NB-66-117 Article-60751 en 1

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Um periódico de acesso aberto revisado por pares
NeoBiota 66: 117–159 (2021)

doi: 10.3897/neobiota.66.60751 ARTIGO DE REVISÃO NeoBiota
https://neobiota.pensoft.net Avanço na pesquisa sobre espécies exóticas e invasões biológicas
Vigilância avançada de base molecular de mexilhões quagga e

zebra: uma revisão do ambiente
Estudos de DNA/RNA (eDNA/eRNA) e
Considerações para direções futuras
Sheena M. Feist1, Richard F. Lance1
1 Laboratório Ambiental, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento do Corpo de Engenheiros do Exército dos Estados Unidos, Vicksburg,
MS 39180, EUA
Autor correspondente: Sheena Feist (sheena.m.feist@erdc.dren.mil)
Editor acadêmico: A. Petrusek | Recebido em 13 de novembro de 2020 | Aceito em 22 de junho de 2021 | Publicado em 13 de julho de 2021
Citação: Feist SM, Lance RF (2021) Vigilância molecular avançada de mexilhões quagga e zebra: uma revisão
dos estudos ambientais de DNA/RNA (eDNA/eRNA) e considerações para direções futuras. NeoBiota 66: 117–
159. https://doi.org/10.3897/neobiota.66.60751
Abstrato
Métodos sensíveis, capazes de detectar com rapidez e precisão espécies aquáticas invasoras, estão em demanda.
Abordagens baseadas em moléculas, como pesquisas ambientais de DNA (eDNA), satisfazem esses requisitos e têm crescido em
popularidade. Como tal, as pesquisas de eDNA podem ajudar no esforço de combater a colonização e disseminação de duas espécies
de mexilhões de água doce notoriamente invasivas, o mexilhão quagga (Dreissena rostriformis bu gensis) e o mexilhão zebra (D.
polymorpha), por meio de uma melhor capacidade de vigilância. Aqui, fornecemos uma revisão da literatura dreissenid eDNA (tanto
cinza quanto publicada), resumindo os esforços envolvidos no desenvolvimento de vários ensaios para uso em várias tecnologias
diferentes (por exemplo, PCR quantitativo, sequenciamento de alto rendimento e amplificação isotérmica mediada por loop) e cenários
de amostragem. Discutimos importantes descobertas feitas ao longo do caminho, incluindo novas revelações envolvendo RNA
ambiental (eRNA), bem como as vantagens e limitações dos métodos e instrumentação disponíveis. Para encerrar, destacamos as
lacunas críticas restantes, onde uma investigação mais aprofundada pode levar a avanços na capacidade de monitoramento dreissenid.
Palavras-chave
Ensaio, ddPCR, HTS, LAMP, metabarcoding, DNA nuclear, qPCR, veligers
Copyright Sheena M. Feist, Richard F. Lance. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative
Commons (CC BY 4.0), que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
118 Sheena M. Feist & Richard F. Lance / NeoBiota 66: 117–159 (2021)
Introdução
Os mexilhões quagga (Dreissena rostriformis bugensis) e zebra (D. polymorpha) são

espécies aquáticas invasoras (AIS), conhecidas por impor custos econômicos e danos
ecológicos (Higgins e Zanden 2010; Nalepa e Schloesser 2013). Esses mexilhões
pertencem a um gênero filogeneticamente complexo composto por pelo menos seis
espécies (Rosenberg e Ludy anskiy 1994; Gelembiuk et al. 2006; Son 2007; Graf e
Cummings 2019). Embora nativos do Ponto-Caspiano, os mexilhões quagga e zebra (aqui
referidos como QM-ZM) tornaram-se invasores problemáticos na América do Norte e na Europa (Karatay
2007, 2015; Ram e Palazzolo 2008; Nalepa e Schloesser 2013; Matheus et ai.
2014). Eles possuem vários atributos que contribuíram para o sucesso da invasão.
Os atributos incluem reprodução prolífica na qual larvas flutuantes microscópicas (véligers)
são liberadas na coluna de água e contornam facilmente a detecção visual (Johnson e
Padilla 1996; Stoeckel et al. 1997), secreção de filamentos bissais que permitem fixação
firme a vários tipos de substratos e infraestruturas (Berkman et al. 2000; Peyer et al. 2009),
ampla tolerância térmica (Locklin et al. 2020) e a capacidade de suportar transporte,
secagem, baixos níveis de oxigênio e condições alimentares mínimas (Kinzelbach 1992;
Ricciardi et al . 1995; Baines et al. 2007; Snider et al. 2014; Doll 2018). Sua introdução
acidental nos Grandes Lagos da América do Norte provavelmente ocorreu por meio de
navios transoceânicos (especificamente, descarga de água de lastro), com ZM observado
pela primeira vez em 1988 (Lake St. Clair; Hebert et al. 1989) e QM em 1992 (Lake Ontario;
May e Marsden 1992). Desde então, as populações de QM-ZM se espalharam por grande
parte dos Estados Unidos (EUA) e do centro-sul ao sudeste do Canadá através de vias
navegáveis contíguas, embora o transporte humano terrestre também tenha contribuído
para introduções em locais disjuntos (Johnson e Carlton 1996; Johnson e outros 2001, 2006).
Em 2007, QM-ZM foram detectados pela primeira vez no oeste dos EUA em três lagos
da bacia do rio Colorado. Esta descoberta – e outras semelhantes (por exemplo, deteções
de QM-ZM perto das cabeceiras da bacia do rio Columbia em 2016) – indicou uma
extensão para o oeste da frente de invasão norte-americana e levou ao desenvolvimento
de várias iniciativas destinadas a prevenir, conter e controlar a disseminação contínua de
QM-ZM. As iniciativas incluíram o Plano de Ação do Mexilhão Quagga-Zebra para Águas
Ocidentais de 2010 (QZAP 2010), a 100ª Iniciativa Meridiana de 2011 (Serviço de Pesca e
Vida Selvagem dos Estados Unidos 2011) e a Iniciativa de Salvaguarda do Oeste de 2017
(Departamento do Interior dos Estados Unidos 2017) . Essas iniciativas aumentaram a
coordenação e padronização de medidas preventivas, ações, protocolos e políticas em
diferentes jurisdições e agências (inclusive nos níveis Nacional, Federal, Estadual e Tribal),
com contribuições de várias partes interessadas. Todas as iniciativas pediam o aumento
da vigilância estratégica, incluindo o monitoramento proativo de corpos d'água de alto risco.
Na iniciativa mais recente, as pesquisas de DNA ambiental (eDNA) foram listadas como
ações prioritárias de monitoramento QM-ZM, com a hipótese de melhorar a vigilância por
meio do aumento da probabilidade de detecção precoce (Departamento do Interior dos Estados Unidos 2
DNA ambiental é um termo comumente usado para descrever material genético
depositado ou derramado no meio ambiente por organismos vivos e pode incluir tanto extracel-
Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 119
DNA lular e intracelular (Ficetola 2008; Jerde et al. 2011; Thomsen e Willerslev 2015). Em sua definição
mais ampla, o eDNA também pode abranger o DNA na forma de organismos microscópicos inteiros (por
exemplo, bactérias, vírus, fitoplâncton, QM-ZM veligers) capturados durante a amostragem ambiental
(Pawlowski et al. 2020). As etapas envolvidas em uma pesquisa de eDNA normalmente incluem: 1)
amostragem de um habitat de interesse (geralmente, águas doces ou marinhas) onde uma espécie-alvo é
suspeita ou tem o potencial de estar presente e, em seguida, 2) submeter a amostra coletada a ensaios
moleculares sensíveis, projetados especificamente para detectar DNA da espécie-alvo, se presente.
Esses ensaios são tipicamente baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), com a precisão da
detecção muitas vezes confirmada subsequentemente por meio do sequenciamento de DNA Sanger
padrão de todos ou de um subconjunto de produtos de PCR resultantes. Com o eDNA, a detecção precisa
e confiável de um organismo específico (isto é, confiança na detecção) requer adesão a medidas de
controle de qualidade de garantia de qualidade (QA-QC), bem como o uso de ensaios de alta qualidade
rigorosamente controlados. Discussões detalhadas descrevendo o QA-QC necessário para esforços de
vigilância baseados em eDNA, bem como diretrizes para desenvolver e validar ensaios de eDNA, estão
disponíveis em Goldberg et al. (2016) e Klymus et al. (2020a).
A capacidade de detectar e/ou identificar organismos em uma amostra ambiental, com base apenas
no DNA dessa amostra, não é nova. Na verdade, as técnicas de eDNA têm sido usadas em estudos de
DNA microbiano e antigo por mais de duas décadas (para revisões, consulte Pawlowski et al. 2020 e
Pedersen et al. 2015, respectivamente). A aplicação da amostragem de eDNA para fins de vigilância de
AIS é, no entanto, comparativamente mais recente. Ele fez sua estreia como uma nova técnica em 2008,
quando amostras de eDNA da água da lagoa se mostraram úteis para detectar rãs americanas invasoras
(Lithobates catesbeianus;
Ficetola et ai. 2008). Desde então, a amostragem de eDNA tem sido amplamente adotada como uma
ferramenta de monitoramento de AIS, muitas vezes superando os métodos tradicionais de pesquisa para
espécies aquáticas difíceis de detectar, incluindo QM-ZM (por exemplo, De Ventura et al. 2017; Gingera et
al. 2017; Sepulveda et al. 2017; al. 2019; Blackman et al. 2020a).
O material genético de interesse na maioria das pesquisas moleculares é o DNA. Métodos semelhantes
direcionados ao RNA (eRNA) estão surgindo, no entanto, com ênfase particular na vigilância de AIS em
água de lastro/porão (por exemplo, Pochon et al. 2017). Evidências recentes de QM-ZM (Marshall et al.
2021) apoiam notavelmente as hipóteses (Barnes e Turner 2016; Cristescu 2019) de que pelo menos
certos tipos de RNA se degradam mais rapidamente do que o DNA em matrizes ambientais. Como tal, o
eRNA pode ser um complemento atraente para o eDNA na medida em que potencialmente oferece
discriminação aprimorada entre detecções de AIS originadas de fontes contemporâneas (isto é, organismos
vivos/recém-vivos, presentes localmente) e detecções de AIS resultantes de relictual, não local ou transiente
fontes. Independentemente do alvo (DNA vs. RNA), as pesquisas de base molecular são extremamente
sensíveis (por exemplo, limites inferiores de detecção de qPCR para QM-ZM podem ser tão baixos quanto
três cópias de genes por µl; Sepul veda et al. 2020a) e capazes de detectar até mesmo quantidades
mínimas de DNA/RNA alvo.
Embora isso os torne suscetíveis a contaminação potencial (ou seja, detecções de falsos positivos),
reiteramos que ensaios de alta qualidade e adesão cuidadosa às medidas QA-QC (no campo e no
laboratório) garantem a confiança na detecção. A especificidade e a sensibilidade robustas resultantes
tornam os levantamentos de base molecular particularmente úteis ao longo das frentes de invasão
120 Sheena M. Feist e Richard F. Lance/NeoBiota 66: 117–159 (2021)
onde a abundância de QM-ZM pode ser baixa. As detecções precoces desempenham um

papel crítico na gestão QM ZM, aumentando a probabilidade de erradicação e, assim, ajudando
a prevenir a propagação (Wimbush et al. 2009; Counihan e Bollens 2017).
Várias tecnologias e protocolos de base molecular foram empregados em pesquisas QM
ZM eDNA e existem inúmeras publicações detalhando esses esforços. Melhorias nos métodos
de eDNA foram feitas ao longo do caminho para superar os desafios apresentados por amostras
ambientais complexas e impuras. Melhorias metodológicas incluem protocolos refinados para
isolamento e extração de eDNA, reagentes aprimorados para combater a inibição da PCR e
requisitos de design de primer mais rigorosos (Wil cox et al. 2013; Hinlo et al. 2017; Lance e
Guan 2020). Além disso, foram desenvolvidos métodos aprimorados usando plataformas
altamente sensíveis, como PCR quantitativo (qPCR), PCR digital de gotículas (ddPCR),
sequenciamento de alto rendimento (HTS) e máquinas portáteis de campo, permitindo a
quantificação, sequenciamento paralelo maciço e rápida vigilância no local do eDNA,
respectivamente. Embora cada abordagem forneça algum nível de precisão de detecção para
QM-ZM eDNA (ou seja, levando em consideração taxas de detecções imperfeitas ou falso
positivo/falso negativo) e, portanto, algum nível de inferência confiável quanto à presença
provável de QM-ZM , existem vantagens/desvantagens que tornam cada abordagem mais
adequada para diferentes aplicações, questões e/ou esquemas de amostragem. Como tal, é
necessária uma revisão do conhecimento atual e uma síntese da informação relativa a estes
vários métodos.
Aqui, fornecemos uma revisão da literatura QM-ZM eDNA, discutindo como o conhecimento
(Tabela 1) e a metodologia evoluíram ao longo do tempo (Fig. 1). Encerramos discutindo
lacunas científicas e aplicadas críticas, que requerem atenção adicional ou investigação para
avançar na vigilância QM-ZM baseada em moléculas e inferências nelas. A revisão é destinada
a profissionais de eDNA de todos os níveis. Consequentemente, foi escrito para ser
compreendido por grandes audiências, incluindo especialistas não moleculares (por exemplo,
gerentes de AIS) interessados em implementar pesquisas de eDNA. Para ajudar na
compreensão dos leitores, fornecemos um glossário de termos e abordagens comuns de eDNA (Tabela 2).
Estudos até o momento
Nesta seção, abordamos a história do desenvolvimento e uso de métodos moleculares para

detectar a provável presença de QM-ZM em um corpo d'água amostrado. A seção é amplamente
organizada por tipo de tecnologia, com uma subseção dedicada a tipos de alvos moleculares
(incluindo eDNA vs. eRNA). A ordem segue o progresso geral nas técnicas QM-ZM eDNA,
incluindo avanços associados no conhecimento de eDNA e/ou métodos de amostragem de
eDNA.
A literatura citada e revisada foi adquirida de duas maneiras. Em 8 de maio de 2020,
realizamos uma pesquisa no Google Scholar por literatura relevante, usando as seguintes
palavras-chave em combinação com “quagga mexilhão”, “zebra mexilhão” e/ou “Dreissena”:
ddPCR, eDNA, DNA ambiental, HTS, metabarcoding , NGS, PCR, qPCR, RNA. Em 21 de maio
de 2020, enviamos uma solicitação de literatura (para incluir documentos não publicados e/ou
literatura cinzenta) de membros do Grupo de Trabalho de eDNA do Governo
Tabela 1. Descobertas resumidas e destaques importantes da literatura revisada de DNA ambiental (eDNA) de
mexilhão quagga e mexilhão zebra (QM-ZM), demonstrando a evolução dos métodos e conhecimento de
eDNA ao longo do tempo. Nós nos concentramos em insights obtidos via qPCR e HTS, pois essas duas
tecnologias dominaram os empreendimentos QM-ZM eDNA e forneceram uma grande quantidade de avanços.
Citação Digite descobertas significativas e outros destaques

Tucker (2014) qPCR • Otimização dos métodos de extração necessária
• Os primers específicos da espécie precisam ser desenvolvidos
Bollens et ai. qPCR • A multiplexação qPCR pode afetar negativamente a sensibilidade de detecção, indicando a importância da otimização
(2015)
Peñarrubia et al. qPCR • A amostragem de outono aumenta o sucesso da detecção, provavelmente como resultado da alta presença de veliger após a primavera
(2016) estação reprodutiva de verão
• Os níveis de infestação podem ser estimados usando qPCR

Amberg e qPCR • Projetou 1 ensaio de COI específico para ZM, onde os primers são QM-ZM genéricos, mas a sonda é específica para ZM, com
Merkes (2016); especificidade do ensaio testado contra 27 táxons não-alvo
Amberg et ai. • O sucesso da detecção aumentou quando a amostragem de eDNA ocorreu em profundidades maiores e acima de substratos macios
(2019)
Gengibre et al. qPCR • 3 ensaios projetados: 2 específicos de ZM (CytB e COI), 1 QM-ZM genérico (16S), com especificidade de ensaios testados contra 10
(2017) espécies não-alvo
• A multiplexação qPCR afeta negativamente a sensibilidade
• A amostragem de outono aumenta o sucesso da detecção, talvez devido às consequências da atividade de desova (presença
de veliger)
• A amostragem da primavera diminui o sucesso da detecção potencialmente devido ao inverno QM-ZM morrer e aumentar a diluição
do derretimento da neve
DeVentura et al. cPCR, • Desempenho semelhante de qPCR e PCR convencional (cPCR), mas com cPCR sendo potencialmente menos qPCR
(2017) suscetível a falsos positivos (devido à baixa sensibilidade) • A
concentração de eDNA em amostras de campo se correlaciona bem com densidades conhecidas de mexilhão usando qPCR
• Experimentação de mesocosmo recomendada para entender melhor como as variáveis ambientais e a presença de veliger influenciam
as estimativas de concentração de eDNA
Sepúlveda et ai. qPCR • A modelagem de ocupação multiescala indicou que uma alta probabilidade de detecção era possível com levantamentos de eDNA,
(2019) independentemente da estação, quando esforços de amostragem substanciais e adequados foram realizados (14 a 34 réplicas por
local de eDNA, dependendo da estação)
• A amostragem de verão provou ser a mais eficiente e exigiu o menor número de repetições para alcançar alta probabilidade de detecção
(provavelmente devido à desova)
Shogren et ai. qPCR • As variáveis ambientais, bem como as taxas de eDNA derramadas e decaídas, complicam as estimativas baseadas em qPCR de biomassa/
(2019) abundância
Sepúlveda et ai. qPCR • A comparação round robin de 5 ensaios qPCR baseados em sondas específicas de QM-ZM revelou alta reprodutibilidade (2020a)
e repetibilidade (ou seja, confiabilidade) nos resultados em diferentes laboratórios de eDNA, com o ensaio de melhor desempenho
identificado como DRE16S (específico para QM-ZM, Gingera et al. 2017) e com DRE2 (específico para ZM, Amberg et al. 2019)
identificado como potencialmente suscetível a falsos negativos
• Alertados contra estimativas de biomassa, com base em resultados de qPCR; as concentrações estimadas de DNA foram
impreciso e impreciso em amostras enriquecidas
Marshall e outros. qPCR • Proporção de eDNA:eRNA útil para avaliar o tempo desde a deposição em configurações de aquários controlados
(2021) • mRNA H2B representa um alvo útil para avaliar a presença recente (< 24 h) de QM-ZM ao vivo
• 16S e 18S rRNA de múltiplas cópias representam alvos úteis para detectar QM-ZM de baixa densidade
• Os padrões observados sugeridos podem ser mais complexos em ambientes naturais
Blackman e outros. cPCR, • O sucesso da detecção foi maior com cPCR e qPCR, mas com todos os métodos baseados em DNA superando qPCR, amostragem kick-
(2020a) net (advertência: HTS utilizou um iniciador de metabarcoding universal não específico para QM-ZM)
HTS • A densidade QM-ZM e a distância de amostragem afetam a detecção nos esforços de vigilância de eDNA
Klymus et ai. HTS • Metabarcode 16S específico para moluscos projetado
(2017) • A detecção baseada em HTS superou as pesquisas tradicionais
• As contagens de leitura HTS correlacionaram-se bem com as concentrações iniciais de DNA em amostras simuladas da
comunidade, indicando utilidade potencial para estimar a biomassa em amostras de eDNA usando métodos HTS
Prie e HTS • Metabarcode 16S específico para bivalves projetado
outros. (2020)
Marshall e HTS • Metabarcode COI específico do QM-ZM projetado
Stepien (2019) • Métodos permitidos para discriminação de QM-ZM, bem como avaliações de abundância relativa e diversidade genética
• Testes em aquários indicaram que as estimativas de biomassa foram mais precisas depois que QM-ZM ocupou os tanques por 7 a 14
dias
• A biomassa QM-ZM pode ser melhor estimada quando as amostras de eDNA são coletadas perto do fundo de um corpo d'água
Figura 1. Evolução dos métodos de DNA ambiental do mexilhão quagga e do mexilhão zebra (QM-ZM) ao longo
do tempo. Numerosas tecnologias têm sido usadas para amplificar e detectar o DNA de QM-ZM contido em
amostras ambientais. Os tipos de tecnologia incluem métodos baseados em nanopartículas (ou seja, nanotubos
de carbono ou espectroscopia de transmissão de luz, CNT/LTS), PCR convencional (cPCR), PCR digital de
gotículas (ddPCR), sequenciamento de alto rendimento (HTS), amplificação mediada por loop (LAMP), PCR
quantitativo (qPCR) e métodos comparativos. Aqui, podemos ver que os métodos evoluíram ao longo do tempo,
com qPCR e HTS atualmente dominando o campo e com o surgimento do ddPCR.
(GEDWG). Este grupo de trabalho baseado na América do Norte é composto por praticantes
de eDNA de instituições federais, estaduais, locais e não governamentais (por exemplo,
universidades), vários dos quais conduziram estudos QM-ZM eDNA. No total, 23 documentos
foram adquiridos em ambas as vias e incluídos nesta revisão.
Estudos iniciais de DNA usando amostras inteiras
Abordagens de base molecular têm auxiliado no esforço de combater a colonização e

disseminação de QM-ZM, fornecendo um mecanismo para detecção precoce sensível e
confiável. Os esforços iniciais começaram com foco na identificação molecular e na avaliação
da diversidade genética dentro de espécimes QM-ZM inteiros coletados em águas
contaminadas. Os métodos são revisados em Marsden et al. (1996), mas, em resumo, esses
primeiros estudos usaram análises baseadas em eletroforese livres de PCR (isto é, aloenzimas)
para discriminar individualmente entre QM-ZM adultos morfologicamente semelhantes (e às
vezes não identificados), mais comumente coletados por arrasto. Logo depois, a técnica baseada em PCR c
Revisão da literatura de eDNA de Dreissenid (QM-ZM) 123
Tabela 2. Glossário de termos relevantes para (e explicados especificamente para) aplicações de DNA ambiental
(eDNA). Os termos são agrupados de acordo com diferentes alvos moleculares, fontes de DNA e tipos de tecnologia.
Termos relevantes para a validação de métodos eDNA e desafios comuns de eDNA também são fornecidos.
Prazo Definição
alvos moleculares
eDNA DNA Ambiental. Material genético encontrado em uma amostra ambiental (por exemplo, ar, água, solo). Pode incluir DNA extracelular e DNA intracelular, DNA
derramado de organismos vivos ou mortos e, às vezes, DNA de organismos microscópicos inteiros (por exemplo, véligers de mexilhão).
eRNA RNA Ambiental. Semelhante ao eDNA, exceto que o RNA é a molécula alvo.
Fontes de eDNA
relíquia ou legado eDNA de fontes não vivas, por exemplo, de carcaças em decomposição ou presas em sedimentos.
não local eDNA de outro local depositado no ambiente local por outra fonte, como um predador ou contaminação por esgoto. Às vezes referido como
eDNA alóctone.
transiente eDNA depositado por uma espécie-alvo que não está mais presente no sistema, como ocorre com um indivíduo em migração.
extracelular eDNA não encapsulado dentro de uma célula, às vezes também chamado de DNA nu, comprometido por membrana ou flutuante. Prevê-
se que se degrade mais rapidamente do que o eDNA intracelular.
intracelular eDNA dentro de uma célula. Previsto para degradar mais lentamente do que o DNA extracelular.
mtDNA DNA mitocondrial. DNA circular encontrado nas mitocôndrias. Alvo comum de eDNA, devido à suposta alta concentração e longa persistência.
nuDNA ADN nuclear. DNA linear encontrado dentro do núcleo de cada célula. Alvo de eDNA menos comum que o mtDNA.
As abreviaturas usadas em outros lugares incluem nDNA, ncDNA.
Tecnologias usadas para amplificar eDNA

PCR Reação em Cadeia da Polimerase. Método usado para amplificar o DNA em um padrão cíclico, normalmente envolvendo três etapas:
desnaturação (separa o DNA de fita dupla), recozimento (os primers de PCR se ancoram na região alvo do DNA, se encontrada na amostra) e
alongamento ou extensão (a Taq polimerase sintetiza novos cadeias de DNA, complementares à sequência a jusante dos primers recozidos). As
etapas são alcançadas dentro de um termociclador, usando aquecimento e resfriamento cíclicos, onde a amplificação é normalmente permitida
para passar por 25 a 50 iterações de ciclo.
cPCR PCR convencional. A PCR convencional é a forma mais antiga e simples de PCR. Ele fornece detecção de ponto final, onde a amplificação
bem-sucedida do DNA é observada (como bandas na eletroforese em gel) após a conclusão da reação.
Por esse motivo, o cPCR também costuma ser chamado de PCR de ponto final. Os produtos amplificados geralmente passam pelo
sequenciamento de Sanger para confirmar que a sequência de DNA associada corresponde à do alvo pretendido.
qPCR PCR quantitativo. Método de PCR que incorpora química fluorescente para obter detecção quantitativa em tempo real de DNA
amplificado. A quantificação relativa é obtida por meio de comparações com curvas padrão.
Sanger Método usado para ler o padrão de nucleotídeos (“sequência”) dentro de amplicons de PCR (ou seja, produtos de PCR amplificados).
sequenciamento Frequentemente usado para verificar a identidade de amostras de eDNA positivas e para garantir que o produto amplificado represente o
organismo alvo.
HTS Sequenciamento de alto rendimento. Também conhecido como sequenciamento de próxima geração (NGS). Método que permite o
sequenciamento massivo e paralelo de numerosos fragmentos de DNA (isto é, produtos de PCR). Em aplicações de eDNA, iniciadores
de metabarcoding são freqüentemente usados para gerar simultaneamente amplicons para HTS.
ddPCR PCR digital de gotículas. Forma avançada de qPCR, na qual a quantificação absoluta é obtida dividindo as amostras em gotículas
individuais por meio da tecnologia de emulsão água-óleo.
CNT/LTS Nanotubos de carbono e espectroscopia de transmissão de luz. Métodos de amplificação e detecção de eDNA empregando materiais de
nanotubos.
LÂMPADA Amplificação isotérmica mediada por loop. Um método no qual o DNA é amplificado em uma única temperatura (ao contrário da PCR, que requer
mudanças cíclicas de temperatura). Requer uma polimerase única (Bst, em vez de Taq) e o uso de vários primers específicos da espécie
(normalmente 6) para criar o loop de amplificação.
Oligonucleótido Fita curta e simples de DNA/RNA sintético. Comumente usado em PCR.

cartilha Oligonucleotídeo que complementa e se liga ao DNA/RNA alvo na PCR, iniciando a amplificação de um fragmento de DNA/RNA selecionado.
Cada reação de PCR requer pelo menos dois primers (ou um conjunto), normalmente chamados de primer direto e primer reverso.
Sonda Oligonucleotídeo marcado com fluorescência usado em qPCR para aumentar a especificidade da reação. Empregado simultaneamente
com primers direto e reverso específicos da espécie, visando um terceiro fragmento específico da espécie dentro do amplicon pretendido.
Cria a fluorescência em aplicativos qPCR baseados em sonda.
Ensaio Nesta publicação, usamos ensaio para nos referir à combinação de primer e sonda usada em aplicações qPCR eDNA baseadas em sonda.
primers Sinônimo de primers de código de barras. Um conjunto de primers reconhecido pela ampla cobertura taxonômica, capaz de amplificar o DNA de
universais vários táxons diferentes. Freqüentemente usado para fins de identificação de espécies, mas onde o DNA é frequentemente amplificado de um
único organismo. Normalmente combinado com sequenciamento Sanger.
Prazo Definição
Iniciadores de Semelhante aos primers universais (código de barras), mas especificamente otimizado para uso em sequenciamento de amplicon HTS
metabarcoding (“metabarcoding”). Comumente usado para amplificar o DNA presente em amostras em massa e/ou eDNA, resultando em muitos amplicons de
PCR que representam vários táxons diferentes. Normalmente visam fragmentos de DNA mais curtos do que primers universais (código de barras).
Metabarcoding Um aplicativo HTS. O sequenciamento (simultâneo) de um produto de PCR contendo uma mistura de fragmentos de DNA amplificados
(“amplicons”), em que os amplicons são gerados usando iniciadores de metabarcoding e representam o DNA de organismos-alvo encontrados em
amostras em massa e/ou eDNA. Análises bioinformáticas subseqüentes são necessárias para avaliar a composição das espécies.
Termos relevantes para validação de método
Uma amostra experimental na qual a amostra contém uma mistura de moldes de DNA alvo em concentrações conhecidas e/ou de uma composição
Comunidade simulada conhecida. Amostra é criada para imitar a composição de espécies presentes em amostras ambientais. Frequentemente usado para avaliar a
sensibilidade e a especificidade dos pares de iniciadores de metabarcoding HTS.
Amostra enriquecida Uma amostra experimental na qual o DNA alvo (seja derivado de tecido ou, mais frequentemente, sintético) é adicionado em uma concentração conhecida.
Amostras cravadas podem ser usadas em diferentes estágios do fluxo de trabalho do eDNA e são frequentemente empregadas para testar a confiabilidade
dos métodos de eDNA.
Qualidade Um conjunto de protocolos, medidas e diretrizes para garantir resultados de eDNA de qualidade (incluindo reprodutibilidade e repetibilidade).
Garantia Por favor, consulte Goldberg et al. (2016) para uma lista detalhada específica para pesquisas de eDNA.
Controle de qualidade
(QA-QC)
Em sílico Método usado para avaliar a especificidade de primers e/ou ensaios de eDNA. Normalmente representa a primeira etapa de validação, onde as
sequências de primer/ensaio para as espécies alvo são comparadas com as sequências não-alvo (e frequentemente relacionadas e/
ou co-ocorrendo) espécies usando dados disponíveis de repositórios de DNA (por exemplo, NCBI's Genbank).
Em vitro Método usado para avaliar a especificidade e sensibilidade de primers e/ou ensaios de eDNA. Tipicamente representa a segunda etapa de
validação, onde a amplificação por PCR é tentada para espécies alvo e não alvo usando primers/ensaios determinados como específicos da espécie
durante o teste in silico. O DNA usado na PCR geralmente é coletado de forma invasiva (isto é, extraído de tecidos).
No local Método usado para avaliar a especificidade e sensibilidade de primers e/ou ensaios de eDNA. Normalmente representa a terceira (e final) etapa de
validação, onde iniciadores/ensaios específicos da espécie que passam in silico e testes in vitro são empregados usando amostras de eDNA coletadas
de locais onde se sabe que a espécie-alvo ocorre e onde a espécie-alvo é conhecida. ausente. Garante que os ensaios funcionem conforme pretendido,
com detecções positivas em locais ocupados e sem detecções (ou seja, falsos positivos) em locais desocupados. O sucesso indica que os primers/
ensaios estão prontos para aplicação em campo, onde a presença/ausência da espécie-alvo é desconhecida.
Limites de LOD abreviado. Uma medida de sensibilidade. Necessário para distinguir de forma confiável as detecções das não detecções em aplicativos qPCR e
detecção ddPCR. LOD representa a menor concentração de eDNA na qual 95% das réplicas técnicas amplificam (ou seja, são detectadas), com base em
uma diluição em série do DNA alvo. Detecções de falsos negativos podem ocorrer em concentrações abaixo do LOD. Para diretrizes/discussões
relevantes, consulte Bustin et al. (2009) e Klymus et al. (2020b).
Limites de LOQ abreviado. Determina a precisão da quantificação (ou seja, capacidade de quantificar o número de cópias de eDNA). A menor concentração de
quantificação eDNA na qual as amostras podem ser quantificadas de forma confiável usando qPCR ou ddPCR. Com base em uma diluição serial do DNA alvo, onde o
coeficiente de variação é inferior a 35%. Concentrações abaixo do LOQ determinado não podem ser quantificadas com segurança. Para diretrizes/
discussões relevantes, consulte Klymus et al. (2020b).
Desafios encontrados
inibição de PCR Redução da eficiência da amplificação do DNA durante a PCR devido à presença de substâncias co-extraídas de amostras ambientais (por
exemplo, ácidos húmicos). A inibição da PCR pode contribuir para detecção imperfeita e quantificação imprecisa.
falsos negativos Falha em detectar eDNA do organismo alvo, mesmo quando o organismo alvo está presente no ambiente amostrado. Pode ser resultado,
entre outros fatores, de métodos de eDNA exibindo baixa sensibilidade, primers projetados inadequadamente que não conseguem amplificar o DNA do
táxon alvo, baixa tolerância a inibidores de PCR e/ou protocolos de amostragem ruins (design, tempo, replicação).
Falso-positivo Detecção errônea do organismo alvo quando o organismo alvo está ausente do ambiente amostrado.
Pode ser causada pela amplificação de organismos não-alvo (baixa especificidade do ensaio) ou por contaminação cruzada (insuficiente QA-QC,
protocolos de laboratório e de campo). Para nuances importantes sobre o termo “falso positivo”, consulte Darling et al. (2021).
Primer de PCR/ Amplificação preferencial de DNA de espécies mais abundantes ou de espécies cujo DNA contém menos incompatibilidades com a sequência
viés de amplificação do primer. Causa variação da eficiência de amplificação entre táxons. O viés do primer de PCR é especialmente problemático em HTS ao usar primers
de metabarcoding e leva a perdas na sensibilidade de detecção (ou seja, resultados falso-negativos) para algumas espécies e/ou incapacidade de
avaliar quantitativamente os resultados de eDNA.

Revisão da literatura de eDNA de Dreissenid (QM-ZM) 125
Prazo Definição
Tag hopping Problema de sequenciamento HTS no qual as leituras de sequência são atribuídas incorretamente às amostras. No fluxo de trabalho do
ou troca HTS, amostras individuais (dentro de uma amostra reunida) são identificadas por identificadores exclusivos, chamados de tag ou índice,
compostos de fragmentos de nucleotídeos curtos que são anexados às extremidades dos produtos de PCR durante a preparação da
biblioteca; às vezes, esses identificadores únicos são incompatíveis durante a preparação e/ou durante o sequenciamento em um processo
chamado tag-ou index-hopping. Como resultado, as leituras de sequência são combinadas com a amostra errada, confundindo os resultados
e aumentando potencialmente o risco de detecções de falsos positivos. Pode ser minimizado pela aplicação de pares únicos de índices
(“índices duplos”; um índice para cada extremidade do DNA modelo) em vez de apenas um único índice exclusivo para cada amostra.
eDNA O eDNA está sujeito a fatores bióticos e abióticos que contribuem para sua degradação. Decaimento refere-se à redução em
decair quantidades detectáveis de eDNA ao longo do tempo como resultado da degradação. A taxa de decaimento pode afetar o sucesso
da pesquisa de eDNA e deve ser considerada para interpretações além da presença/ausência.
(daqui em diante, cPCR) técnicas foram usadas para discriminar espécimes juvenis de ambas as
espécies que foram classificadas tentativamente, com base na morfologia (Claxton et al. 1997).
Aqui, os esforços se basearam no locus de código de barras do DNA mitocondrial (mtDNA)
comumente usado, citocromo c oxidase subunidade I (COI), usando primers universais reconhecidos
por sua ampla cobertura taxonômica (Folmer et al. 1994; Hebert et al. 2003). O trabalho subsequente
incorporou o design e o teste de conjuntos de primers específicos para espécies recém-
desenvolvidos, exclusivos para QM ou ZM. Esses primers específicos da espécie visaram uma
variedade de genes QM-ZM ( coi mitocondrial e genes 16S rRNA e um gene nuclear para 18S
rRNA) e foram usados como marcadores de diagnóstico para discriminar entre veligers larvais
microscópicos coletados por meio de estopas de plâncton. O DNA analisado em todos os métodos
foi adquirido de veligers QM-ZM inteiros. Os primeiros métodos exigiam uma etapa inicial para pré-
classificar e isolar individualmente os veligers encontrados nos estofos de plâncton (Claxton e Boulding 1998).
Métodos posteriores pularam esta etapa e utilizaram amostras de estopa não classificadas (Frischer
et al. 2002; Ram et al. 2011).
Esses estudos fundamentais forneceram o conhecimento e a metodologia necessários para a
identificação acelerada de dreissenídeos baseada em moléculas em todos os estágios da vida,
contornando assim a necessidade de raros conhecimentos taxonômicos. Além disso, as abordagens
baseadas em PCR estavam se mostrando muito mais sensíveis do que as técnicas mais tradicionais.
Por exemplo, Frischer et al. (2002) desenvolveram um método cPCR (direcionando um gene
nuclear para 18S rRNA) que identificou e detectou especificamente veligers ZM microscópicos em
amostras em massa contendo matrizes diversas e não classificadas de espécies planctônicas inteiras.
Este método baseado em cPCR não só foi capaz de discriminar entre numerosos táxons (incluindo
outros bivalves invasores, por exemplo, QM e amêijoa asiática de água doce, Corbicula fluminea),
como sua capacidade de detecção foi estimada em “300 vezes mais sensível do que a luz de
polarização cruzada microscopia” (Frischer et al. 2002). No entanto, uma década depois, Frischer
et al. (2012) observaram baixa sensibilidade usando os mesmos métodos baseados em cPCR,
onde os veligers frequentemente não eram detectados. Observações em Frischer et al. (2012) e
Hosler et al. (2017) revelou que os resultados de detecção, baseados em PCR, podem ser
significativamente afetados pela experiência em técnicas moleculares, incluindo familiaridade com
métodos apropriados de preservação de amostra/DNA. No entanto, essas descobertas iniciais,
baseadas em espécimes inteiros, abriram caminho para empreendimentos de vigilância QM-ZM
mais complexos utilizando amostragem de eDNA.
Estudos iniciais do tipo eDNA
Indo além de espécimes inteiros e amostras em massa, Carmon et al. (2014) demonstraram a detecção
bem-sucedida de QM eDNA flutuante manipulado em laboratório em amostras de água, culminando
vários anos de pesquisa conduzida pelo mesmo laboratório (por exemplo, ver Keele et al. 2013 e
protocolos/referências). Aqui, os autores usaram primers COI desenvolvidos por Keele et al. (2013) e
cPCR combinado com sequenciamento de primeira geração (ou seja, Sanger) para confirmar a
especificidade dos produtos de PCR amplificados. Esses primeiros iniciadores de eDNA e outros (por
exemplo, Frischer et al. 2002), têm como alvo fragmentos de DNA relativamente longos (geralmente >>
300 pb). A orientação otimizada agora sugere que os primers de eDNA devem ter como alvo fragmentos
de DNA < 250 pb (por exemplo, Klymus et al. 2020a), pois fragmentos menores são mais prováveis de
serem detectados em amostras altamente degradadas e/ou eDNA (Thomsen e Willerslev 2015). Ainda
assim, neste estudo experimental, a detecção baseada em eDNA foi mais sensível do que os métodos
de detecção tradicionais (especificamente, microscopia de luz), especialmente quando os veligers
sofreram degradação estrutural (ou seja, passaram por um processo de batimento de esferas ou
exposição a uma solução ácida) antes do eDNA amostragem e PCR. No entanto, os autores notaram
uma alta prevalência de falsos negativos em suas amostras experimentais de eDNA (Carmon et al.
2014), onde mexilhões estavam presentes, mas seu DNA não foi detectado. Essas descobertas
indicaram que otimizações adicionais eram necessárias para amostragem, processamento e análises
de QM ZM eDNA para obter maior sucesso na detecção.
PCR convencional
Saindo do laboratório e entrando em águas infestadas, Lance e Carr (2012) associaram cPCR
(direcionamento 18S; Frischer et al. 2002) e sequenciamento de Sanger confirmatório com um pré-
tratamento de propidium monoazida (PMA). A monoazida de propídio é um corante fotorreativo que se
liga ao DNA e subsequentemente inibe a PCR, mas é incapaz de permear as membranas celulares
(Nocker et al. 2007; Bae e Wuertz 2009). Como o PMA não pode se infiltrar em células intactas, previu-
se que o PMA poderia auxiliar na detecção direcionada de DNA de véligers inteiros, em oposição ao
eDNA (extracelular, flutuante) liberado de mexilhões adultos. Os resultados deste estudo piloto foram
positivos em que a captura e detecção de ZM eDNA foi demonstrada com sucesso usando amostras
de água coletadas de um ambiente natural infestado conhecido. No entanto, a capacidade do PMA de
discriminar entre veligers inteiros e eDNA extracelular não foi confirmada (ou seja, os resultados do
PMA foram inconsistentes com as expectativas). Desde então, o apelo da PMA diminuiu. As evidências
agora sugerem que o eDNA liberado de organismos vivos pode conter uma mistura de DNA ligado à
membrana (ou seja, intracelular) e DNA extracelular (Turner et al. 2014), tornando o tratamento com
PMA ineficaz para a detecção específica de veliger.
Tecnologias de nanopartículas: nanotubos de carbono e espectroscopia de transmissão de

luz
A maioria das tecnologias de eDNA requer alguma forma de PCR. Isso ocorre porque a PCR é eficaz
na amplificação de quantidades mínimas de DNA, de modo que possam ser prontamente detectadas em
análises a jusante. No entanto, alguns estudos iniciais de eDNA visavam eliminar a dependência
de PCR e, assim, melhorar a rápida vigilância QM-ZM no local (in situ) em lastro e/
ou águas do porto. Esses esforços se concentraram na aplicação de novos métodos de
hibridação de DNA e empregaram materiais de nanopartículas, usando uma das duas
tecnologias relevantes, chips de nanotubos de carbono microfluídicos (CNT, Mahon et al. 2011)
ou espectroscopia de transmissão de luz (LTS, Li et al. 2011; Egan et al. 2013, 2015; Mahon et al.
2013). Apesar dos objetivos de ser livre de PCR, todas as publicações incorporaram cPCR como
uma etapa inicial na detecção de eDNA QM-ZM, com a maioria utilizando primers universais de
invertebrados (Folmer et al. 1994) para fins de amplificação. A detecção de QM-ZM foi recebida
com sucesso misto. Por exemplo, na publicação mais recente do LTS, Egan et al. (2015)
amostraram águas sabidamente infestadas por ambas as espécies, mas só conseguiram detectar QM.
Publicações de acompanhamento, demonstrando detecção aprimorada e/ou CNT/livre de PCR
Avanços LTS, não surgiram. Uma explicação provável é que os custos associados às tecnologias
de nanopartículas são proibitivos para um maior desenvolvimento e aplicação generalizada. Ou,
talvez, os esforços de CNT/LTS sem PCR falharam em produzir resultados confiáveis de
detecção de QM-ZM. Posteriormente, as tecnologias CNT/LTS eDNA não foram amplamente
adotadas. Uma estratégia alternativa sem PCR surgiu mais recentemente para pesquisas de
eDNA QM-ZM e é descrita em uma subseção abaixo, onde a amplificação isotérmica mediada
por loop é detalhada.
PCR quantitativo
Em contraste com as análises finais de cPCR (Fig. 2), PCR quantitativo (qPCR) emprega
química fluorescente que produz curvas de amplificação de DNA que podem ser visualizadas
ou monitoradas durante a reação (Wittwer et al. 1997). Com qPCR, existem duas opções
químicas básicas: baseada em corante (por exemplo, SYBR Green) e baseada em sonda (por exemplo,
TaqMan; Heid et ai. 1996). A fluorescência é alcançada de forma diferente com cada um. A Fig.
2 ilustra essas diferenças básicas, mas para uma revisão mais completa e informações
relevantes, ver Arya et al. (2005). É importante notar que o qPCR baseado em sonda é
frequentemente preferido para aplicações de eDNA (Herder et al. 2014), pois atinge maior
especificidade através do uso de um terceiro oligonucleotídeo ("sonda") marcado com
fluorescência, específico do alvo. em oposição ao qPCR baseado em corante, que utiliza uma
química fluorescente que se liga não especificamente a qualquer DNA de fita dupla presente na
reação, potencialmente produzindo detecções de falsos positivos, se o DNA de organismos não-
alvo for amplificado (Marmiroli e Maestri 2007).
Em qPCR, a fluorescência aumenta ao longo da duração da reação e reflete a quantidade
de DNA amplificado em cada ciclo (Higuchi et al. 1992, 1993). Assim, as curvas de amplificação
qPCR podem ser usadas para quantificar indiretamente a quantidade original (ou concentração
inicial) de DNA-alvo presente em uma amostra de eDNA usando comparações com uma curva
padrão (Takahara et al. 2012). Essas curvas padrão são geradas a partir de modelos de DNA
diluídos em série, de concentração conhecida (e frequentemente sintéticos; Conte et al. 2018)
(Fig. 2). Uma vantagem do qPCR, então, comparado ao cPCR, é que ele não apenas fornece
um mecanismo para inferir a presença/ausência de táxons-alvo, mas também fornece o potencial
para estimar a abundância de táxons (ou seja, densidade relativa ou biomassa,
Figura 2. Descrições detalhadas de estratégias de amplificação de DNA ambiental (eDNA) comuns e emergentes
de mexilhão quagga e mexilhão zebra (QM-ZM). PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento de alto rendimento
(HTS) representam as tecnologias mais comumente usadas em estudos de eDNA de mexilhão quagga e zebra. A
PCR digital de gotículas (ddPCR), uma forma avançada de qPCR, é uma técnica emergente com popularidade
que provavelmente aumentará devido à sua alta tolerância aos inibidores de PCR, melhor quantificação e
sensibilidade observada. Aqui, detalhamos as especificidades de cada técnica, destacando como ocorre a detecção
e quantificação com cada uma. As cores representam três amostras hipotéticas de DNA ambiental (eDNA), em três
réplicas técnicas (ou seja, laboratório, amplificação). Os símbolos positivos representam a detecção de eDNA. Os
símbolos negativos não representam detecção de eDNA. A PCR convencional (cPCR) é uma tecnologia
fundamental que deu origem a outras estratégias de amplificação. Não é mais uma abordagem comum de eDNA
(devido à baixa sensibilidade), mas a incluímos aqui para fins comparativos.
mas não números absolutos). Correlações entre essas métricas e concentrações estimadas de eDNA
foram encontradas (por exemplo, Thomsen et al. 2012; Pilliod et al. 2013), mesmo em QM-ZM
(Peñarrubia et al. 2016; De Ventura et al. 2017; Marshall et al. 2017; Marshall et al. . 2021).
Aconselha-se cautela, no entanto, pois a concentração de eDNA pode não escalar previsivelmente com
biomassa (Mauvisseau et al. 2019; Shogren et al. 2019; Sepulveda et al. 2020a). Para uma revisão e meta-
análise desta questão, consulte Yates et al. (2019), onde é sugerido que mais refinamento é necessário para
estimativas confiáveis de abundância baseadas em eDNA.
Em uma tentativa inicial de desenvolver marcadores qPCR para ZM, Tucker (2014) projetou um ensaio
COI baseado em sonda e testou-o quanto à especificidade contra QM não alvo e moluscos asiáticos (Corbicula
fluminea, doravante, Corbicula). Em ensaios utilizando cPCR, qPCR baseado em corante e qPCR baseado em
sonda, o autor descobriu que o ensaio não era específico de ZM, mas amplificou tanto QM quanto ZM. Além
disso, observou-se que o sucesso da detecção era inconsistente em amostras simuladas em laboratório,
semelhantes a eDNA (água do reservatório “semeada” com veligers ZM antes da extração do DNA). O autor
concluiu que, em estudos futuros, era necessária a otimização das técnicas de extração de eDNA e enfatizou
a importância do desenvolvimento de primers específicos para espécies para atingir os objetivos de manejo do
QM-ZM.
Passando para a detecção de qPCR baseada em campo, Bollens et al. (2015) projetou dois ensaios
qPCR multiplexados, específicos da espécie e baseados em sonda para QM e ZM. Uma reação multiplexada
emprega múltiplos ensaios em uma única PCR e, com otimização apropriada, permite a detecção de múltiplas
espécies (através da incorporação de vários ensaios específicos de espécie) e/ou múltiplos loci diferentes
direcionados a uma espécie de interesse (através da incorporação de vários ensaios direcionados a diferentes
genes); o último demonstrou aumentar o sucesso da detecção de eDNA (por exemplo, Lance e Guan 2019).
Ambos os ensaios desenvolvidos por Bollens et al. (2015) teve como alvo o locus citocromo B (CytB) do
mitogenoma, mas com um ensaio específico para ZM e outro específico para QM. Esses ensaios foram
planejados para uso na Bacia do Rio Columbia (CRB), EUA, que ainda não foi invadida por Dreis sena, mas
representa uma bacia hidrográfica altamente suscetível e monitorada regularmente. Curiosamente, um ensaio
adicional de eDNA para Corbicula (sabe-se que está estabelecido na Bacia Hidrográfica) foi simultaneamente
desenvolvido e utilizado pelos autores como um controlo metodológico positivo, estabelecendo assim a
implementação eficaz de todas as fases do levantamento de eDNA. A avaliação experimental indicou que o
ensaio Corbicula não poderia ser executado em multiplex com os ensaios QM-ZM, pois isso resultou numa
perda de sensibilidade de detecção para ZM. O ensaio Corbicula foi, posteriormente, executado separadamente
dos ensaios dreissenid.
Amêijoas asiáticas foram consistentemente detectadas em todos os locais amostrados durante o esforço de
pesquisa de eDNA, mas nem QM nem ZM foram detectados.
Até onde sabemos, o estudo de Bollens et al. (2015) Os ensaios de CytB ainda não foram testados em
águas conhecidas por terem infestações de QM ou ZM. A razão para isso não está clara.
Talvez seja porque faltam detalhes sobre a especificidade do ensaio, sem nenhuma informação fornecida
sobre como os ensaios foram avaliados para amplificação em espécies não-alvo potencialmente concomitantes
(por exemplo, in silico, in vitro). Em contraste, maior ênfase foi colocada na especificidade de QM-ZM durante
o desenvolvimento de ensaios qPCR QM-ZM baseados em sondas de ocorrência posterior (por exemplo,
Amberg e Merkes 2016; Gingera et al. 2017; Sepulveda et al. 2019), reunindo estes mais recente – e
comprovadamente mais específico – testa maior popularidade para implantação em pesquisas recentes. Sabe-
se que a incorporação da química qPCR baseada em sonda e testes completos de especificidade aumentam
a precisão da detecção de espécies-alvo, incluindo a redução do risco de falsos positivos e, assim, melhoram
a confiabilidade dos resultados de eDNA (por exemplo, Wilcox et al. 2013).
Enquanto isso, alguns autores estavam empregando métodos qPCR baseados em corantes.
Peñarrubia et al. (2016) publicaram um método qPCR baseado em corante visando o gene nuclear
H2B da histona de cópia única em QM-ZM (Tabela 3). O método provou ser bem sucedido na
detecção indiscriminada de ambos os mexilhões em sistemas lênticos espanhóis, com maior
sensibilidade de detecção observada do que um método de pesquisa tradicional baseado em
microscopia empregado simultaneamente. Além disso, Peñarrubia et al. (2016) implementaram
um esquema de amostragem pré e pós-estação de desova que, quando combinado com as
habilidades quantitativas proporcionadas pelo qPCR, forneceu novas descobertas para a dinâmica
específica da estação e do estágio de vida do eDNA de dreissenid. Especificamente, os resultados
do seu estudo indicaram que maiores quantidades de eDNA QM-ZM estavam presentes na
estação do outono, o que eles atribuíram ao aumento da presença de veliger após a desova bem-
sucedida no verão. Os autores tiraram duas conclusões importantes, ambas as quais influenciariam
as abordagens e interpretações de pesquisas posteriores: 1) o qPCR poderia ser usado para
estimar os níveis de infestação de QM-ZM através da quantificação do eDNA de Dressenid e 2) a
amostragem de eDNA de QM-ZM poderia ser otimizado ao capitalizar a atividade de desova, onde
as concentrações em massa de veliger fornecem amplas fontes de DNA.
Continuando com os esforços para refinar os protocolos de amostragem, Amberg e Merkes
(2016) e Amberg et al. (2019) forneceram uma comparação de múltiplas estratégias diferentes,
incluindo métodos que empregavam amostragem de diferentes níveis da coluna de água
(superfície, meia água e perto do fundo), amostragem de águas sobrepostas a substratos duros
ou moles (onde os mexilhões podem ou pode não assentar, respectivamente) e amostragem em
dois intervalos sazonais. Amostras foram coletadas em dois lagos diferentes, um onde ZM foi
densamente estabelecido e outro onde ZM foi invadido recentemente. As relações entre eDNA e
covariáveis ambientais (ou seja, profundidade e substrato) diferiram entre os dois lagos.
Geralmente, porém, os resultados indicaram que a concentração de eDNA ZM aumentou com a
profundidade e diminuiu no habitat suspeito (isto é, substratos duros). Para explicar esta
observação, os autores levantaram a hipótese de que o ZM eDNA se desloca e se instala em
seções mais profundas do lago, onde é menos suscetível à degradação e onde coincidentemente
existem sedimentos mais macios. Deve-se notar que, embora QM-ZM sejam filtradores, sua
atividade de filtragem não parece aumentar as taxas locais de degradação de eDNA (Mächler et
al. 2018).
O ensaio baseado em sonda desenvolvido e utilizado em Amberg e Merkes (2016; Amberg
et al. 2019) foi – segundo os autores – o primeiro deste tipo a ser validado quanto à especificidade
para ZM. O ensaio, DRE2 (Tabela 3) combina um conjunto de primers COI específicos para
dreissenid com uma sonda específica para ZM. Tem utilidade reconhecida em toda a região dos
Grandes Lagos, tendo sido analisado quanto à especificidade contra 27 espécies não-alvo de
peixes e mexilhões comuns na área. Foi posteriormente empregado em diversas publicações
(por exemplo, Sepulveda et al. 2019, 2020a; Shogren et al. 2019), mas com evidências que
sugerem que tem sensibilidade relativamente baixa (potencialmente devido à sua baixa
temperatura de recozimento) e, assim, apresenta um risco de resultados falsos negativos (Sepulveda et al. 2019
Três alternativas – e de alto desempenho (Sepulveda et al. 2020a) – ensaios baseados em
sonda desenvolvidos por Gingera et al. (2017) tornaram-se alguns dos ensaios qPCR mais usados
nos esforços de vigilância QM-ZM eDNA da América do Norte (por exemplo, Devlin
Tabela 3. Metacódigos de barras e ensaios comprovadamente eficazes para vigilância ambiental de DNA/RNA de
mexilhões quagga (D. rostriformis bugensis, QM) e zebra (D. polymorpha, ZM), restritos aos empregados e/
ou desenvolvido nos últimos cinco anos (desde 2016).
cartilha Alvos Sequência (5' a 3')

metabarcodes HTS
(ordenado por especificidade crescente)

Blackman e outros. (2020a); Mychek-Londer et al. (2020) (originalmente desenvolvido por Geller et al. 2013; Leray et al. 2013)
mICOIintF, Metazoários F: GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
jgHCO2198 COI R: TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
Ardura et ai. (2017) (originalmente desenvolvido por Geller et al. 2013)

jgLCO1490, Invertebrados Marinhos F: TITCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
jgHCO2198 COI R: TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
Brown et ai. (2016) (originalmente desenvolvido por Zhan et al. 2013)

Uni18S Crustáceos, Moluscos, Tunicados F: AGGGCAAKYCTGGTGCCAGC
18S R: GRCGGTATCTRATCGYCTT
Klymus et ai. (2017)

MOL16S moluscos F: RRWRGACRAGAAGACCCT
16S R: ARTCCAACATCGAGGT
Prié et al. (2020)

Vene01 bivalves F: CSCTGTTATCCCYRCGGTA
16S R: TTDTAAAAGCCGAGAAGACCC
Marshall e Stepien (2019)

COIA QM-ZM F: AGTGTTYTKATTCGTTTRGAGCTWAGKGC
COI R: GAYAGGTARAACCCAAAWCTWAC
Primers qPCR BASEADOS EM CORANTE
Peñarrubia et al. (2016)

H2B QM-ZM F: CGCGCGCTCCACTGACAAGA
H2B R: CACCAGGCAGCAGGAGACGC
De Ventura e cols. (2017) (originalmente desenvolvido por Bronnenhuber e Wilson 2013)

DbuCOI3 QM COI F: GGGGTTGAACATTATAYCCACCGTT
R: AAACTGATGACACCCGGCACG
DpoCOI3 ZM F: GCTAAGGGCACCTGGAAGCGT
COI R: CACCCCCGAATCCTCCTTCCCT
Blackman e outros. (2020a) (originalmente desenvolvido por Blackman et al. 2020b)

DRB1 QM COI F: GGAAACTGGTTGGTCCCGAT
R: GGCCCTGAATGCCCCATAAT
Marshall e outros. (2021)

16S QM-ZM F1: GTTAATAGCTGTGCTAAGGTAGC (amplicon longo)
16S F2: TGGGGCAGTAAGAAGAAAAAAATAA* (amplicon curto)
mtDNA, mt-rRNA R: CATCGAGGTCGCAAACCG*
*Gingera et al. (2017)

COI QM-ZM F: ATTTATCTCTTCATATYGGGGGAGC
COI R: CCAATAGAWGTRCARAACAAAGG
mtDNA, mt-mRNA
18S QM-ZM F: AACYCGTGGTGACTCTGGAC*
18S R: GTGTCTCATGCTCCCCTCTCC*
nuDNA, nu-rRNA *modificado de Williams et al. (2017)

H2B QM-ZM F1: CGCGCGCTCCACTGACAAGA* (amplicon longo)
H2B F2: TTGCCCACTACAACAAGCGA (amplicon curto)
nuDNA, nu-mRNA R: CACCAGGCAGCAGGAGACGC*
*Peñarrubia et al. (2016)
Ensaios qPCR BASEADOS EM SONDA
(onde as sondas são rotuladas como corante de fluoróforo 5' + supressor 3')
cartilha Alvos Sequência (5' a 3')

Gengibre et al. (2017)
DRE16S QM-ZM F: TGGGGCAGTAAGAAGAAAAAAATAA
16S Sonda: CCGTAGGGATAACAGC
Alt. Sonda*: AAAGTTACCGTAGGGATAACAGCGTTATCG
R: CATCGAGGTCGCAAACCG
*desenvolvido por Devlin e Youngbull (2019)

ZEBCOI ZM F: SCCTGCGATAGATTTTTTGATTTTA
COI Sonda: CGTGCTGGATGTCAT
R: GCAGAACAAAGGGACCCG
ZEBCYT ZM F: CATTTTCTTATACCTTTTATTTTATTAGTGCTTTT
CytB Investigação: TAGGTTTTCTTCATACTACTGGC

R: CGGGACAGTTTGAGTAGAAGTATCA
Amberg et ai. (2019)

DRE2 ZM F: TGGGCACGGGTTTTAGTGTT
COI Sonda: CGTCCCTTGGTG
R: CAAGCCCATGAGTGGTGACA
Sepúlveda et ai. (2019)

DREQM QM F: CTCTTCATATCGGTGGAGCTTC
COI Sonda: CCCGGCACGTATATTTCCTCATGTT
R: CAAAGGCACCCGATAAAACTG
Primers LAMP
Williams e outros. (2017)
QM-ZM FIP: TGAAAGATACGTCGCCGGCGAACTCGTGGTGACTCTGGAC
18S BIP: TGCCTACCATGGTGATAACGGGTGTCTCATGCTCCCCTCTCC
LF: GTGCGATCGGCACAAAAGTT
LB: TAACGGGGAATCAGGGTTCG
F3: GTTAGCCCAGACCAACGC
B3: CTTCCTTGGATGTGGTAGCC
ZM FIP: AGAGACAGGTAAAACCCAAAAACTAATTGATTGGTACCAATAATACTGAG
COI BIP: ATTTTGTTCAGCTTTTAGGGAAGGAAAAATCTATCGCAGGGCC
LF: CGAGGGAAACCTATATCAGGAAGA
LB: GGATTCGGGGGTGTGTTGAACC
F3: TAATGGGGGGATTCGGAA
B3: GCTCCCCCAATATGAAGAG
QM FIP: AAGAAGCTCCACCGATATGAAGAGCCACCGTTATCCAGGATT
COI BIP: AGAACATGAGGAAATATACGTGCCCACCAATAGAAGTACAAAACAAAG
LF: ATGGCTGGCCCTGAATGCC
LB: GGGTGTCATCAGTTTTATCGGGT
F3: ATTTGGTGGGGGTTGAAC
B3: GGCTAAAAACAGGTATTGCTAA
e Youngbull 2019; Sepúlveda et ai. 2019, 2020a; Trebitz et ai. 2019; Watts 2020; Marshall e outros. 2021). Esses ensaios
são comumente citados na literatura como ZEBCOI, ZEB CYT e DRE16S (Tabela 3), sendo ZEBCOI e ZEBCYT específicos
para ZM e DRE16S visando genericamente tanto QM quanto ZM. Durante o desenvolvimento, todos os ensaios foram
submetidos a uma verificação minuciosa quanto à especificidade do QM-ZM, com particular ênfase na região dos Grandes
Lagos da América do Norte, através de ensaios com 10 mexilhões nativos não-alvo.
Quando implantado originalmente, Gingera et al. (2017) usaram esses novos ensaios ao longo de uma frente de invasão,
onde pesquisas de eDNA baseadas em qPCR foram usadas para fins de detecção precoce.
Os resultados forneceram detecções positivas de eDNA (posteriormente confirmadas por meio de pesquisas visuais) em alta
áreas de risco, onde o MQ-Z foi previamente erradicado e possivelmente recolonizado ou ainda não
documentado. Os autores empregaram um esquema de amostragem sazonal e, de acordo com
Peñarrubia et al. (2016), também observaram maior sucesso de detecção durante os meses de outono.
Várias explicações possíveis foram fornecidas para explicar o menor sucesso de detecção durante os
meses de primavera, incluindo o aumento da diluição devido ao derretimento da neve e a potencial
morte na estação fria (inverno). O suporte para a hipótese de que a diluição desempenha um papel
significativo no sucesso das pesquisas QM-ZM eDNA foi posteriormente demonstrado por Trebitz et al.
(2019). Semelhante a Peñarrubia et al. (2016), o maior sucesso de detecção, observado por Gingera
et al. (2017) no outono, foi atribuído à história de vida de QM ZM, onde a presença de veliger inteiro,
pós-primavera/verão, provavelmente contribui para facilitar a detecção de eDNA.
De Ventura e cols. (2017) discutiram como a presença de veliger em amostras de eDNA pode
afetar o desempenho de diferentes tecnologias e a capacidade de quantificar com precisão o eDNA. O
estudo comparou o desempenho de cPCR e qPCR baseado em corante, empregando dois ensaios
de COI espécie-específicos (DbuCOI3 e DpoCOI3; Tabela 3) desenvolvidos por Bronnenhuber e Wilson
(2013). Ambos os métodos de eDNA parecem superar as técnicas convencionais de pesquisa (ou seja,
amostragem com rede de pontapé e pesquisas de mergulho), com níveis semelhantes de detecção
alcançados em águas de extensões previamente invadidas e em águas na borda de uma frente de
invasão. No entanto, os autores concluíram que o cPCR era um método mais robusto e poderia
potencialmente superar o qPCR por ser menos propenso a falsos positivos (devido ao cPCR possuir
menor sensibilidade do que o qPCR). Mesmo assim, os autores conseguiram demonstrar a utilidade e
vantagem do uso do qPCR. Aqui, De Ventura et al. (2017) descobriram que as concentrações de eDNA
(estimadas via qPCR) estavam positivamente correlacionadas com as densidades conhecidas de
mexilhões, indicando que as concentrações de eDNA QM-ZM podem estar ligadas às densidades
populacionais via biomassa (pelo menos em alguns casos). Os autores, no entanto, recomendaram a
experimentação do mesocosmo para investigar ainda mais essa relação, afirmando que a concentração
e a quantificação do eDNA podem ser influenciadas por vários fatores, incluindo a presença de veliger,
inibidores de PCR e condições ambientais.
Como De Ventura et al. (2017) escapou, o eDNA está sujeito a fatores ambientais que afetam seu
transporte, persistência e degradação (para análises, consulte Barnes e Turner 2016; Harrison et al.
2019). Para entender melhor como esses fatores influenciam os levantamentos ZM eDNA em águas
lóticas, bem como eles influenciam a interpretação das concentrações de eDNA para biomassa,
Shogren et al. (2019) realizaram uma pesquisa de eDNA ao longo de um trecho de 7 km de um rio
infestado na Dinamarca durante a estação não reprodutiva. Usando DRE2 (Amberg e Merkes 2016;
Tabela 3), os autores investigaram a relação entre a concentração de eDNA e a densidade ZM,
considerando as características do local (variáveis físico-químicas e hidrológicas do rio, incluindo
velocidade, cobertura de macrófitas, temperatura, pH, tipo de substrato, clorofila a e nutrientes) e
taxas de derramamento e decomposição de eDNA de mexilhão (Sansom e Sassoubre 2017).
Os resultados revelaram relações complexas entre as variáveis, destacando a dificuldade em estimar

com precisão a biomassa/abundância de mexilhões apenas a partir da quantidade quantitativa de eDNA
dados. Especificamente, Shogren et al. (2019) encontraram uma relação fraca entre a densidade
de ZM e a concentração de eDNA. Uma relação mais forte foi observada entre a velocidade da
água, a concentração de nutrientes e a distribuição espacial de ZM eDNA. Os autores sugeriram
que essas descobertas poderiam ser usadas para desenvolver futuras estratégias de amostragem,
onde o destino do eDNA pode ser melhor previsto usando modelagem hidrológica (por exemplo,
modelos de transporte de eDNA, como em Carraro et al. 2018 e conforme detalhado mais
recentemente em Carraro et al . 2020).
Usando modelagem de ocupação multiescala, Sepulveda et al. (2019) investigou como as
estratégias de amostragem (especificamente, intensidade e tempo) podem afetar o sucesso da
detecção de eDNA em pesquisas QM-ZM norte-americanas. Aqui, os autores usaram três ensaios:
um ensaio COI específico para QM recém-desenvolvido (designado DREQM e testado contra 15
taxa não-alvo; Tabela 3), DRE16S (Gingera et al. 2017) e DRE2 (Amberg et al. 2019) . Os
resultados indicaram que, entre as amostras filtradas coletadas em junho, julho e outubro, a maior
eficiência de amostragem para detecção foi observada em julho, quando a estação reprodutiva
parecia proporcionar uma maior probabilidade de detecção. No entanto, os autores reiteraram as
recomendações anteriores de que a replicação da amostra desempenha um papel crucial na
probabilidade de detecção e no sucesso geral da pesquisa de eDNA (por exemplo, Ficetola et al.
2015; Furlan et al. 2016; Willoughby et al. 2016). Com o QM-ZM, um número bastante grande de
amostras de campo de eDNA foi necessário para atingir altos níveis de confiança na detecção,
com ÿ 27 e 14 amostras necessárias, respectivamente, para pesquisas de eDNA de junho/outubro
e julho.
Em 2020, ficou claro que as abordagens metodológicas baseadas em campo (por exemplo,
temporização sazonal, replicação, etc.) impactaram os resultados das pesquisas QM-ZM eDNA.
No entanto, nenhum estudo comparou os resultados com base na escolha do ensaio. Para
remediar esse problema, Sepul veda et al. (2020a) publicaram uma “validação duplo-cega, round-
robin” para cinco dos ensaios qPCR baseados em sonda específicos de QM-ZM mais comumente
usados (DRE16S, ZEB COI, ZEBCYT de Gingera et al. 2017; DRE2 de Amberg et al. 2019;
DREQM de Sepulveda et al. 2019). Neste estudo, as águas filtradas foram coletadas de sete
locais lóticos e lênticos amplamente disjuntos nos EUA, onde as infestações de QM-ZM eram
conhecidas ou desconhecidas. As amostras foram analisadas em vários laboratórios e os
resultados comparados. Os resultados foram altamente reprodutíveis (ou seja, consistentes e,
portanto, confiáveis) em todos os laboratórios e em grande parte entre os ensaios, com a seguinte
ressalva: o DRE16S superou todos os outros ensaios, enquanto o DRE2 teve o desempenho
menos eficaz (como mencionado anteriormente, provavelmente devido a temperaturas de
recozimento excepcionalmente baixas). . Embora os autores reconhecessem que o uso de
múltiplos ensaios poderia reduzir a ocorrência de resultados falsos negativos (e, logicamente,
melhorar o poder e a precisão geral da pesquisa), eles alertaram contra a multiplexação dos
ensaios testados, citando resultados de Gingera et al. (2017), que sugeriu que a multiplexação
diminuiu o desempenho do ensaio associado. Além disso, Sepulveda et al. (2020a) observaram
quantificação imprecisa e imprecisa de eDNA em amostras de água enriquecidas (ou seja,
amostras experimentais contendo concentrações conhecidas de DNA sintético de espécies-alvo),
sugerindo que cautela adicional é necessária ao estimar a biomassa de amostras de água com baixas concentra
o crescente corpo de evidências de que a quantificação baseada em qPCR pode ser menos do
que precisa para amostras de eDNA QM-ZM, que são consistentes com descobertas em vários
táxons (Yates et al. 2019).
PCR Digital de Gotas
A PCR digital de gotículas (ddPCR; Hindson et al. 2011) é uma forma tecnologicamente avançada
de qPCR, reconhecida pela precisão na quantificação do DNA. Com ddPCR, circuitos microfluídicos
e interações óleo-água são empregados para particionar moléculas individuais de DNA e reagentes
qPCR (por exemplo, polimerase, primers, sondas de hidrólise, nucleotídeos livres, etc.) em
gotículas de óleo individuais. Durante esse processo, dezenas de milhares de gotículas são
geradas e cada uma passa por uma PCR individual. A concentração de DNA alvo dentro de uma
amostra é calculada com base no número de gotículas que fluorescem em um nível definido (ou
seja, no qual o DNA alvo sofreu amplificação) em relação às gotículas que não fluorescem (e,
portanto, sem DNA alvo). Esta abordagem é um método direto e mais preciso para quantificar o
DNA do que o qPCR “análogo” (ou seja, conduzido em um instrumento qPCR padrão com
concentrações de DNA estimadas usando curvas padrão) e é menos suscetível a falsos negativos
induzidos por inibidores quando as concentrações de eDNA são muito baixas (Doi et al. 2015),
que é comumente o caso. A literatura cinza recente detalha a nova aplicação de ddPCR para
vigilância QM-ZM eDNA.
Em um estudo piloto, Watts (2020) usou o ensaio específico QM-ZM DRE16S (Gingera et al.
2017) em conjunto com um ensaio Corbicula modificado (Cowart et al. 2018) para pesquisar ZM e
amêijoas asiáticas. Amostras de água filtrada foram coletadas em docas e rampas para barcos em
seis lagos no nordeste dos EUA no seguinte gradiente de infestação de ZM e Corbicula : ausente
(ou seja, local de controle), recentemente erradicado, transitório, não viável, recentemente
identificado e conhecido. Para ZM, o sucesso da detecção variou entre os locais de amostragem e
os meses; o maior sucesso de detecção foi observado em lagos com populações maiores e quando
a amostragem ocorreu durante o mês de maio (ou seja, primavera). A última descoberta contrasta
com evidências anteriores que sugeriam meados do verão (julho; Sepulveda et al. 2019) e/
ou amostragem de outono (Peñarrubia et al. 2016; Gingera et al. 2017) forneceu o melhor sucesso
de detecção de eDNA QM-ZM. A discordância observada entre os estudos pode ser devido a
diferenças no esforço de amostragem, onde a replicação demonstrou influenciar significativamente
a probabilidade de detecção de QM-ZM eDNA entre as estações (Sepulveda et al. 2019).
Devlin e Youngbull (2019), empregando um instrumento portátil recém-desenvolvido, também
relataram o uso de ddPCR para detectar QM-ZM eDNA. Os autores usaram Gingera et al. (2017)
DRE16S primers, mas incorporou uma nova sonda (Tabela 3). Curiosamente, durante uma
pesquisa para QM-ZM em Lake Mead (AZ e NV, EUA), o estudo descobriu que QM-ZM eDNA pode
ser detectado quase em tempo real analisando diretamente a água do lago (ou seja, sem filtração
ou centrifugação de amostras de água ; sem purificação, isolamento ou concentração de eDNA).
No entanto, os resultados diretos do ensaio podem não ser indicativos de resultados em outras
águas, pois o lago Mead representa um local extremamente infestado onde QM-ZM eDNA pode
estar em concentrações atipicamente altas (ou seja, prontamente detectável sem a necessidade de concentração
Sequenciamento de alto rendimento
O sequenciamento de alto rendimento (HTS) é uma tecnologia moderna na qual numerosos alvos
(por exemplo, amostras, genes, fragmentos de DNA, espécies) podem ser sequenciados
simultaneamente, gerando maiores quantidades de dados de DNA em intervalos de tempo mais
curtos, ao mesmo tempo que reduz os custos de sequenciamento. Em estudos de eDNA, abordagens
de metabarcoding são frequentemente usadas juntamente com HTS (em um processo de múltiplas
etapas) para identificar rápida e bioinformaticamente o DNA (isto é, espécies) presente em uma
amostra ambiental (Fig. 2). Durante a primeira etapa, o DNA é normalmente amplificado usando
cPCR e códigos de barras “universais” taxonomicamente amplos ou primers metabarcoding (Hebert
et al. 2003; Taberlet et al. 2012). Os ampli cons obtidos são subsequentemente sequenciados ou
“lidos” via HTS e os dados resultantes da sequência são então cruzados com um banco de dados de
DNA existente (ou seja, NCBI's GenBank, Barcode of Life Database (BOLD)) ou um banco de dados
de DNA personalizado. Utilizando estas bases de dados e análises bioinformáticas complexas, as
sequências (ou seja, ADN amplificado) podem então ser identificadas em espécies ou em níveis
taxonómicos mais elevados, dependendo da qualidade e abrangência taxonómica das bases de
dados de referência. O metabarcoding apresenta desafios únicos para a análise e interpretação do
eDNA. Está sujeito a perdas na sensibilidade de detecção (por exemplo, viés de amplificação de
PCR), riscos aumentados de resultados falso-positivos (por exemplo, por meio de contaminação
induzida por tag-hopping HTS) e requer avaliação experimental robusta (Zinger et al. 2019).
Os métodos HTS de metabarcoding foram aplicados com sucesso aos esforços de vigilância QM-
ZM eDNA, onde vários objetivos de vigilância foram alcançados usando uma variedade de primers
(Tabela 3). Por exemplo, iniciadores de metabarcoding COI, projetados para atingir metazoários
genéricos (Leray et al. 2013) e/ou invertebrados marinhos (Geller et al. 2013), foram usados para
detectar especificamente ZM (Ardura et al. 2017) ou QM eDNA (Blackman et al. 2020a) e para
detectar QM-ZM eDNA em pesquisas em toda a comunidade (Mychek-Londer et al. 2020). Iniciadores
de metabarcoding visando 18S e projetados para detectar crustáceos, moluscos e tunicados (Zhan
et al. 2013), também foram usados juntamente com HTS para detectar AIS em portos de água doce,
revelando a presença de QM (Brown et al. 2016). Blackman e outros. (2020a) relatam duas
descobertas importantes de HTS de águas infestadas conhecidas: 1) um aumento na distância entre
a amostragem (ou seja, o ponto de coleta de eDNA) e a população de origem influenciou
negativamente as concentrações de QM eDNA e 2) HTS teve desempenho inferior em comparação
com espécies empregadas simultaneamente cPCR e qPCR específicos (Tabela 3), onde a detecção
QM foi de 86% e 100% de sucesso, respectivamente. A última descoberta foi especialmente
verdadeira em populações de baixa densidade. A observação de que o HTS foi menos sensível do
que o qPCR específico da espécie é consistente com outros estudos (Lacoursière-Roussel et al.
2016b; Harper et al. 2018; Bylemans et al.
2019). No entanto, o desempenho relativamente baixo do HTS em Blackman et al. (2020a) pode ser
devido ao uso de um iniciador universal que presumivelmente visa a maioria dos grupos animais
(metazoários), mas não foi projetado especificamente para moluscos e, como resultado, pode
amplificar preferencialmente o DNA de outras espécies mais abundantes e/ou outros espécies cujo
DNA exibe melhores correspondências com a sequência do iniciador. Assim, nos parágrafos
seguintes, detalhamos o desenvolvimento e uso de metabarcodes HTS mais específicos
(por exemplo, específico de molusco, específico de bivalve, específico de QM-ZM), que pode fornecer
melhores resultados de QM-ZM eDNA.
Klymus et ai. (2017) desenvolveram iniciadores de metabarcoding para uso específico em esforços de
AIS HTS visando moluscos (ou seja, bivalves – ou mexilhões e amêijoas – e caracóis).
Para começar, os autores investigaram o poder discriminatório de três regiões de DNA (COI mitocondrial e
16S e nuclear 28S) para detectar e discriminar 19 espécies de caracóis e bivalves invasoras/potencialmente
invasivas de interesse na região dos Grandes Lagos. A região mais adequada foi 16S. Dos dois conjuntos de
primers posteriormente desenvolvidos, MOL16S (Tabela 3) foi destinado para uso em moluscos, incluindo
QM-ZM.
O desempenho do MOL16S foi avaliado pela primeira vez usando uma amostra experimental de eDNA de
“comunidade simulada”, na qual uma solução foi criada contendo uma mistura de modelos de DNA direcionados
em concentrações conhecidas. Os autores avaliaram a interação do viés de amplificação por PCR e da
abundância de leitura de amplicon/sequência. O viés de amplificação é descrito como a tendência de um
primer amplificar (“detectar”) preferencialmente o DNA de certas espécies em detrimento de outras. O viés,
que pode afetar os resultados do HTS, deve-se em grande parte à incompatibilidade de nucleotídeos entre a
sequência de DNA dos primers e as regiões de DNA complementares de diferentes espécies-alvo (Piñol et
al. 2014). Os autores descobriram que o número de leituras de sequências observadas para uma espécie
correlacionou-se bem com as concentrações iniciais de DNA. Assim, em levantamentos de eDNA, os dados
HTS podem ser úteis para fins semi-quantitativos, fornecendo estimativas aproximadas da abundância/
biomassa relativa de uma espécie-alvo. Quando os autores posteriormente implantaram sua técnica nas águas
dos Grandes Lagos, o MOL16S provou ser menos específico do que o previsto e, além disso, amplificou o
DNA de grupos não-alvo, incluindo vermes oligoquetas, rotíferos e briozoários. No entanto, como as sequências
de diferentes espécies podem ser analisadas no HTS, a presença de QM-ZM ainda pode ser discernida, com
o esforço do HTS eDNA ainda superando as pesquisas visuais. Snyder e outros. (2020) mais tarde usaram
HTS e MOL16S para monitorar com sucesso QM-ZM em águas de tanques de retenção em lojas de iscas na
região dos Grandes Lagos.
Prié et al. (2020) também desenvolveram primers metabaroding HTS específicos para bivalves,
localizando 16S nas ordens Unionida (Unio01) e Venerida (Vene01). O Primer Vene01 (Tabela 3) foi projetado
de forma que os membros da família Dreissenidae, incluindo QM ZM, também sejam amplificados e
detectados. Amostras de campo de sistemas lóticos predominantemente franceses provaram que o Vene01
poderia detectar com sucesso QM eDNA. O primer HTS forneceu evidências que suportam uma distribuição
mais ampla e invasão expandida para QM naquela região.
Uma especificidade ainda maior do metabarcoding foi alcançada em Marshall e Stepien (2019). Aqui, os
autores desenvolveram dois conjuntos de primers HTS COI (COIA e COIB), que foram projetados para
detectar QM-ZM, bem como outras quatro espécies de Dreissena . Os primers foram adicionalmente úteis na
discriminação entre os haplótipos dentro dessas espécies. Testes experimentais, baseados em amostras
simuladas da comunidade, mostraram que o COIA (Tabela 3) superou o COIB. Consequentemente, os autores
apresentam apenas resultados HTS de ensaios de aquários e amostragem de campo usando COIA. Em última
análise, os autores foram capazes de avaliar com sucesso a composição de espécies QM-ZM, abundância
relativa e diversidade genética da população usando amostras de eDNA e seu método HTS recém-
desenvolvido. Não
apenas as contagens de leitura HTS para as duas espécies foram bem correlacionadas com a
biomassa QM-ZM conhecida, a abordagem também produziu leituras de haplótipos QM e ZM
proporcionais à representação haplotípica encontrada em populações locais das duas espécies. Os
testes em aquários produziram dois resultados interessantes sobre estimativas de biomassa baseadas em HTS.
Primeiro, o HTS leu a abundância de biomassa conhecida mais adequada após um período de
aclimatação de 7 a 14 dias. Segundo e semelhante aos achados de campo em Amberg et al. (2019),
as evidências de testes em aquários deste estudo indicaram ainda que a biomassa QM-ZM pode
ser melhor estimada usando amostras de água coletadas perto do fundo, e não na superfície.
Amplificação isotérmica mediada por loop
Tecnologias como cPCR, qPCR, ddPCR e HTS alcançam a amplificação do DNA por meio de ciclos
térmicos e, portanto, requerem instrumentos capazes de aquecimento e resfriamento rápidos e
cíclicos. Esta é uma limitação significativa para pesquisas de eDNA in situ, especialmente pesquisas
de eDNA em locais remotos e inacessíveis, onde pode ser difícil transportar e alimentar equipamentos
de ciclagem térmica. Uma opção mais amigável em campo – capaz de fornecer resultados no ponto
de coleta (Stedtfeld et al. 2012) e, assim, minimizar atrasos na vigilância AIS (Merkes 2020) – pode
ser encontrada na amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP; Notomi e outros 2000). Aqui, a
amplificação ocorre a uma única temperatura usando uma polimerase única e três conjuntos de
primers especialmente projetados, denominados primers internos para frente e para trás (FIP e BIP),
primers de loop (LF e LB) e primers externos (F3 e B3). A polimerase única, usada no LAMP, é
altamente tolerante a inibidores de amplificação (Koloren et al. 2011). Este atributo torna o LAMP
atraente para amostras de eDNA, onde os inibidores são especialmente desafiadores e podem levar
à falha na amplificação em técnicas baseadas em PCR. No entanto, estudos descobriram que os
ensaios LAMP são aproximadamente 10 vezes menos sensíveis que o qPCR (Bühlmann et al. 2013;
Waliullah et al. 2019) e podem ser incapazes de detectar as concentrações muito baixas de DNA
normalmente observadas em amostras de eDNA. O aumento do volume da amostra pode fornecer
uma compensação aqui. Por exemplo, com LAMP, volumes de água potencialmente maiores (e
mais sujos) podem ser processados (ou seja, filtrados e extraídos), sem perder a sensibilidade
devido à inibição. Isto poderia potencialmente permitir um aumento na captura e concentração de
eDNA disponível e, assim, melhorar a probabilidade de detecção baseada em LAMP.
Williams e outros. (2017) é a única publicação que demonstrou com sucesso, por meio de
testes de laboratório e de campo, uma capacidade QM-ZM eDNA LAMP. Os autores desenvolveram
três novos ensaios (Tabela 3) e investigaram se a filtração e a subseqüente extração de DNA
impactavam a sensibilidade de sua abordagem baseada em LAMP. Estas são investigações
importantes porque o LAMP é frequentemente usado para amplificar diretamente amostras “brutas”
com pré-processamento mínimo (se houver) (por exemplo, Stedtfeld et al. 2014; Maranhão et al. 2020).
No entanto e como mencionado acima, as amostras de eDNA normalmente passam por filtração (e
subsequente extração de DNA) antes da amplificação. Essas etapas servem para concentrar o
DNA alvo, mas coincidentemente também concentram os inibidores. O desempenho foi avaliado em
locais com níveis conhecidos e variáveis de infestação QM-ZM (ou seja, populações de alta e baixa
densidade) e onde amostras de eDNA foram coletadas em várias estações
(incluindo a época de desova). Em situações de alta densidade (ou seja, em grandes populações
ou durante a época de desova), os autores descobriram que nem a filtração nem a extração eram
necessárias para detectar com sucesso QM-ZM usando LAMP. De fato, os autores demonstraram
que a amplificação direta e livre de PCR de QM-ZM eDNA pode ser alcançada no ponto de coleta
em menos de 90 minutos usando um dispositivo portátil LAMP operado por bateria (Gene-Z;
Stedtfeld et al. 2012). No entanto, a maior sensibilidade de detecção foi alcançada quando as
amostras de eDNA passaram por filtração e extração de DNA antes de serem amplificadas com
LAMP. Isto foi particularmente verdadeiro para populações de baixa densidade, onde a filtração
provavelmente ajudou a concentrar o DNA. A inibição não pareceu ser problemática para a
detecção de QM-ZM baseada em LAMP nestas situações. Apesar desses sucessos, a
incorporação de etapas de filtração e extração de DNA pode diminuir a facilidade de campo do
LAMP, exigindo o transporte de equipamentos e reagentes adicionais.
Tipo de destino
A grande maioria dos esforços de amostragem de eDNA, especialmente aqueles envolvendo QM-
ZM, dependeu de ensaios direcionados a fragmentos curtos de mtDNA (mas veja, Lance e Carr
2012; Peñarrubia et al. 2016; Williams et al. 2017). O DNA mitocondrial dominou o campo por
duas razões principais. Uma razão é que existem grandes quantidades de dados de sequência on-
line para o mtDNA. Esses dados facilmente acessíveis tornam mais fácil projetar ensaios de eDNA
eficazes que atendam aos critérios de inclusão (detectar todas as variantes genéticas do locus
alvo nas espécies) e especificidade (detectar apenas táxons alvo). Uma segunda razão pela qual
o mtDNA é tão popular em pesquisas de base molecular é que várias linhas de evidência levaram
à generalização de que o mtDNA multicópia ligado à membrana existe no ambiente em
concentrações mais altas e por períodos mais longos do que o DNA nuclear de cópia única. (nuDNA) e/
ou RNA de cópia única (Thomsen e Willerslev 2015). Também existem evidências que sugerem
que as mesmas tendências ocorrem para fragmentos moleculares curtos em comparação com
fragmentos moleculares longos (por exemplo, Jo et al. 2017). Em última análise, isto significa que
alvos curtos de mtDNA são atraentes para uso em esforços de eDNA porque são mais fáceis de
detectar. No entanto, se fragmentos mais longos e de menor concentração estiverem sujeitos a
maior degradação e decaimento, talvez esses tipos de alvos forneçam maior potencial para
detectar seletivamente mais sinais contemporâneos, fornecendo assim indicações mais fortes de
que um indivíduo vivo esteve recentemente presente no sistema amostrado (Barnes e Turner
2016; Bista et al. 2017; Cristescu 2019). No entanto, evidências crescentes revelam que, entre
esses vários tipos de alvos moleculares, os padrões de deposição e degradação (que, por sua
vez, influenciam a abundância, persistência e detectabilidade) são mais complexos do que as
generalizações anteriores sugeririam (por exemplo, Bylemans et al. 2018b; Harrison et al. 2019;
Wood et al. 2020). Ainda assim, permanece o interesse em como cada um desses alvos
moleculares únicos pode ser usado, individualmente e em complemento, para abordar vários
objetivos de vigilância diferentes, incluindo inferências espaço-temporais aprimoradas em relação
à distribuição e tempo desde a deposição (doravante, idade). Evidências muito recentes fornecidas
por Marshall et al. (2021) sugere que estimativas mais precisas de idade podem ser obtidas em
sinais de detecção QM-ZM baseados em moléculas quando as pesquisas empregam simultaneamente eDNA e e
De fato, Marshall e cols. (2021) investigaram uma série de questões pertinentes relacionadas
ao uso de vários alvos moleculares na detecção QM-ZM baseada em qPCR e revelaram novos
insights profundos. Aqui, foram realizados experimentos nos quais amostras de aquários foram
analisadas para uma combinação de seis alvos moleculares QM-ZM diferentes (Tabela 3).
Esses alvos representavam os genomas nuclear e mitocondrial e permitiam comparações de
diferentes comprimentos de fragmentos (isto é, curtos versus longos), eDNA versus eRNA e RNA
mensageiro (mRNA) versus ribossomal (rRNA). Para avaliar os padrões de abundância, degradação
e detectabilidade ao longo do tempo, a amostragem dos aquários ocorreu em intervalos cobrindo 0
e 4–240 h após a remoção do QM-ZM. Todos os alvos foram analisados, separadamente, como
eDNA e como eRNA. Para obter dados de eRNA separados, métodos de extração de eRNA foram
usados, com uma etapa adicional de PCR de transcrição reversa adicionada ao fluxo de trabalho
típico de eDNA. Marshall e outros. (2021) concluíram que foram mais capazes de estimar a idade
do material genético ambiental quando combinaram eDNA e eRNA e investigaram a taxa de
degradação entre os dois. Outras observações importantes incluem: 1) semelhante ao eDNA, as
concentrações de eRNA podem ser positivamente associadas à abundância de QM-ZM em
genomas nucleares e mitocondriais, 2) as constantes de decaimento foram semelhantes para curto
(75-169 pb) vs. longo (251 e 341 bp) alvos gênicos/
fragmentos, 3) genes de rRNA multicópia (rRNA 16S mitocondrial e rRNA 18S nuclear) podem
melhorar a detecção em situações de baixa densidade devido a concentrações mais altas
observadas (e persistência mais longa após a remoção de QM-ZM) e 4) mRNA H2B associado à
mitose fornece um alvo de eRNA útil para avaliar a presença recente (<24 horas) de QM-ZM vivo.
Estas descobertas experimentais específicas do QM-ZM contrastam com as de Wood et al.

(2020). Eles conduziram experimentos semelhantes de taxa de decaimento baseados em aquários
em outro AIS (um verme poliqueta marinho) e descobriram (usando ddPCR) que o eRNA só
permaneceu detectável em amostras de aquários dentro de 14 horas após a remoção do organismo-
alvo, enquanto o eDNA persistiu por muito mais tempo (até 94 h após a remoção do organismo). É
importante ressaltar, no entanto, que Wood et al. (2020) atribuíram essas diferenças às concentrações
iniciais de eDNA/eRNA (ou seja, taxas de eliminação), em oposição a qualquer diferença nas taxas
de decaimento, que não foram consideradas significativamente diferentes. Ainda assim, tanto em
Marshall et al. (2021) e Wood et al. (2020), descobriu-se que o eRNA persiste em intervalos
inesperadamente longos. Para os alcatrões QM-ZM eRNA, as taxas de decaimento (apresentadas
como constantes derivadas de modelo, log-lineares por hora) variaram de ÿ0,0561 a ÿ0,0735 (±
0,0025), equivalendo a meias-vidas de eRNA entre 8,84 a 13,54 h (Marshall e outros 2021). É
possível que os aquários experimentais carecessem de comunidades bacterianas naturais e talvez
isso ajude a explicar os intervalos inesperadamente longos de persistência de eRNA observados.
Sabe-se que as comunidades bacterianas contribuem significativamente para a degradação do
eDNA (Nielsen et al. 2007; Lance et al. 2017, Zulkefli et al. 2019; Saito e Doi 2020) provavelmente
por meio de atividade enzimática e metabólica (Finkel e Kolter 2001; Vorkapic et al. 2016; Al-Wahaibi
et al. 2019). Assim, os resultados observados podem não refletir a taxa de degradação em sistemas
naturais onde a degradação pode ser acelerada e/ou mais severa e/ou onde as condições ambientais
podem influenciar ainda mais o destino de diferentes alvos moleculares (por exemplo, ver Harrison
et al. 2019). Diferenças à parte, evidências de Wood et al. (2020) sugere que os biofilmes dos tanques podem atua
de eDNA e eRNA “herdados” (detectáveis até 21 dias após a remoção do organismo). Isso tem
implicações importantes para os esforços de monitoramento QM-ZM, especialmente aqueles focados
na avaliação da descontaminação bem-sucedida de tanques de lastro/porão. Se existir material
genético herdado em biofilmes de tanques descontaminados, isso pode levar a detecções positivas
de QM-ZM por longos períodos de tempo, mesmo quando QM-ZM não estiver mais presente e/ou
viável.
Resumo, incluindo caminhos a seguir e lacunas críticas restantes
Um conjunto robusto de métodos sensíveis baseados em moléculas tem sido usado para monitorar
com sucesso QM-ZM invasivo em águas norte-americanas e em outros lugares. Como tal, mais de
20 relatórios de QM-ZM eDNA (tanto na literatura revisada por pares quanto na literatura cinza)
foram revisados aqui, abrangendo uma década de pesquisa, desenvolvimento e implementação.
As abordagens para vigilância QM-ZM baseada em eDNA evoluíram de um simples cPCR para
ddPCR e HTS de última geração (Fig. 1). Embora a amostragem de eDNA tenha sido o foco
pioneiro da maioria dos empreendimentos de monitoramento QM-ZM baseados em moléculas,
descobertas recentes de eRNA sugerem que novos caminhos interessantes estão no horizonte, nos
quais eDNA e eRNA podem ser usados juntos para promover inferências espaço-temporais. Apesar
de muitos progressos (Tabela 1), uma série de lacunas científicas e aplicadas críticas requerem
resolução. Encerramos esta revisão discutindo maneiras pelas quais o campo QM-ZM pode avançar
utilizando as recomendações existentes para melhores práticas otimizadas, ao mesmo tempo em
que destacamos as lacunas críticas remanescentes que precisam de atenção.
Escolha de Ensaio/Metabarcode
O sucesso da detecção e a precisão dos resultados podem depender muito da escolha do ensaio e/
ou do iniciador HTS (por exemplo, Wilcox et al. 2013; Elbrecht et al. 2019). Embora uma ampla
variedade de ensaios e iniciadores esteja disponível para uso em esforços de pesquisa QM-ZM
baseados em moléculas (Tabela 3), níveis variáveis de validação e eficiência foram relatados para
cada um. Um consenso para utilizar apenas o melhor (isto é, o mais específico e sensível) desses
ensaios beneficiaria os programas de gerenciamento e vigilância de QM-ZM, tornando os resultados
não apenas mais confiáveis, mas também mais diretamente comparáveis. Achados de Sepulveda
et al. (2020a) pode ser usado como um guia a esse respeito, auxiliando futuros pesquisadores na
direção certa para a seleção do ensaio qPCR baseado em sonda. A seleção do ensaio poderia ser
ainda auxiliada pelos critérios de avaliação recentemente descritos em Thalinger et al. (2020). Aqui,
os ensaios desenhados por Gingera et al. (2017), De Ventura et al. (2017) e Williams et al. (2017) já
foram objetivamente identificados como confiáveis. De acordo com os dados suplementares em
Thalinger et al. (2020), os ensaios atingiram os níveis 3 e 4 de uma escala de classificação de 5
níveis, na qual critérios mínimos cobrindo 14 etapas básicas de validação de laboratório e campo
foram “essencialmente” ou “substancialmente” demonstrados. Essa classificação significa, em última
análise, que esses ensaios estão prontos para aplicação em campo, mas não estão totalmente
operacionais e, portanto, podem limitar as interpretações de resultados de não detecção (por exemplo, no nível 3, é
se os negativos forem falsos negativos) e/ou podem exigir etapas adicionais para validar as detecções
positivas (por exemplo, sequenciar amplicons de amostras positivas).
Com base em Sepulveda et al. (2020a) e Thalinger et al. (2020), recomendamos o uso de DRE16S
(Gingera et al. 2017; Tabela 3) como primeira escolha para vigilância de eDNA QM ZM baseada em
qPCR. Observamos, no entanto, que o uso de vários ensaios direcionados a diferentes regiões de genes
melhora o sucesso e a precisão da detecção (Lance e Guan 2019; Sepulveda et al. 2020a, b). Os
topógrafos empregam ensaios adicionais (não-16S) da lista de escolhas confiáveis em Sepulveda et al.
(2020a) e Thalinger et al. (2020).
Até onde sabemos, não existem critérios de avaliação semelhantes para metabarcodes HTS (mas
veja, por exemplo, métodos usados em Bylemans et al. 2018a e Elbrecht et al.
2019). Avaliações comparativas dos primers de metabarcoding relevantes para QM-ZM disponíveis ainda
são necessárias. Como tal, testes round-robin semelhantes aos de Sepulveda et al. (2020a) deve ser
usado para identificar os iniciadores de metabarcoding mais confiáveis e eficazes para empreendimentos
de eDNA QM-ZM baseados em HTS.
Esforço de amostragem
Tal como acontece com todos os métodos de levantamento AIS, os levantamentos de base molecular
são suscetíveis à detecção imperfeita. Sabe-se que as réplicas de campo e laboratório melhoram as
probabilidades de detecção de eDNA (Ficetola et al. 2015; Furlan et al. 2016; Willoughby et al. 2016).
Sepúlveda et ai. (2019) descobriu que isso é verdade em QM-ZM, onde a modelagem de ocupação
indicou que uma amostragem de campo substancial é necessária para obter altas probabilidades de
detecção, mas com esforço variável necessário dependendo do tempo (ou seja, QM-ZM dependente do
ciclo de vida, amostragem sazonal ). A síntese dos materiais revisados sugere que o sucesso da
detecção pode ser melhorado pela amostragem durante (Sepulveda et al. 2019) e/ou após (Peñarrubia et al.
2016; Gengibre et al. 2017) a época de desova, perto do fundo de águas profundas (Amberg e Merkes
2016; Amberg et al. 2019; Marshall e Stepien 2019) e onde é provável que as partículas de eDNA/eRNA
se acumulem (Amberg e Merkes 2016; Amberg et al. 2019). Os locais de acumulação podem não
coincidir com o habitat ideal QM-ZM e podem, em vez disso, refletir padrões ambientais de transporte e
assentamento (Amberg e Merkes 2016; Amberg et al. 2019; Shogren et al. 2019).
Instrumentos portáteis de campo (e inibição de PCR)
Um objetivo principal da vigilância QM-ZM é a detecção precoce e a resposta rápida. No entanto, a

maioria dos inquéritos de eDNA dependeu de fluxos de trabalho, instrumentação e análises laboratoriais,
o que contribui para atrasos nos resultados. A adoção de dispositivos de campo portáteis e/
ou dispositivos de detecção rápida provavelmente melhorarão a capacidade de implementar vigilância
QM ZM no local, diminuindo assim o tempo para resultados, mesmo em locais remotos e/ou amplamente
dispersos. Atualmente, existem vários instrumentos de campo amigáveis para potencialmente remediar
esses problemas e, assim, melhorar o imediatismo, mas todos parecem sofrer alguma forma de
inadequação, mais frequentemente observada por meio de baixa sensibilidade (influenciada pela inibição da PCR).
Por exemplo, a detecção rápida pode ser possível com o portátil Franklin
Instrumento qPCR (Biomeme, Filadélfia, PA). Aqui, os resultados do eDNA podem ser gerados
em < 1 h. No entanto, altas taxas de detecção de falsos negativos foram observadas (Sepulveda
et al. 2018), com evidências adicionais para sugerir que a otimização pode ser necessária para
amostras nas quais os inibidores de PCR estão presentes (Sepulveda et al. 2018; Thomas et al. 2019) .
Espera-se que a inibição da PCR seja menos problemática no ddPCR (por exemplo, Hoshino e
Inagaki 2012) e no LAMP (por exemplo, Koloren et al. 2011). No entanto, Devlin e Youngbull
(2019) levantaram a hipótese de que, ao usar um instrumento ddPCR portátil de campo (DNA
Tracker), “matéria orgânica arrastada” pode ter levado a uma detecção de QM-ZM falso positivo
(via quimerização) em águas não infestadas. Quando Williams et al. (2017) investigaram o uso de
um dispositivo LAMP portátil operado por bateria (Gene-Z; Stedtfeld et al. 2014), a inibição da
PCR não pareceu ser um problema específico para a vigilância QM-ZM. Na verdade, o LAMP
provou ser útil para a vigilância rápida no local de outros AIS em vias de alto risco, mesmo com
utilizadores novatos (Merkes 2020). No entanto, como demonstrado noutro local (Bühlmann et al.
2013; Waliullah et al. 2019), Williams et al. (2017) observaram baixo desempenho do LAMP em
ambientes onde as concentrações de eDNA eram baixas, indicando uma troca entre tolerância ao
inibidor e sensibilidade reduzida. Esses estudos indicam cumulativamente que métodos para
combater a inibição da PCR são necessários para melhor atender às prioridades de gerenciamento
para detecção precoce precisa e confiável.
Precisão de quantificação
Vários estudos baseados em laboratório e em campo relatam uma correlação observada entre a
abundância QM-ZM conhecida e baseada em qPCR (Peñarrubia et al. 2016; De Ventura et al.
2017) ou baseada em HTS (Klymus et al. 2017; Marshall e Stepien 2019) medições (ou seja,
concentrações) de eDNA e/ou eRNA (Marshall et al. 2021). No entanto, a capacidade de
quantificar com precisão QM-ZM eDNA e/ou interpretar com precisão as concentrações de eDNA
para fins de abundância foi questionada por pelo menos duas publicações, incluindo uma em que
amostras controladas foram adicionadas experimentalmente com DNA sintético em condições
conhecidas. concentrações (Sepulveda et al. 2020a) e outro em que os fatores ambientais foram
observados para complicar os padrões de correlação entre a concentração de eDNA e a densidade
QM-ZM (Shogren et al. 2019). Mesmo entre os estudos QM-ZM que encontraram correlação, dois
forneceram ressalvas críticas em relação à precisão e confiabilidade dessas estimativas, citando
possíveis complicações decorrentes da atividade de desova e potencial presença de veliger
(Peñarrubia et al. 2016; De Ventura et al. 2017). Além disso, essa imprecisão na quantificação
baseada em eDNA não é exclusiva do QM-ZM. Descobertas semelhantes foram observadas em
vários sistemas e numerosos táxons, com várias explicações fornecidas para explicar a variação
observada na correlação e as discrepâncias na precisão da quantificação. As explicações são
tipicamente complexas e sinérgicas, mas geralmente incluem fatores, como a inibição da PCR
(por exemplo, McKee et al.
2015; Sigsgaard et ai. 2015), escolha e viés em diferentes metodologias de amostragem e/ou
processamento (por exemplo, Lacoursière-Roussel et al. 2016a; Hinlo et al. 2017), variabilidade
na deposição e degradação de eDNA (por exemplo, Jo et al. 2020) e ambiental e/ou efeitos
ecológicos (por exemplo, Barnes et al. 2014; Strickler et al. 2015). Uma metanálise recente
revelou que as correlações entre as medidas de quantificação (ou seja, concentrações de eDNA e
abundância conhecida) foram substancialmente e significativamente mais fortes em laboratórios
experimentais e/ou ambientes de lagoas artificiais do que em sistemas naturais (Yates et al. 2019).
Juntas, essas observações sugerem que as estimativas de abundância baseadas em eDNA são
propensas a erros e requerem investigação adicional seguida de otimização subsequente. Até que
sejam feitas melhorias, os dados de eDNA atualmente só podem fornecer – com alguma
confiabilidade – avaliações aproximadas e semiquantitativas da abundância de QM-ZM (por
exemplo, em uma escala de muito rara a extremamente comum).
Embora não existam soluções fáceis e diretas para resolver imediatamente esses desafios na
quantificação, vemos dois caminhos a seguir. Primeiro, os investigadores devem comparar o
desempenho das estimativas baseadas em qPCR com as estimativas baseadas em ddPCR (como
em, por exemplo, Nathan et al. 2014; Doi et al. 2015) usando ensaios QM-ZM de alto desempenho
(por exemplo, veja os resultados em Sepulveda et al. 2020a; Thalinger et al. 2020). Quando
comparado ao qPCR, o ddPCR deve fornecer uma quantificação mais precisa, mais consistente e
mais reprodutível de eDNA (mesmo na presença de inibidores), pois utiliza medições diretas e
absolutas não dependentes de curvas padrão potencialmente falíveis (embora, observe: semelhante
à amostragem replicação, a replicação técnica melhora a quantificação de qPCR; Mau visseau et
al. 2019). No entanto, embora o ddPCR possa apresentar uma solução técnica para melhorar a
precisão da quantificação, ele ainda não pode remediar as inconsistências e/ou variabilidade
observadas na relação real entre a concentração de eDNA e a abundância de QM-ZM, que muitas
vezes resulta de fatores ecológicos e ambientais. Assim, será necessário não apenas utilizar
instrumentação (e/ou abordagens técnicas) mais precisas, mas também continuar a investigar a
dinâmica QM-ZM eDNA, especialmente dinâmica em ambientes naturais. Essa combinação de
refinamentos pode levar a uma maior precisão e interpretação da quantificação, possivelmente
resultando na capacidade de avaliar melhor os dados da pesquisa de eDNA, tanto em termos de
níveis de infestação QM-ZM quanto em termos de sucesso de manejo (por exemplo, esforços de
erradicação, onde a remoção bem-sucedida deve equivalem a diminuições na concentração de
eDNA). Para que tais avanços sejam eficazes, os pesquisadores devem levar em consideração o
destino do eDNA, incluindo as taxas de derramamento, decadência e degradação.
Degradação em ambientes naturais
Achados de degradação de experimentos em aquários baseados em laboratório sugerem que, entre

os marcadores estudados até o momento, H2B mRNA fornece o melhor marcador de eRNA para
avaliações QM-ZM espaço-temporais mais finas, estreitando a janela de detecção para < 24 h
(Marshall et al. 2021). O mesmo experimento forneceu evidências de que a razão eDNA:eRNA é
um preditor útil do tempo desde a deposição, demonstrando a vantagem de usar eDNA e eRNA
simultaneamente (Marshall et al. 2021). Deixando de lado as precisões de quantificação (veja a
discussão acima), estudos futuros devem avaliar essas descobertas em ambientes de mesocosmo
ao ar livre, pois até mesmo Marshall et al. (2021) sugere que experimentos baseados em laboratório
podem simplificar demais o destino de eDNA e eRNA em condições ambientais mais naturais. De
Ventura e cols. (2017) pediu esses tipos de experimentos e descobertas de Shogren et al. (2019)
indicam que as condições ambientais influenciam
o destino (ou seja, dispersão, retenção e degradação) de alvos moleculares. Ecoamos as recomendações de
duas publicações recentes (uma revisão, Harrison et al. 2019 e uma meta-análise, Yates et al. 2019) e sugerimos
que os experimentos de degradação de QM-ZM devem ser conduzidos em ambientes mais naturais antes que o
conhecimento possa ser aplicado a pesquisas de campo do mundo real. Também sugerimos que a presença do
veliger seja controlada nesses experimentos ao ar livre; O DNA dentro de organismos microscópicos inteiros não
se comporta (ou seja, degrada) da mesma forma que o eDNA liberado de mexilhões adultos e pode confundir as
observações da taxa de decaimento. Uma melhor compreensão da ecologia do eDNA (incluindo atributos físicos
e interações abióticas/bióticas e destino; Barnes e Turner 2016) em ambientes de campo reais e para
quantificação aprimorada beneficiará tremendamente os esforços de vigilância QM-ZM, ajudando a reduzir erros
e incertezas no interpretação de dados de eDNA e/ou eRNA.
Traduzindo os resultados da pesquisa de eDNA em ação de gerenciamento de AIS
Os dreissenídeos representam sérios riscos para as águas invadidas e exibem uma capacidade excepcional de
colonizar novos locais. Assim, a vigilância proativa de eDNA foi recomendada para combater a disseminação de
QM-ZM, na esperança de que a detecção precoce e a resposta rápida impeçam a colonização (Departamento
do Interior dos Estados Unidos 2017). Para que isso seja eficaz, os gerentes de AIS devem ser capazes de
confiar nos resultados das pesquisas de eDNA e devem ser capazes de traduzir os resultados de eDNA em
respostas acionáveis. Isso representa uma área de discórdia. Apesar dos esforços de especialistas em eDNA
para melhorar a confiança nos resultados de eDNA por meio de desenvolvimentos em medidas QA-QC
(Goldberg et al. 2016) e design cuidadoso de ensaios de eDNA (Klymus et al. 2020a), os gerentes ainda podem
relutar em adotar eDNA ap abordagens para fins de vigilância e gestão. Grande parte da relutância pode ser
atribuída à incerteza percebida nas capacidades de detecção de eDNA e, especificamente, ao medo de
detecções de “falsos positivos” não suportadas por métodos de pesquisa visual (Jerde et al. 2021).
Darling et ai. (2021) sugere que essa incerteza percebida se deve a expectativas irrealistas, um desrespeito
pela baixa sensibilidade geralmente exibida por métodos de pesquisa convencionais (o que potencialmente os
torna inadequados para confirmar os resultados de abordagens de eDNA extremamente sensíveis) e terminologia
de eDNA mal definida. De fato, Sepulveda et al. (2020c) demonstra que os métodos de eDNA são maduros e
cientificamente defensáveis, com protocolos bem estabelecidos para prevenir, detectar e quantificar erros de
detecção (por exemplo, falsos positivos, contaminação). Embora claramente suscetível a detecção imperfeita
(como é o caso de todos os métodos de vigilância de AIS), Sepulveda et al. (2020c) sugere que o problema com
o eDNA não é a validade do método. Em vez disso, o que impede a adoção do eDNA na política de AIS e nos
processos de tomada de decisão é a falta de estruturas pré-definidas para integração, que incorporam riscos e
incertezas. Juntos, Darling et al. (2021) e Sepulveda et al. (2020c) sugerem que é necessária uma maior
colaboração entre os profissionais de eDNA e os gerentes de recursos.
Há uma necessidade de envolver usuários finais de vigilância de eDNA (por exemplo, gerentes de recursos
naturais, tomadores de decisão AIS, outras partes interessadas) no desenho do estudo de eDNA, no qual esses
usuários finais fornecem informações para formular conjuntamente uma estrutura de apoio à decisão. De acordo com
à orientação de Sepulveda et al. (2020c) e Darling et al. (2021), essas estruturas devem delinear - antes
da amostragem de eDNA - critérios para discernir amostras positivas de eDNA e ações subsequentes,
expectativas para QA-QC crítico, terminologia definida em conjunto (especialmente, falsos positivos) e
planos de comunicação. Esses critérios devem levar em consideração as limitações inerentes à vigilância
de eDNA (e métodos convencionais), bem como os níveis de confiança e/ou risco aceitáveis por ambas
as partes.
Para obter um exemplo de como conseguir isso, consulte Sepulveda et al. (2020c).
Os profissionais também podem aumentar a confiança seguindo as diretrizes de relatórios mínimos.
Isso significa relatar a ocorrência e o tratamento subsequente de problemas de contaminação (Sepulveda
et al. 2020b). Também significa relatar limites observados de detecção e quantificação (Bustin et al. 2009;
Goldberg et al. 2016; Klymus et al. 2020a, b).
Esses dados permitem avaliações críticas da qualidade e integridade dos métodos, resultados e
interpretações do eDNA. Os gerentes, interessados no monitoramento de eDNA, devem empregar
laboratórios de eDNA qualificados e experientes. Evidências sugerem que os resultados do eDNA são
afetados pela experiência do laboratório e são mais confiáveis (repetíveis e reprodutíveis) quando os
profissionais estão familiarizados com a metodologia apropriada do eDNA e utilizam ensaios de alto
desempenho (Hosler et al. 2017; Sepulveda et al. 2020a). Jerde (2021) descreve seis critérios essenciais
para avaliar os resultados da vigilância de eDNA de AIS, que os gerentes podem considerar úteis para
avaliar a força das detecções de eDNA e para tomar medidas de gerenciamento.
Conclusões
A adesão à orientação otimizada descrita acima servirá para melhorar e padronizar os esforços de
vigilância QM-ZM com base molecular em todos os estudos. No entanto, até que desafios específicos
sejam superados, inferências além da simples presença/ausência permanecerão limitadas. Como tal,
os esforços para abordar as lacunas críticas remanescentes são essenciais para os avanços na
interpretação dos dados de pesquisa de base molecular. Com investigação e experimentação contínuas,
podemos refinar ainda mais os níveis e tipos de inferência possíveis e, esperançosamente, por meio de
conhecimento aprimorado e sensibilidade e confiabilidade aprimoradas, fornecer informações cada vez
mais úteis para melhor atender aos objetivos de gerenciamento. Dados os impactos negativos resultantes
das invasões QM-ZM e a relativa facilidade com que as espécies podem se espalhar, é provável que
ambas as espécies continuem na vanguarda dos desenvolvimentos neste campo.
Reconhecimentos
Expressamos gratidão a J. Crossland, X. Guan, D. Lindsay, Y. Passamaneck, WT
Slack, H. Theel, D. Walter e N. Winstead pelas revisões úteis do manuscrito e glossário associado.
Agradecemos também a C. Merkes por contribuir para uma versão inicial da subseção de amplificação
isotérmica mediada por loop. Uma dívida de gratidão é devida a dois revisores anônimos cujos
comentários melhoraram substancialmente o produto final.
A permissão foi concedida pelo Chefe dos Engenheiros para publicar esta informação. As opiniões expressas são
dos autores e não representam necessariamente as dos Estados Unidos
Corpo de Engenheiros do Exército. O uso de nomes comerciais, de produtos ou empresas neste documento é apenas
para fins descritivos e não implica endosso do governo dos EUA.
O financiamento para este estudo foi fornecido pelo Programa de Controle de Plantas Aquáticas do Corpo de
Engenheiros do Exército dos EUA.
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doi.org/10.3390/ijerph16183339

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Um periódico de acesso aberto revisado por pares

NeoBiota 66: 117–159 (2021)

Vigilância avançada de base molecular de mexilhões quagga e

Sheena M. Feist1, Richard F. Lance1

Autor correspondente: Sheena Feist (sheena.m.feist@erdc.dren.mil)

Ensaio, ddPCR, HTS, LAMP, metabarcoding, DNA nuclear, qPCR, veligers

Os mexilhões quagga (Dreissena rostriformis bugensis) e zebra (D. polymorpha) são

Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 119

120 Sheena M. Feist e Richard F. Lance/NeoBiota 66: 117–159 (2021)

onde a abundância de QM-ZM pode ser baixa. As detecções precoces desempenham um

Estudos até o momento

Nesta seção, abordamos a história do desenvolvimento e uso de métodos moleculares para

Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 121

Citação Digite descobertas significativas e outros destaques

• Os níveis de infestação podem ser estimados usando qPCR

Estudos iniciais de DNA usando amostras inteiras

Abordagens de base molecular têm auxiliado no esforço de combater a colonização e

Revisão da literatura de eDNA de Dreissenid (QM-ZM) 123

Tecnologias usadas para amplificar eDNA

Oligonucleótido Fita curta e simples de DNA/RNA sintético. Comumente usado em PCR.

Termos relevantes para validação de método

sensibilidade e a especificidade dos pares de iniciadores de metabarcoding HTS.

relevantes, consulte Bustin et al. (2009) e Klymus et al. (2020b).

discussões relevantes, consulte Klymus et al. (2020b).

avaliar quantitativamente os resultados de eDNA.

Revisão da literatura de eDNA de Dreissenid (QM-ZM) 125

Estudos iniciais do tipo eDNA

Tecnologias de nanopartículas: nanotubos de carbono e espectroscopia de transmissão de

Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 127

128 Sheena M. Feist e Richard F. Lance/NeoBiota 66: 117–159 (2021)

Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 129

130 Sheena M. Feist e Richard F. Lance/NeoBiota 66: 117–159 (2021)

Dreissenid (QM-ZM) revisão da literatura de eDNA 131

cartilha Alvos Sequência (5' a 3')

(ordenado por especificidade crescente)

jgHCO2198 COI R: TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA

Ardura et ai. (2017) (originalmente desenvolvido por Geller et al. 2013)

jgHCO2198 COI R: TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA

Brown et ai. (2016) (originalmente desenvolvido por Zhan et al. 2013)

Klymus et ai. (2017)

Prié et al. (2020)

Marshall e Stepien (2019)

Primers qPCR BASEADOS EM CORANTE

Peñarrubia et al. (2016)

De Ventura e cols. (2017) (originalmente desenvolvido por Bronnenhuber e Wilson 2013)

Blackman e outros. (2020a) (originalmente desenvolvido por Blackman et al. 2020b)

Marshall e outros. (2021)

*Gingera et al. (2017)

nuDNA, nu-rRNA *modificado de Williams et al. (2017)

*Peñarrubia et al. (2016)

Ensaios qPCR BASEADOS EM SONDA

132 Sheena M. Feist e Richard F. Lance/NeoBiota 66: 117–159 (2021)

cartilha Alvos Sequência (5' a 3')

*desenvolvido por Devlin e Youngbull (2019)

CytB Investigação: TAGGTTTTCTTCATACTACTGGC

Amberg et ai. (2019)

Sepúlveda et ai. (2019)