Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

Bài viết video

Thu hoạch chất độc từ bọ sát thủ và các loài côn trùng dị hợp khác
1 1
Andrew Allan Walker , Max Rosenthal1 , Eivind EA Undheim2 , Glenn F. King
1
Viện Khoa học Sinh học Phân tử, Đại học Queensland
2
Trung tâm Hình ảnh Nâng cao, Đại học Queensland

Thư từ gửi tới: Andrew Allan Walker tại a.walker@imb.uq.edu.au

URL: https://www.jove.com/video/57729 DOI:

doi:10.3791/57729

Từ khóa: Khoa học môi trường, số 134, Heteroptera, bọ thật, Reduviidae, Belostomatidae, nọc độc, độc tố, nước bọt, kích thích điện, quấy rối, tuyến nọc độc, tuyến
môi, tuyến nước bọt

Ngày xuất bản: 21/4/2018

Trích dẫn: Walker, AA, Rosenthal, M., Undheim, EE, King, GF Thu hoạch chất độc từ bọ sát thủ và các loài côn trùng dị hợp khác. J.
Vis. Exp. (134), e57729, doi:10.3791/57729 (2018).

trừu tượng

Các loài côn trùng dị hợp như bọ sát thủ (Reduviidae) và bọ nước khổng lồ (Belostomatidae) có nguồn gốc từ một tổ tiên có nọc độc và săn mồi chung, và phần lớn các
loài dị hợp còn tồn tại vẫn giữ được chiến lược dinh dưỡng này. Một số loài dị hợp đã chuyển sang ăn máu động vật có xương sống (như bọ hôn, Triatominae; và rệp,
Cimicidae) trong khi những loài khác quay lại ăn thực vật (hầu hết Pentatomomorpha). Tuy nhiên, ngoại trừ nước bọt được bọ xít hôn sử dụng để tạo điều kiện cho việc
hút máu, người ta biết rất ít về nọc độc của loài dị loài so với nọc độc của nhện, bọ cạp và rắn.

Một trở ngại đối với việc mô tả đặc điểm của độc tố nọc độc dị loại là cấu trúc và chức năng của nọc độc/tuyến môi, cả hai đều phức tạp về mặt hình thái và thực hiện
nhiều vai trò sinh học (phòng thủ, bắt mồi và tiêu hóa ngoài miệng). Trong bài viết này, chúng tôi mô tả ba phương pháp mà chúng tôi đã sử dụng thành công để thu
thập nọc độc của loài dị loài. Đầu tiên, chúng tôi trình bày phương pháp kích thích điện như một cách thuận tiện để thu thập nọc độc thường gây chết người khi tiêm
vào động vật săn mồi và giúp tránh ô nhiễm bởi mô tuyến. Thứ hai, chúng tôi chứng minh rằng sự quấy rối nhẹ nhàng đối với động vật là đủ để tạo ra nọc độc phun ra từ vòi
và/hoặc nọc độc phun ra ở một số nhóm dị loài.
Thứ ba, chúng tôi mô tả các phương pháp thu hoạch độc tố nọc độc bằng cách mổ xẻ động vật đã được gây mê để lấy tuyến nọc độc. Phương pháp này bổ sung cho các
phương pháp khác, vì nó có thể cho phép thu hoạch chất độc từ các đơn vị phân loại mà việc kích thích điện và quấy rối không hiệu quả.
Các quy trình này sẽ cho phép các nhà nghiên cứu thu hoạch độc tố từ côn trùng dị loài để mô tả đặc tính cấu trúc-chức năng và các ứng dụng khả thi trong y học
và nông nghiệp.

Liên kêt video

Thành phần video của bài viết này có thể được tìm thấy tại https://www.jove.com/video/57729/

Giới thiệu

Nọc độc của loài dị loại là những chất có hoạt tính sinh học tiềm tàng1 . Ví dụ, nọc độc/nước bọt tiết ra của các loài Heteroptera hút máu như bọ hôn (Triatominae)
2
và rệp (Cimicidae) tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho ăn bằng cách phá vỡ các con đường cầm máu bao gồm đông máu, . Chất độc trong những nọc độc này nhắm vào nhiều
kết tập tiểu cầu và co mạch, cũng như các con đường gây đau và ngứa. Nọc độc của hầu hết các loài dị loài khác được điều chỉnh để tạo điều kiện thuận lợi cho việc
săn mồi hơn là hút máu. Nọc độc của chúng gây tê liệt, tử vong và hóa lỏng mô khi tiêm vào động vật không xương sống3,4 . Khi tiêm vào động vật có xương sống, nọc độc
của chúng cũng có thể gây ra tác động mạnh mẽ. Ví dụ, việc tiêm nọc độc của loài bọ sát thủ Holotrichius innesi vào động vật có xương sống gây đau đớn, tê liệt cơ và
xuất huyết; chuột bị nhiễm độc này sẽ chết nhanh chóng do liệt hô hấp5 .

Các nghiên cứu về phiên mã và protein đã tiết lộ thành phần protein của một số nọc độc dị loại. Nọc độc của các loài săn mồi rất giàu protease, các enzyme khác, peptide
và protein chưa rõ cấu trúc và chức năng6,7,8 . Nọc độc của bọ hôn rất giàu họ protein triabin, các thành viên có ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình đông máu, kết tập tiểu
cầu và co mạch là nền tảng cho hầu hết các hoạt động sinh học của nọc độc. Ví dụ, nọc độc của loài bọ hôn Triatoma infestans 2,9 . Tuy nhiên, người ta không biết chất độc nào
đã được báo cáo là có tác dụng giảm đau và ức chế kênh natri10, nhưng các thành phần chịu trách nhiệm vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tương tự như vậy, người ta vẫn
chưa biết (các) thành phần nào của nọc độc sát thủ có thể gây tê liệt hoặc đau đớn. Điều kiện tiên quyết để xác định các chất độc chịu trách nhiệm cho các hoạt động
sinh học cụ thể của nọc độc và để mô tả cấu trúc và chức năng của các chất độc mới là thu được nọc độc.

Nọc độc được lấy từ động vật dị loại bằng cách kích thích điện 5,6,7,8,11,12,13, kích thích phản ứng phòng thủ4,8 , ép ngực một cách máy móc12,14,15,16, mổ xẻ các tuyến
nọc độc8,17,18,19 ,20,21,22 và ứng dụng chất chủ vận của thụ thể acetylcholine muscarinic23. Việc đánh giá những ưu điểm và nhược điểm tiềm ẩn của bất kỳ phương pháp
nào đều phức tạp do hình thái của các tuyến nọc độc dị loại, bao gồm một tuyến chính có hai lumen riêng biệt, tuyến chính phía trước (AMG) và tuyến chính phía sau (PMG),
cũng như một tuyến liên quan. tuyến phụ (AG). Các khoang tuyến khác nhau này tạo ra các chất tiết protein khác nhau, có thể chuyên biệt cho các chức năng sinh học khác
nhau bao gồm bắt mồi, phòng thủ và tiêu hóa ngoài miệng8,17. Ở bọ sát thủ peiratine và ectrichodiine, AMG có liên quan đến việc bắt con mồi và PMG có liên quan đến quá
trình tiêu hóa ngoài miệng17 . Tuy nhiên, ở loài bọ harpactorine Pristhesancus plagipennis , PMG chuyên dùng để bắt và tiêu hóa con mồi trong khi AMG được cho là tiết
ra nọc độc phòng thủ8 . AG đã được mô tả là có ít

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 1 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

chức năng bài tiết ở bọ sát thủ8 hoặc là nơi lưu trữ chính protease ở bọ nước khổng lồ23 . Rõ ràng, cần phải nghiên cứu thêm để làm rõ chức năng của từng
khoang tuyến giữa các phân nhóm dị hợp khác nhau và để xác định chức năng của hầu hết các chất độc nọc độc. Trong báo cáo này, chúng tôi mô tả các quy trình thu
hoạch độc tố nọc độc từ loài dị hợp nhằm hướng tới mục tiêu này.

Giao thức

Quy trình này tuân thủ chính sách của Đại học Queensland được quy định trong Chăm sóc và sử dụng động vật có trách nhiệm trong giảng dạy và nghiên cứu (PPL
4.20.11) cũng như quy tắc Úc của Hội đồng nghiên cứu y tế và sức khỏe quốc gia về việc chăm sóc và sử dụng động vật cho mục đích khoa học ( Ấn bản thứ 8
năm 2013).

Thận trọng: Cẩn thận để không bị nhiễm độc khi xử lý bọ sát thủ. Hãy cẩn thận để bảo vệ mắt khi xử lý các loài phun nọc độc một cách phòng thủ. Cẩn thận không
làm bị thương động vật thí nghiệm. Điều này bao gồm việc giám sát áp lực lên các dây hãm chẳng hạn như dây cao su và đảm bảo rằng vòi không bị gãy.

LƯU Ý: Tùy chọn, gây mê động vật bằng cách tiếp xúc với CO2 trong 0,5-2 phút hoặc làm mát đến 4-10 °C trước khi thu hoạch nọc độc trong Mục tiêu 1-3 để tạo điều kiện
di chuyển và giam giữ an toàn. Việc gây mê không bắt buộc phải thực hiện nhưng có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc giữ an toàn các mẫu vật nhanh nhẹn
hoặc khỏe mạnh. Tuy nhiên, động vật phải tỉnh táo để có thể thu hoạch nọc độc. Hãy lưu ý đến các ứng dụng tiếp theo khi quyết định có thêm chất ức chế
protease hay không.

1. Thu hoạch chất độc bằng phương pháp kích thích điện

1. Lấy mẫu vật sống để thu hoạch chất độc.

2. Sử dụng nhíp nhựa đã chuẩn bị sẵn với các điện cực dương và âm được gắn trên một trong hai đầu. Kết nối nhíp có điện với một
máy kích điện hoặc nguồn điện áp không đổi cho phép điều chỉnh điện áp.
1. Đối với bọ sát thủ nhỏ (~10 mm) và lớn (~25 mm), hãy sử dụng điện áp tối đa lần lượt là 15 và 25 V.
2. Đối với các loài dị hợp lớn hơn như bọ nước khổng lồ, hãy sử dụng tới 40 V.

3. Ngăn chặn côn trùng sống bằng cách buộc chúng vào bệ, dùng dây cao su buộc trên ngực.
4. Đặt đầu vòi vào đầu thu thập thích hợp. Đối với bọ sát thủ, hãy sử dụng đầu tip pipet P200. Đối với bọ nước khổng lồ, hãy cắt bỏ phần đầu
một đầu P200 để tăng kích thước khẩu độ.
1. Nhẹ nhàng nhấc vòi bằng một cặp nhíp sạch đã đóng kín và đẩy khẩu độ mở của đầu thu thập qua phần cuối của vòi.
vòi con.
2. Nếu muốn, hãy hút ~5 µL nước siêu tinh khiết trước khi đặt vòi vào đầu thu. Điều này làm giảm sự thất thoát nọc độc còn sót lại bên trong đầu, mặc dù
nọc độc thu được sẽ bị loãng đi.

5. Áp dụng kích thích điện. Nhúng các điện cực kích thích vào gel dẫn điện, chẳng hạn như NaCl 2,5 M/50% glycerol. Đặt các điện cực vào
ngực. Đối với belostomatids, dán hai điện cực lên mặt sau của đầu.
6. Lưu trữ nọc độc để ngăn chặn quá trình tự phân hủy. Sau khi nọc độc được rút ra, chuyển nhanh sang ống ở -20°C hoặc -60°C hoặc ống chứa
cocktail ức chế protease.
7. Lặp lại các bước 1.5 và 1.6 cho đến khi thu được đủ nọc độc hoặc không còn nọc độc nào nữa.

2. Thu hoạch chất độc bằng cách quấy rối

1. Chuẩn bị động vật để lấy nọc độc và đặt đầu vòi vào tiền sảnh thu thập nọc độc, như mô tả trong tiểu mục 1.1 và 1.3-1.4.
2. Nếu nọc độc tự phát ra, chuyển sang bước 2.3. Nếu không, hãy quấy rối con vật bằng cách chạm nhẹ vào chân, bụng và râu của nó bằng
nhíp cho đến khi nọc độc được tạo ra.
3. Chuyển nhanh nọc độc vào ống ở -20°C hoặc -60°C, hoặc ống chứa hỗn hợp chất ức chế protease, nếu muốn.

3. Thu hoạch chất độc bằng cách quấy rối từ các loài “nhổ” nọc độc

1. Gây mê hoặc gây mê một phần côn trùng trước khi đưa nó ra khỏi chuồng để ngăn chặn bất kỳ hành vi khạc nhổ phòng thủ sớm nào.
2. Kích động hành vi phun nọc độc. Chứa và định vị lại côn trùng bằng nắp sâu của đĩa Petri tiêu chuẩn 90 x 16 mm. Giữ nắp hơi lùi về phía sau và cao hơn
côn trùng 1-4 cm để ngăn côn trùng bay. Hầu hết côn trùng sẽ khạc nhổ nhiều lần, thường là liên tiếp. Đảm bảo tất cả nọc độc được thu thập ở mặt dưới
của đĩa.

3. Thu lấy nọc độc ở mặt dưới đĩa Petri bằng cách rửa bằng 10 µL nước siêu tinh khiết. Chuyển nhanh vào ống nghiệm ở -20°C hoặc -60°C,
hoặc một ống chứa cocktail ức chế protease.

4. Thu hoạch chất độc bằng cách mổ xẻ tuyến

1. Hiến tế động vật. Gây mê hoặc giết chết động vật khi tiếp xúc với CO2 > 5 phút. Dẫn khí CO2 tinh khiết trực tiếp vào lỗ thoát khí của vật nuôi
bao vây nhà ở.
2. Ghim côn trùng vào khay mổ. Đối với bọ sát thủ, mổ xẻ qua bề mặt bụng (4.3). Đối với bọ nước khổng lồ, mổ xẻ qua lưng
bề mặt (4.4).
3. Phẫu tích bụng

1. Chèn ba chiếc ghim vào bụng sau để giữ côn trùng nằm yên mà không làm thủng tuyến nọc độc.
2. Cắt một đường rạch ngắn ở giữa bụng bằng dao mổ thu nhỏ. Sử dụng kéo nhỏ để kéo dài đường rạch giữa về phía trước tới đầu, chú ý chỉ cắt phần
xương ngoài và không làm tổn thương các cấu trúc bên trong.

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 2 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

3. Để lộ các cấu trúc bên trong, thực hiện nhiều đường cắt bên kéo dài từ đường giữa đến cạnh bên của côn trùng. Sau đó, ghim từng vạt của bộ
xương ngoài bụng để lộ cấu trúc bên trong.
4. Đối với những con bọ sát thủ lớn, hãy rạch bốn bên, ở bụng giữa, bụng trước, giữa chân thứ nhất và chân thứ hai, và ở phía trong.
trước chân thứ nhất.

4. Phẫu tích lưng

1. Loại bỏ các cánh gần gốc. Cắm ba chiếc ghim vào bụng sau để giữ côn trùng nằm yên mà không làm thủng nọc độc
tuyến.
2. Cắt một đường giữa từ đầu đến bụng bằng kéo nhỏ và dao mổ, chú ý chỉ cắt phần xương ngoài và không làm tổn thương các cấu trúc bên trong.

3. Buộc tách hai nửa con côn trùng ra. Đặt một số ghim dọc theo chiều dài của côn trùng để lộ khoang bên trong.
4. Loại bỏ các cơ bay bằng nhíp.

5. Làm ngập khay mổ. Thêm PBS cho đến khi lỗi chìm xuống để các cấu trúc bên trong nổi lên và dễ nhìn thấy hơn.
6. Dùng nhíp và kéo siêu nhỏ cẩn thận loại bỏ mô liên kết, mô thần kinh và khí quản. Các tuyến nọc độc có vẻ thon dài,
cấu trúc mờ kéo dài dọc theo mỗi bên của ống tiêu hóa.
1. Xác định tuyến chính bằng hình dáng đặc trưng của nó, với các thùy trước và sau và hai ống dẫn gặp nhau ở rốn gan.
2. Nếu muốn, hãy xác định tuyến phụ bằng cách vạch ống dẫn từ rốn. Giải phóng tuyến chính bằng cách cắt hai ống dẫn ra từ
rốn.

7. Thu hoạch lumen tuyến mong muốn. Chuyển tuyến sang máy ly tâm vi mô trên đá chứa 30 µL PBS hoặc PBS cộng với chất ức chế protease
cocktail. Cắt các tuyến bằng một chiếc ghim sắc, sạch.
1. Vortex trong 10 giây và ly tâm (1 phút, 5.000 × g, 4°C) để làm rỗng các lumen tuyến. Loại bỏ các mô tuyến bằng nhíp.

8. Làm rõ dịch chiết độc tố. Ly tâm (5 phút, 17.000 × g, 4°C) để loại bỏ các hạt rắn, giữ lại phần nổi phía trên và loại bỏ cặn.
Bảo quản ở -20°C hoặc -60°C để tránh sự phân hủy tự phân giải protein.

Kết quả đại diện

Một số loài dị loài, chẳng hạn như loài harpactorine P. plagipennis và loài reduviine Platymeris rhadamanthus, sản sinh ra một lượng lớn nọc độc (5-20 µL)
đáng tin cậy để đáp ứng với kích thích điện (Bảng 1). Nói chung, hầu hết các loài bọ peiratine, reduviine và harpactorine đều tạo ra nọc độc khi
phản ứng với phương pháp này. Trong số các loài bọ stenopodaine, kích thích điện sẽ tạo ra nọc độc từ Oncocephalus sp. nhưng không phải Thodelmus sp.
Các mẫu bọ holoptiline và emesine được lấy mẫu không tạo ra nọc độc đáng kể (ví dụ: đủ để phân tích bằng phép đo khối phổ) khi phản ứng với
kích thích điện. Kích thích điện cũng có thể được sử dụng để thu nọc độc từ bọ xít belostomatid và bọ xít săn mồi. Tuy nhiên, sự kích thích
điện của bọ cạp nước (Nepidae) chỉ gây ra sự giải phóng chất chứa trong các tuyến đầu chứ không phải nọc độc từ vòi.
Việc không thu được nọc độc bằng kích thích điện ở một số loài rất có thể là do sự phức tạp về hình thái của tuyến nọc độc và cơ chế sinh lý kiểm
soát việc giải phóng nọc độc8 .

Ngoài việc giải phóng nọc độc do kích thích điện, các loài reduviids P. plagipennis, Havinthus rufovarius, P. rhadamanthus và loài
belostomatid Lethocerus Differentifemur sẽ tự phát ra nọc độc từ vòi trong quá trình xử lý. Việc phóng nọc độc như vậy thường đi kèm với màn phòng
thủ. P. rhadamanthus cũng phun nọc độc để phòng thủ4 , một hành vi xảy ra ở rắn24 và nhện25 nhưng chúng tôi không biết đến hành vi này ở bất kỳ
loài reduviid nào khác.

6,7,8
Các thí nghiệm SDS-PAGE và proteomics chứng minh rằng nọc độc thu được bằng phương pháp kích thích điện và quấy rối là giàu protein. Protein .

chiếm tỷ lệ lớn trong vật liệu có mặt, mặc dù cũng có khả năng nọc độc có chứa các ion vô cơ và các chất khác.
Nọc độc của bọ sát thủ thu được bằng cách kích thích điện và quấy rối thường chứa hơn một trăm peptide và protein (Hình 1, Hình 2). Nọc độc
Belostomatid trước đây đã được báo cáo là rất giàu lysophospholipids13. Phổ hấp thụ hồng ngoại của nọc độc từ bọ nước belostomatine Diplonychus
eques phù hợp với hàm lượng của cả protein và lysophospholipids. Đối với lethocerine L. Differentifemur, bằng chứng chỉ được tìm thấy đối với
protein chứ không phải lysophospholipids6 .

Theo báo cáo về nọc độc của nhện26, nọc độc thu được từ côn trùng dị loài có thể khác nhau về nồng độ và thành phần, tùy thuộc vào loại côn trùng
được sử dụng và phương pháp thu hoạch. Quang phổ UV của các mẫu nọc độc pha loãng cho thấy giá trị độ hấp thụ (A280) là 50-250 (chiều dài đường
truyền 10 mm) đối với nọc độc không pha loãng, phù hợp với nồng độ protein cao ~50-250 mg/mL7,12,19. Người ta đã báo cáo rằng việc thiếu hụt
con mồi là nguyên nhân làm tăng liên tục nồng độ nọc độc và khả năng gây tê liệt3 cũng như làm giảm liên tiếp độ pH27 .
Tuy nhiên, nếu nhịn đói kéo dài sẽ dẫn đến suy nhược và tử vong. Cũng như nồng độ, phương pháp lấy nọc độc từ động vật dị hợp có thể ảnh hưởng đến
thành phần của nó. Thành phần độc tố của nọc độc từ loài bọ sát thủ P. plagipennis khác nhau rõ rệt tùy thuộc vào việc nó được thu hoạch bằng kích
thích điện hay quấy rối8 . Trong trường hợp của P. plagipennis, điều này được chứng minh là do sự kích thích điện tạo ra nội dung của PMG, trong khi
sự quấy rối mang lại nội dung của AMG. Nọc độc thu được bằng cách kích thích điện, nhưng không quấy rối, làm tê liệt côn trùng săn mồi (Hình
3). Tuy nhiên, vẫn chưa rõ kết quả này có thể được khái quát hóa ở mức độ nào đối với các loài Reduviidae hoặc Heteroptera khác.

Thu hoạch nọc độc trực tiếp bằng cách mổ xẻ các tuyến nọc độc cho phép phá vỡ cơ chế kiểm soát của tuyến nọc độc, dẫn đến ô nhiễm các protein của
mô tuyến (không phải nọc độc). Bất kể, chất chiết xuất thu được từ vật liệu được mổ xẻ có thể được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính sinh học/độc
tính. Ví dụ, chiết xuất PMG, AMG và AG của P. plagipennis, được điều chế bằng quy trình trên, được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng/khối
phổ song song8 . Quá trình này đã xác định tổng cộng 182, 114 và 71 protein, trong đó 45, 51 và 12 được phân loại là protein nọc độc giả định dựa
trên đặc điểm trình tự axit amin, các protein còn lại được phân loại là protein vệ sinh giả định. Việc tiêm chất chiết xuất từ PMG, chứ không phải
AMG hoặc AG, vào côn trùng sẽ dẫn đến tê liệt và tử vong8 .

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 3 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

hồng ngoại Gia đình Phân họ Tên nhị thức Tên gọi chung Quấy rối bằng kích thích điện Giải phẫu

Cimicomorpha họ Reduviidae Harpactorinae Pristhesancus Brisbane thông thường √ √ √

plagipennis lỗi sát thủ

Havinthus Sát thủ hổ đỏ √ √ √

rufovarius sâu bọ

Scipinia Arenacea Sát thủ gai đỏ √ thứ √

sâu bọ

Gminatus spp. Quả cam to √ thứ √

lỗi sát thủ

Trachylestes Sát thủ nhỏ màu đỏ √ thứ thứ

aspericollis sâu bọ

Reduviinae Platymeris spp. Người châu Phi khổng lồ √ √ √

lỗi sát thủ

Psytalla khủng khiếp Lỗi sát thủ gai góc √ √ thứ √

Peiratinae Ectomocoris spp. Đất cam thứ √

lỗi sát thủ

Peirates spp. Bọ sát thủ đen √ √ thứ thứ

Stenopodainae Oncocephalus spp. - thứ √

- x thứ √
Thodelmus spp.

Holoptilinae Vượn cáo Ptilocnemus Chân có lông x x thứ

sâu bọ

Emesinae Stenolemus spp. Lỗi chân x √ x x

Pentatomomorpha Pentatomidae Asopinae Amyotea hamata Vàng săn mồi thứ thứ

Con bọ có mùi khó chịu

Nepomorpha Nepidae Ranatrinae Ranatra khác biệt bọ cạp nước x, cg x √

Họ Belostomatidae Belostotinae Diplonychus tương đương với bọ nước √ thứ thứ

Họ Belostomatidae Lethocerinae Lethocerus sp. Bọ nước khổng lồ √ √ √

đánh dấu, thành công; vượt qua, không thành công; nd, không xác định; cg, chỉ xả tuyến thận

Bảng 1: Độ đặc hiệu của taxon của các phương pháp được sử dụng để thu hoạch nọc độc từ loài dị loại.

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 4 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

Hình 1: Các protein được phát hiện bằng phân tích LC-MS/MS của các điểm 2D SDS-PAGE và các phần HPLC của nọc độc được thu thập từ P. plagipennis bằng
phương pháp kích thích điện (Giao thức 1), cho thấy lượng protease dồi dào, protein miền CUB và các protein thuộc Nhóm 1 nọc độc dị loại.
(A) Gel 2D SDS-PAGE của nọc độc P. plagipennis thô , cho thấy các họ protein được xác định bằng LC-MS/MS của các đốm gel. (B) Sắc ký đồ HPLC từ quá
trình phân tách nọc độc P. plagipennis , cho thấy các họ protein được xác định bằng phân tích LC-MS/MS của các phân đoạn thu thập được. Sao chép với
sự cho phép7 . Vui lòng bấm vào đây để xem phiên bản lớn hơn của hình này.

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 5 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

Hình 2: Tỷ lệ trình tự thuộc từng loại protein chính trong nọc độc của P. plagipennis. Sao chép với sự cho phép7 .
Vui lòng bấm vào đây để xem phiên bản lớn hơn của hình này.

Hình 3: Nọc độc của P. plagipennis thu được bằng phương pháp kích thích điện, nhưng không quấy rối, làm tê liệt côn trùng. (A) Tác dụng của việc tiêm nọc
độc thu được bằng cách kích thích điện hoặc quấy rối hoặc nước đối với việc dế trốn thoát. Đối với mỗi tình trạng nọc độc, 0,17 µL nọc độc tương đương được tiêm
vào bụng và thời gian thoát khỏi nắp đĩa petri lật ngược (tính bằng giây, tối đa 300 giây, trung bình ± SD) đã được ghi lại. (B) Đường cong liều lượng phản ứng để
ức chế sự trốn thoát thành công bằng nọc độc thu được từ P. plagipennis bằng phương pháp kích thích điện. Sao chép với sự cho phép8 . Vui lòng bấm vào đây để xem
phiên bản lớn hơn của hình này.

Cuộc thảo luận

Bước quan trọng nhất trong việc thu hoạch nọc độc của côn trùng sát thủ là lựa chọn phương pháp thích hợp tùy theo mục đích nghiên cứu. Mỗi phương pháp trong số ba
phương pháp được trình bày để thu hoạch nọc độc dị loài đều có những ưu điểm và nhược điểm tùy thuộc vào các ứng dụng tiếp theo.

Kích thích bọ để trục xuất nọc độc ra khỏi vòi (Quy trình 1-3) tránh nhiễm nọc độc bởi các mô tuyến. Ngoài ra, những phương pháp này không gây chết người và có thể
được lặp lại nhiều lần trong suốt vòng đời của lỗi. Theo một số nghiên cứu, kích thích điện thường cung cấp lượng nọc độc lớn nhất và tạo ra nọc độc có độc
tính mạnh đối với côn trùng săn mồi . Kích thích phản ứng phòng thủ là một cách khác để tạo ra nọc độc từ vòi, và một cách có thể tạo ra nọc độc có hàm lượng
số 8

protein khác nhau để kích thích điện và kích thích không có tác dụng đối với nhiều loài và nếu không có nghiên cứu song song . Tuy nhiên, kích thích điện
về lượng tiết ra của tuyến nọc độc thì không rõ ràng. lumen tuyến nào (hoặc sự kết hợp của lumen tuyến nào) đang được thu hoạch.

Thu hoạch nọc độc bằng cách mổ xẻ (Nghị định thư 4) có nhiều cách bổ sung. Giải phẫu là một cách trực tiếp để tiếp cận nọc độc được lưu trữ và mỗi ngăn của tuyến
nọc độc có thể được thu hoạch riêng biệt hoặc gộp lại (nghĩa là loại bỏ khả năng loại bỏ nọc độc 'nhầm'). Tuy nhiên, phương pháp này gây chết người và còn gây ô
nhiễm nhẹ nọc độc bởi các thành phần mô. Nhiều loài Heteroptera quá nhỏ (hoặc quá dài trong trường hợp của Emesinae, loài bọ chân ren) để có thể thu hoạch nọc
độc bằng cách mổ xẻ. Nếu sử dụng phương pháp mổ xẻ

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 6 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

tách protein từ các khoang tuyến riêng lẻ, điều quan trọng là phải tách các thùy nhanh chóng và chiết xuất nội dung của chúng một cách riêng biệt để tránh lây nhiễm chéo.

Các phương pháp được trình bày ở đây sẽ cần phải được sửa đổi tùy thuộc vào loài cụ thể được nghiên cứu. Để thu thập nọc độc bằng kích thích điện, khía cạnh chính cần
tối ưu hóa là cách hạn chế côn trùng. Ví dụ, hầu hết các loài reduviid đều có thể mở rộng vòi của chúng trong một phạm vi chuyển động rộng. Những loài này có thể được
cố định một cách đơn giản ngay trên bệ bằng cách sử dụng dây cao su và vòi có thể lật ngược bằng tay.
Đối với các loài có vòi kém linh hoạt hơn, chẳng hạn như loài belostomatids, thay vào đó, cần phải giữ côn trùng ở tư thế lộn ngược và hạ thấp thùng thu gom ở góc chính
xác bằng cách sử dụng bình vặn lại hoặc cánh tay cơ khí. Cường độ và kiểu điện áp vào cũng phải được tối ưu hóa, và trong trường hợp này, tốt hơn là nên bắt đầu
ở mức thấp và tăng từ từ điện áp đưa vào để tránh gây chết người.

Nếu mục đích của nghiên cứu là đạt được sự hiểu biết chi tiết về cách một loài cụ thể sản xuất và sử dụng nọc độc, thì có thể cần phải có một cuộc điều tra chuyên
sâu kết hợp nhiều phương pháp thu hoạch cũng như các công nghệ như phép đo phổ khối và thí nghiệm RNA-Seq. Nếu mục đích là sử dụng nọc độc dị thể làm thư viện phân tử
sinh học để sàng lọc một số hoạt động sinh học mong muốn thì bảng mẫu nọc độc thu được bằng phương pháp kích thích điện, quấy rối và/hoặc mổ xẻ có thể phù hợp. Tuy nhiên,
chúng tôi lưu ý rằng vai trò sinh học bình thường của nọc độc được thu hoạch có khả năng quyết định hoạt tính sinh học hiện diện. Ví dụ, nọc độc được sử dụng để săn mồi
có nhiều khả năng chứa các hợp chất diệt côn trùng, trong khi nọc độc được sử dụng để phòng vệ có nhiều khả năng chứa các tác nhân gây bệnh (gây đau).

Chúng tôi chưa bao gồm việc thu hoạch nọc độc bằng cách sử dụng chất chủ vận thụ thể muscarinic acetylcholine pilocarpine trong giao thức này. Cần có các thí
nghiệm trong tương lai để xác định đặc điểm thải nọc độc do pilocarpine gây ra so với các phương pháp trên.

Trong bài viết này, chúng tôi đã trình bày các phương pháp cho phép các nhà nghiên cứu thu được nọc độc từ côn trùng dị loài. Việc thu thập nọc độc thành công sẽ cho
phép nghiên cứu sâu hơn về quá trình sản xuất, thành phần, chức năng và sự tiến hóa của nọc độc ở Heteroptera. Ngoài ra, một số độc tố dị loại có thể được sử dụng như
thuốc trừ sâu thân thiện với môi trường, các phân tử chì để phát triển phương pháp trị liệu cho con người hoặc làm công cụ khoa học để nghiên cứu các hệ thống sinh học.

Tiết lộ

Các tác giả không có gì để tiết lộ.

Sự nhìn nhận

Chúng tôi ghi nhận sự hỗ trợ tài chính từ Hội đồng Nghiên cứu Úc (Cấp DP130103813 và LP140100832 cho GFK, Học bổng DECRA DE160101142 cho EABU), Hội đồng Nghiên cứu Y tế &
Sức khỏe Quốc gia Úc (Học bổng Nghiên cứu Chính APP1044414 cho GFK) và Đại học Queensland (Học bổng Sau Tiến sĩ cho AAW).

Người giới thiệu

1. Walker, AA, Weirauch, C., Fry, BG, & King, GF Nọc độc của côn trùng dị loài: Một kho tàng gồm các bộ công cụ dược lý đa dạng.
Chất độc. 8 (2), 43 (2016).
2. Ribeiro, JMC, Assumpção, TC, & Francischetti, IMB Cái nhìn sâu sắc về các sialome của loài Heteroptera hút máu. Tâm lý (Stuttg). 2012
1-16 (2012).
3. Ambrose, DP, & Maran, SPM Định lượng, hàm lượng protein và khả năng gây tê liệt của nước bọt của loài Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae:
Reduviinae). Tạp chí Khoa học Môi trường Ấn Độ. 3 (1), 16-11 (1999).
4. Edwards, JS Hoạt động và quá trình phân hủy nước bọt của bọ sát thủ Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Bộ cánh nửa, Reduviidae).
Tạp chí Sinh học Thực nghiệm. 38 61-77 (1961).
5. Zerachia, T., Bergmann, F., & Shulov, A. trong Chất độc động vật và thực vật. (ed E. Kaiser) 143-146 Goldman, (1973).
6. Walker, AA, Hernández-Vargas, MJ, Corzo, G., Fry, BG, & King, GF Bọ nước giết cá khổng lồ tiết lộ nọc độc cổ xưa và năng động
sự tiến hóa ở Heteroptera. Khoa học đời sống tế bào và phân tử. (2018).
7. Walker, AA và cộng sự. Loài bọ nước giết cá khổng lồ tiết lộ quá trình tiến hóa nọc độc cổ xưa và năng động ở Heteroptera. Tế bào. Mol. Khoa học cuộc sống. (2018).
8. Walker, AA và cộng sự. Loài bọ sát thủ Pristhesancus plagipennis tạo ra hai loại nọc độc riêng biệt trong các lumen tuyến riêng biệt. Thiên nhiên
Truyền thông. 9 (1), 755 (2018).
9. Hernández-Vargas, MJ, Santibáñez-López, CE, & Corzo, G. Cái nhìn sâu sắc về họ protein triabin của loài ăn máu ở Mỹ
reduviids: Phân tích chức năng, cấu trúc và phát sinh gen. Chất độc. 8 (2), 44 (2016).
10. Dan, A., Pereira, MH, Pesquero, JL, Diotaiuti, L., & Beirao, PS Tác động của nước bọt của Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) trên
kênh natri. Tạp chí côn trùng y tế. 36 (6), 875-879 (1999).
11. Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., & Nakajima, T. Các peptide mới từ bọ sát thủ (Hemiptera: Reduviidae): cách ly,
đặc tính hóa học và sinh học. Thư FEBS. 499 (3), 256-261 (2001).
12. Sahayaraj, K., Kumar, SM, & Anandh, GP Đánh giá hiện tượng vắt sữa và sốc điện để thu thập nọc độc từ thợ săn reduviids. Entomon.
31 (1), 65-68 (2006).
13. Silva-Cardoso, L. và cộng sự. Hoạt tính làm tê liệt lysophosphatidylcholine từ nước bọt của bọ nước Belostoma anurum. Tạp chí thực nghiệm
Sinh vật học. 213 (19), 3305-3310 (2010).
14. Noeske-Jungblut, C. và cộng sự. Triabin, một chất ức chế Thrombin ngoại bào rất mạnh. Tạp chí Hóa sinh học. 270 (48), 28629-28634
(1995).
15. Noeske-Jungblut, C. và cộng sự. Một chất ức chế kết tập tiểu cầu do collagen gây ra từ nước bọt của Triatoma pallidipennis. Tạp chí sinh học
Hoá học. 269 (7), 5050-5053 (1994).
16. Sahayaraj, K., Borgio, JF, Muthukumar, S., & Anandh, GP Hoạt tính kháng khuẩn của Rhynocorismarginatus (Fab.) và Catamirus
brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) có nọc độc chống lại mầm bệnh ở người. Tạp chí Động vật có nọc độc và chất độc bao gồm các bệnh nhiệt đới. 12
(3), 487-496 (2006).

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 7 trên 8
Machine Translated by Google

Tạp chí thí nghiệm trực quan www.jove.com

17. Haridass, ET, & Ananthakrishnan, TN Hình thái chức năng của hệ thống nước bọt ở một số loài reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae).
Kỷ yếu của Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ. Khoa học động vật. 90 (2), 145-160 (1981).
18. Maran, SPM, & Ambrose, DP trong Ứng dụng công nghệ sinh học để quản lý dịch hại tổng hợp., biên tập A. Ignacimuth, A. Sen, & S.
Janarthanan) 125-131 Nhà xuất bản Oxford (2000).
19. Maran, SPM, Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, DA, & Ambrose, DP trong Quản lý dịch hại côn trùng, Tình huống hiện tại. (ed DP
Ambrose) 346-361 Đơn vị nghiên cứu côn trùng học, (2011).
20. Pereira, MH và cộng sự. Hoạt tính chống đông máu của Triatoma infestans và nước bọt Panstrongylus megistus (Hemiptera/Triatominae). Acta nhiệt đới. 61
255-261 (1996).
21. Ribeiro, JM, Marinotti, O., & Gonzales, R. Một loại thuốc giãn mạch nước bọt ở loài bọ hút máu, Rhodnius prolixus. Tạp chí Dược học
Anh. 101 (4), 932-936 (1990).
22. Ribeiro, JM, Schneider, M., & Guimarães, JA Tinh chế và xác định đặc tính của prolixin-S (nitrophorin 2), chất chống đông máu nước bọt của
loài bọ hút máu Rhodnius prolixus. Tạp chí sinh hóa. 308 (1), 243-249 (1995).
23. Swart, CC, Deaton, LE, & Felgenhauer, BE Tuyến nước bọt và các enzyme nước bọt của loài bọ nước khổng lồ (Heteroptera; Belostomatidae).
Hóa sinh so sánh và sinh lý học Sinh lý học phân tử và tích hợp. 145 (1), 114-122 (2006).
24. Rasmussen, S., Young, B., & Krimm, H. Về hành vi 'khạc nhổ' ở rắn hổ mang (Serpentes: Elapidae). Tạp chí Động vật học. 237 (1), 27-35
(1995).
25. Fink, LS Nọc độc do nhện linh miêu xanh, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae) phun ra. Tạp chí nhện. 12 372-373 (1984).
26. Herzig, V. Ontogen, giới tính và sự lột xác ảnh hưởng đến lượng nọc độc ở loài nhện Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). tạp chí
của nghiên cứu nọc độc. 1 76-83 (2010).
27. Sahayaraj, K., Subramanium, M., & Rivers, D. Phân tích sinh hóa và điện di của nước bọt từ các loài reduviid săn mồi
Rhynocoris lề (Fab.). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).

Copyright © 2018 Tạp chí Thí nghiệm Trực quan Tháng 4 năm 2018 | 134 | e57729 | Trang 8 trên 8