

saliva, una cèl·lula, etc. Aquesta tècnica és molt utilitzada en medicina en el

diagnòstic de malalties genètiques i infeccioses, diagnòstic prenatal de malalties

hereditàries, tècniques forenses (identificació d’individus a partir d’una mostra

biològica), proves de paternitat i també en recerca científica.

En una PCR hi participen diferents components:

s’anomena DNA motllo, ja que proporciona la seqüència de bases nitrogenades que es

van amplificant durant el procés de PCR.

- 2 fragments curts de DNA de cadena senzilla (normalment, de 20 nucleòtids)

anomenats encebadors (en anglès, primers). Cada un d’aquests fragments de DNA és

cadenes noves de DNA.

- Un enzim DNA polimerasa estable al calor; la més comú és la Thermus aquaticus

complementàries al DNA motllo.

seva activitat enzimàtica. S’afegeixen a la reacció en forma de MgCl2.

- Un tampó per mantenir un pH òptim per l’activitat de l’enzim DNA polimerasa.

normalment, entre 30 i 40 vegades. Cada cicle de la PCR consta de 3 processos

seqüencials que es produeixen a diferents temperatures:

separació de les dues cadenes del DNA

motllo mitjançant l’escalfament a elevades

temperatures (94-95ºC). Cicle 1

2) Hibridació dels encebadors

(annealing): S’afegeixen els encebadors.

Cada encebador s’uneix a la seva seqüència

complementària a les cadenes senzilles del

DNA motllo. Per això és necessari que la Cicle 2

hibridació dels encebadors es produeix

entre els 45ºC i 65ºC), de manera que es

poden establir enllaços tipus ponts

d’hidrogen entre els encebadors i la

cadena de DNA motllo. Tot i que el DNA