Badanie molekularnych

interakcji pasożyt-żywiciel
i mechanizmów
lekooporności w przebiegu
inwazji Schistosoma sp
Rafał Janczurewicz, Oliwia Kielak
Schistosoma sp
Przywra krwi
Główne gatunki:
S. mansoni,
S. japonicum
S. heamatobium
Żywcielem pośrednim jest wodny ślimak, natomiast ostatecznym kręgowiec np. człowiek
choroba którą wywołuje Schistosoma, czyli schistosomoza jest Po malarii i robaczycach
jelitowych trzecią w kolejności chorobą pasożytniczą siejącą największe spustoszenie na
świecie i pozostającą jedną z głównych przyczyn zgonów w krajach rozwijających się
Afryki, Ameryki Południowej, Karaibów, Bliskiego Wschodu i Azji.
 Zapłodnione samice przywr składają jaja w naczyniach
krwionośnych żywiciela ostatecznego. Jaja migrują przez tkanki
do światła jelita. Wraz z fekaliami dostają się do środowiska
wodnego. Z jaj wylęgają się miracidia, które wnikają do
organizmu żywiciela pośredniego – słodkowodnego ślimaka z
rodzaju Biomphalaria. Tam ulegają przekształceniu w kolejne
stadia rozwojowe. Kolejne stadium rozwojowe stanowią
ruchliwe cerkarie powstające w wyniku rozmnażania
bezpłciowego w gruczole wątrobowym ślimaka. Opuszczają one
ciało ślimaka w poszukiwaniu żywiciela ostatecznego –
kręgowca.. Wychodzenie cerkarii z ciała ślimaka odbywa się
według określonego rytmu, który rozpoczyna się rano, osiąga
maksimum około południa, a kończy wieczorem. Uwolnione ze
ślimaka cerkarie dostają się do organizmu żywiciela ostatecznego
poprzez penetrację skóry, wędrują przez naczynia krwionośne do
serca, płuc, z powrotem do serca, a następnie do układu
wrotnego wątroby, w którym dojrzewają i stają się dorosłymi
osobnikami. Dojrzałe przywry łączą się w pary, kopulują i
wędrują do żył krezkowych, gdzie składają jaja.
Żywiciele
ostateczni pośredni
S. japonicum - różne zwierzęta, takie ślimaki z rodzajów:
jak bydło, psy, koty, gryzonie, świnie, Biomphalaria, (S.
mansoni),
konie i kozy Oncomelania (S.
S. mekongi - psy japonicum),
S. mansoni jest często wykrywany u Bulinus (S. haematobium,
dzikich naczelnych na obszarach S. intercalatum, S.
guineensis)
endemicznych, ale jest uważany
przede wszystkim za pasożyta
człowieka.

Biomphalaria glabrata
Występowanie:
Schistosoma mansoni występuje
głównie w Afryce
Subsaharyjskiej i niektórych
krajach Ameryki Południowej
(Brazylia, Wenezuela, Surinam)
oraz na Karaibach
S. japonicum występuje w
Chinach, na Filipinach i
Sulawesi.
S. haematobium występuje w
Afryce i w niektórych rejonach
Bliskiego Wschodu.
Obszary, na których spotyka się zachorowania na schistosomatozę, 2010
Hipoteza: Zmiany epigentyczne są istotnym
krokiem w adaptacji pasożytów z rodzaju
Schistosoma do zasiedlania nowych
żywicieli.
 Wprowadzenie do artykułu

Określone szczepy S. mansoni mogą skutecznie zarażać tylko niektóre szczepy

Biomphalaria glabrata (szczepy kompatybilne)
Specyficzne dla szczepu różnice w transkrypcji konserwatywnej rodziny
polimorficznych mucyn (SmPoMucs) są głównymi czynnikami determinującymi
tę zgodność
Zbadano podstawy kontroli ekspresji SmPoMuc, które ewoluowały w celu
unikania zróżnicowanych cząsteczek rozpoznających antygeny u Biomphalaria
glabrata
 Wprowadzenie do artykułu
Kompatybilność
Występuje w układzie pasożyt-żywiciel, gdy
gatunek pasożyta jest zdolny do zarażania i
przenoszenia się przez gatunek żywiciela.
Zjawisko polegające na tym, że niektóre
szczepy pasożytów są kompatybilne z
pewnymi szczepami żywicieli, ale nie z innymi
(i odwrotnie) nazywane jest polimorfizmem
kompatybilności.
Molekularne mechanizmy leżące u podstaw
polimorfizmu zgodności pomiędzy S.
mansoni i Biomphalaria glabrata zostały
zbadane poprzez porównanie proteomów
dwóch szczepów laboratoryjnych
S. mansoni: jednego szczepu zgodnego
(szczep C) i jednego niezgodnego (szczep IC)
z tym samym referencyjnym szczepem
Biomphalaria glabrata z Brazyli.
 Materiały i metody

Hodowla S. mansoni
W badaniach wykorzystano szczep zgodny
(C) (szczep brazylijski), szczep niezgodny
(IC) (szczep gwadelupski), referencyjny
szczep NMRI S. mansoni (szczep
portorykański) oraz referencyjny szczep
mięczaka (B. glabrata BRE, pochodzący z
Brazyli).
 Materiały i metody
Wytwarzanie hybryd szczepów i Western blot
Ślimaki B. glabrata zakażano miracidium w celu uzyskania
klonalnych populacji cerkarii.
Mieszańce szczepowe S. mansoni wytwarzano poprzez zakażenie
myszy 300 cerkariami: 200 samców z klonalnej populacji
cerkarialnej połączonych ze 100 samicami z innej klonalnej
populacji cerkarialnej.
Jaja zostały pozyskane od zakażonych myszy 12 tygodni po
zakażeniu
 Materiały i metody
Wytwarzanie hybryd szczepów i Western blot
Miracidia inkubowano w 350 ml buforu UTCD dwie godziny w temperaturze
pokojowej.
Białka (5 mg na próbkę) rozdzielono za pomocą 10% elektroforezy w żelu SDS-PAGE,
a następnie blotowano na membranie nitrocelulozowej. Membrana była blokowana
5% beztłuszczowym suchym mlekiem w TBST i inkubowana z pierwotnym
przeciwciałem ''anty SmPoMuc''
Następnie membranę inkubowano z przeciwciałem wtórnym (sprzężone z
peroksydazą, oczyszczone anty królicze IgG)
Detekcję przeprowadzano przy użyciu odczynników ECL i systemu obrazowania
ChemiDoc MP - BioRad
 Materiały i metody
Badanie zmienności sekwencji regionów promotorowych genów
SmPoMuc pomiędzy szczepami
Annotacja sekwencji i przewidywanie promotora:
Promotor zawierający TATA-box i TSS został przewidziany przy użyciu Neural
Network Promoter Prediction Tool
Elementy repetytywne w sekwencjach regionu promotorowego zidentyfikowaliśmy
przy użyciu oprogramowania CENSOR
Do poszukiwania duplikacji, rekombinacji i konwergencji genów wykorzystano
programy RDP3
Sekwencje promotorowe SmPoMuc anotowano przy użyciu programu CLC Sequence
Viewer v6.5.1
 Materiały i metody
Zastosowanie trichostatyny-A (TSA)

TSA była rozpuszczana w etanolu do stężenia 20 mM i dodawana do puli 1000

miracidiów IC i C w stężeniach 20 mM i 200 mM w ciągu 4 h.
Wcześniej wykazano wpływ TSA w tych stężeniach na rozwój, morfologię,
ruchliwość i ekspresję genów bez cytotoksyczności dla larw.
Miracidia były następnie odwirowywane przy 12 000 g w ciągu 5 min i zawieszane
w 100 ml buforu lizującego.
Wyizolowano mRNA w celu przeprowadzenia syntezy cDNA.
Zaprojektowano specyficzne startery oraz przeprowadzono qPCR
Zidentyfikowano polimorficzną rodzinę genów kodującą białka SmPoMucs
jako kluczowe markery zgodności pasożyt-żwyciel.

Białka SmPoMuc są wysoce polimorficzne i oddziałują z białkami fibrynogenu

(FREPs) mięczaka. FREPS są zróżnicowanymi cząsteczkami rozpoznającymi
antygen, odgrywającymi centralną rolę we wtórnej odpowiedzi
immunologicznej.

Niezwykły poziom polimorfizmu SmPoMuc jest generowany przez złożoną

kaskadę mechanizmów - "kontrolowany chaos", działających na poziomie
transkrypcyjnym, translacyjnym i posttranslacyjnym.

Każde pojedyncze miracidium (larwa infekująca mięczaka) wykazuje ekspresję

specyficznego podzbioru genów SmPoMuc.
 Wyniki badań
Transkrypcja genów SmPoMuc jest różna w szczepach IC i C S. mansoni.

Ekspresja SmPoMuc w każdej z grup w

szczepach C i IC.

mRNA ekstrahowano z miracidiów ze

szczepów IC (czarne paski) i C (szare
paski przerywane) i wykonywano qPCR.

Wyniki przedstawiają średnią wartość z

3 powtórzeń biologicznych.
 Wyniki badań
Stwierdzono niski poziom zróżnicowania nukleotydów w obrębie sekwencji
promotorowych w szczepach IC i C

Różnice w ekspresji SmPoMuc w szczepach C i IC mogą wynikać z różnic nukleotydowych w

regionach promotorowych genów.

Zsekwencjonowanie 1,4 kb regionu promotora SmPoMuc ujawniło bardzo małą liczbę alleli i
genotypów - jeden genotyp w szczepie IC i 3 genotypy w szczepie C.

W szczepie C zmienność sekwencji była minimalna, a trzy allele różniły się od siebie tylko jedną
parą zasad.

Allel szczepu IC grupy promotora SmPoMuc różnił się od trzech alleli szczepu C o 4 do 5 par
zasad, co stanowi rozbieżność sekwencji od 0,29 do 0,36%.
 Wyniki badań
Stwierdzono niski poziom zróżnicowania nukleotydów w obrębie sekwencji
promotorowych w szczepach IC i C
 Wyniki badań
Inhibitory HDAC mają wpływ na transkrypcję SmPoMuc

Różnica w fenotypie transkrypcji SmPoMuc nie może zostać wyjaśniona przez różnice
genetyczne w regionie promotora, dlatego zbadano przypuszczalny wpływ mechanizmów
epigenetycznych.

Wcześniejsze badania wykazały, że modyfikacje histonów są wyraźnie zaangażowane w

mechanizmy epigenetyczne u S. mansoni.

Próbowano wpłynąć na epigenotyp i fenotyp używając trichostatyny-A (TSA), która jest

specyficznym i odwracalnym inhibitorem deacetylaz histonów klasy I i II (HDAC).
 Wyniki badań
Inhibitory HDAC mają wpływ na transkrypcję SmPoMuc

Wpływ traktowania TSA (trichostatyna A) na transkrypcję genów SmPoMuc zarówno dla

szczepu C jak i IC testowano na miracidiach, które eksponowane były na działanie leku przez
4h.

Zaobserwowano statystycznie istotny wzrost transkrypcji po użyciu TSA tylko w szczepie IC

(p-value = 0,05). Wskazuje to, że zmiany w acetylacji histonów korelują ze zwiększoną
ekspresją SmPoMuc w szczepie IC i nie mają wpływu na ekspresję w szczepie C.
 Wnioski

Wpływ traktowania TSA (trichostatyna A) na transkrypcję genów SmPoMuc zarówno

dla szczepu C jak i IC testowano na miracidiach, które eksponowane były na działanie
leku przez 4h.

Zaobserwowaliśmy statystycznie istotny wzrost transkrypcji po użyciu TSA tylko w

szczepie IC (p-value = 0,05). Wskazuje to, że zmiany w acetylacji histonów korelują ze
zwiększoną ekspresją SmPoMuc w szczepie IC i nie mają wpływu na ekspresję w
szczepie C.
Hipoteza: Identyfikacja białek przypuszczalnie związanych z
opornością na PZQ u S. mansoni może pozwolić na opracowanie
testu diagnostycznego pozwalającego na odróżnienie pacjentów
będących nosicielami szczepów opornych na PZQ.
 Wprowadzenie do artykułu

Zwalczanie schistosomatozy opiera się na leczeniu chemioterapeutycznym z

użyciem prazikwantelu (PZQ)
PZQ ma zastosowanie w zwalczaniu jedynie dorosłych form pasożyta
występuje zjawisko lekooporności S. masoni i S. japonicum na PZQ
CEL: zrozumienie rozwoju oporności S. mansoni na PZQ poprzez porównanie
proteomu szczepu trwale opornego na PZQ wraz ze szczepem podatnym
 Materiały i metody
Pozyskanie szczepu opornego na działanie PZQ oraz zarażenie
Szczep oporny (RS) S. mansoni wyselekcjonowany z podatnego
szczepu (SS) poprzez stopniowe podawanie dawek leku
Model zwierzęcy: samce myszy - dobry żywiciel proces zarażenie
podobny jak u ludzi
Zarażenie myszy odbyło się na drodze naturalnej, ekspozycja
ogonów myszy na na około 100 cerkalii
8-10 tygodniowe pasożyty zebrano oraz przeniesiono do płytek
hodowlanych
 Materiały i metody
Ekspozycja na lek
Użyto po 5 dorosłych pasożytów w każdej grupie badawczej:
samiec wrażliwy na PZQ (SM)
samica wrażliwa na PZQ (SF)
samiec odporny na PZQ (RM)
samica odporna na PZQ (RF)
pasożyty zostały poddane działaniu PZQ - dawka 3,0 x 10 ^-5 mol/L;
czas trwania ekspozycji - 24h
grupa kontrolna - hodowla bez dodatku PZQ
 Materiały i metody
Przygotowanie ekstraktów białkowych
liza i homogenizacja pasożytów w Trizolu
rozdzielenie z użyciem chloroformu
izolacja białek
stężenie białka zbadano metodą Bradforda, a jakość ekstraktu
zweryfikowano metodą SDS-PAGE w 12% żelu
 Materiały i metody
Elektroforeza dwukierunkowa
2-DE prowadzono w trzech powtórzeniach dla każdej z 8 prób
badawczych
przygotowanie próbek:
białko rozcieńczono w roztworze rehydratacyjnym (mocznik,
tiomocznik, CHAPS, bufor IPG, DTT i błękit bromofenolowy)
rozdzielenie białek metodą ogniskowania izoelektrycznego
(rozdzielenie białek ze względu na pI)
SDS-PAGE
 Materiały i metody
Analiza białek spektrometrem masowym
wybrano prążki, które pojawiły się we wszystkich powtórzeniach
oczyszczenie, alkilowanie, trawienie w żelu trypsyną
identyfikacja metodą spektometrii masowej -przygotowanie
przemywanie i odbarwianie, aż do oczyszczenia z niebieskiego
barwnika
trawienie białek trypsyną
strawione peptydy analizowano w systemie chromatografii
cieczowej
analiza bioinformatyczna
 Wyniki badań

Analizie poddano osiem ekstraktów

białkowych.

Uzyskano porównywalną liczę prążków

we wszystkich próbkach.

Dalszej analizie poddano prążki, które

pojawiły się we wszystkich trzech
powtórzeniach
 Wyniki badań

W próbkach pochodzących od pasożytów

nieeksponowanych na PZQ zidentyfikowano
60 białek
W eksponowanych - 55
42 białka okazały się być wspólne dla
wszystkich czterech ekstraktów białkowych
pasożytów eksponowanych na PZQ
 Wyniki badań
Funkcja molekularna zidentyfikowanych białek

Zidentyfikowano m.in. białka o funkcjach: wiążących, katalitycznych, chaperonowe i

motoryczne
Pod względem lokalizacji komórkowej zidentyfikowane białka to: białka cytoszkieletowe,
cytozolowe, jądrowe, błonowe
 Podsumowanie
W badaniu zidentyfikowano 60 białek, które były obecne u dorosłych
pasożytów nieeksponowanych na PZQ, niektóre z tych białek zniknęły u
osobników wystawionych na działanie leku

Wyniki wskazują na udział ekspozycji na PZQ na ekspresję tych białek w

szczepach opornych i podatnych
 Wnioski
Identyfikacja białek przypuszczalnie związanych z opornością na PZQ u S.
mansoni może pozwolić na opracowanie testu diagnostycznego pozwalającego
na odróżnienie pacjentów będących nosicielami szczepów opornych na PZQ,
od szczepów wrażliwych na PZQ
Istnieje ponadto możliwość dostosowania podawania i dawkowania leku, w
celu zwiększenia skuteczności leczenia
Hipoteza : proteaza cysteinowa
SjCB2 odgrywa ważną rolę w
przenikaniu Schistosoma
japonicum przez skóre żywiciela
 Materiały i metody
Analiza bioinformatyczna - tworzenie konstruktu genetycznego - ekspresja
rekombinowanego białka - oczyszczanie rekombinowanego białka
BLAST
Projektowanie linker starterów
Enzymy restrykcyjne: BamHI i XhoI
Plazmid ekspresyjny pGEX-h-6t-1
Sekwencjonowanie
Transformacja konstruktu do ekspresyjnego szczepu E. coli BL21 (DE3)
Ekspresja SjCB2 w medium LB z dodatkiem ampicyliny ( 100 μg/ml ) i
inducją poprzez dodanie 1mM IPTG przez 6h
Oczyszczaniie białka metodą chromatografii powinowactwa oraz
zagęszczanie z zużyciem Amicon Ultra-10K
Produkcja przeciwciał przeciwko rekombinowanemu SjCB2
Immunizacja królika nowozelandzkiego oczyszczonym rSjCB2
odpowiednio w 1, 14, 43 dniu. Królik z grupy kontrolnej
immunizowanuy był PBS. Surowicę pobranow 53 dniu
Izolacja igG oraz usunięcie przeciwciał igG - anty GST poprzez
inkubację z oczyszconym białkiem GST
Test ELISA w celu sprawdzenia efektywności wyizoloweanych
przeciwciał
Wyniki ekspresji rSjB2 oraz produkcji przeciwciał
Uzyskane rekombinowane białko miało masę 65 kDA co jest
odpowiednim wynikiem dla białka SjB2 z dodatkiem metki GST
Efektywność oczyszczonego białka szacowana jest na 90%
Test ELISA wykazał, że miano IgG z badanego królika wynosiło
1:80000
Miano IgG przeciwko GST miało bardzo zbliżone wyniki do kontroli
negatywnej
Przygotowanie ekstraktu białek oraz analiza Western Blot

Homogenizacja cerkarii S. japonicum

Analiza Western Blot z przeciwciałami anty-królik oraz anty-rSjCB2
Wyniki Western Blot

Ścieżka A - wynik z
przeciwciałami anty-królik
Ścieżka B - wynik z
przeciwciałami anty-rSjCB2
Produkcja rekombiniwanego SjCB2 w P. Pastoris, oczyszczanie oraz
deglikozylacja
Tworzenie konstruktu genetycznego SjCB2-pPICZaA ( XbaI,
EcorI)
Transformacja konstruktu do ekspresyjnego P. pastoris X33
poprzez elektrotransformacje
Hodowla na płytkach YPDS z dodatkiem Zeocyny (100ug/ml)
Pojedynczą kolonię wybrano do ekspresji białka
Oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa Ni2+-NTA,
a następnie z powinowactwem do DEAE
Deklikozylację przeprowadzono przy użyciu endoglikozydazy H
Wyniki SDS-PAGE oczyszczonego ySjCB2
Ścieżka 1 - oczyszczony
ySjCB2 przed dekligozylacją
Ścieżka 2 - oczyszczony
ySjCB2 po dekligozylacji
Zahamowanie inwazji cerkarii
15 myszy losowo podzielono na 3 grupy :
40 cerkarii inkubowano w wodzie
40 cerkarii inkubowano z przeciwciałami anty-SjCB2 IgG
40 cerkarii inkubowano z przeciwciałami IgG
proimmunizowanymi
Robaki zbierano 28 dni pom zakażeniu
Wyniki zahamowania inwazji cerkarii

Zaobserwowano
znaczącą redukcję
liczby robaków w
grupie leczonej anty-
rSjCB2. p value<0,05
Uzyskane wyniki wykazują,
że proteaza cysteinowa
SjCB2 odgrywa ważną rolę w
przenikaniu Schistosoma
japonicum przez skóre
żywiciela
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Materiały i metody
Analiza bioinformatyczna - tworzenie konstruktu genetycznego - ekspresja
rekombinowanego białka - oczyszczanie rekombinowanego białka
Tworzenie konstruktu genetycznego pET28a/SmKI-1 (NcoI, EcoRI)
Transformacja konstruktu do ekspresyjnego szczepu E. coli BL21 (DE3)
Ekspresja SmKI-1 przez 4h
Oczyszczaniie białka metodą chromatografii powinowactwa
SDS-PAGE
Real time PCR - wyniki

Analiza wykazała, że gen SmKI-1 ulega

wysokiej ekspresji tylko u dorosłych samic i
samców
Western Blot
Analiza wykazała, że uzyskane mysie
przeciwciało anty-rSmKI (uzyskane w myszach
przez Genescript) jest specyficzne i nie
wykazuje aktywności z białkami typuKunitz z
innych organizmów
Immunolokalizacja

Analiza z użyciem
surowicy mysiej z
przeciwciałami anty-
SMK-1 wykazała, że
SmKI-1 występuje
szczególnie wzdłuż
tegumentu dorosłych
przywr S. mansoni oraz
na obszarze jaj
Wpływ SmKI-1 na krzepnięcie krwi

Przeprowadzono testy:
PT (czas protrombinowy)
APTT (czas częściowej tromboplastyny po
aktywacji)
Smk-1 hamował 2 proteazy serynowe związane
z krzepnięciem - FXa i kallikreinę
Uzyskane wyniki wskazują, że inhibitor proteaz typu
Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma właściwości
przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Inhibitor proteaz typu Kunitza (SmKI-1) z S. mansoni ma
właściwości przeciwzakrzepowe
Dodaj nagłówek
 Item 5 Item 1
20% 20%

Zapisz swój
temat lub pomysł
Item 4 Item 2
20% 20%

Krótko opisz, co chcesz

omówić.
Item 3
20%
Wykorzystaj to miejsce
na podpis zdjęcia.
Wykorzystaj to miejsce
na podpis zdjęcia.
50

40

Zapisz swój
30
temat lub pomysł
20

Krótko opisz, co chcesz

10 omówić.

0
Item 1 Item 2 Item 3 Item 4 Item 5
Wykorzystaj to miejsce
na podpis zdjęcia.
Zapisz swój temat lub pomysł
Krótko opisz, co chcesz omówić.
 Zapisz swój temat lub pomysł

2 na 6 5 na 6

Krótko opisz, co chcesz omówić. Krótko opisz, co chcesz omówić.

Dodaj
nagłówek
 Zapisz swój temat lub pomysł
Krótko opisz, co chcesz omówić.

Dodaj główny punkt Dodaj główny punkt Dodaj główny punkt

30% 60% 90%

 Przyszłość należy do
tych, którzy wierzą w
piękno swoich marzeń.
Eleanor Roosevelt
Zapisz swój temat lub pomysł
Zapisz swój
temat lub pomysł
Krótko opisz, co chcesz omówić.
Darmowe
zasoby
Użyj tych elementów w
swojej prezentacji Canva.