Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

DÒCH NAÕO TUÛY

Muïc tieâu

· Laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû vaø thaáy ñöôïc tính caáp thieát phaûi göûi gaáp dòch naõo tuyû ñeán
phoøng thí nghieäm ñeå caáy ngay ñeå taêng cô hoäi baét ñöôïc vi khuaån gaây beänh.

· Thöïc hieän ñöôïc ñaày ñuû caùc böôùc ñeå khoâng boû soùt caùc cô hoäi phaùt hieän caùc taùc nhaân vi
khuaån gaây beänh nhôø bieát ñöôïc qui trình thöïc hieän vi sinh laâm saøng maãu dòch naõo tuyû, nhôø
vaäy coù theå

· Phaùt hieän ñöôïc caùc taùc nhaân thöôøng gaây vieâm maøng naõo muû duø caùc taùc nhaân naøy ña soá raát
laø khoù moïc vì bieát duøng caùc phöông tieän caàn thieát vaø thích hôïp nhaát ñeå thöïc hieän ñöôïc xeùt
nghieäm vi sinh laâm saøng dòch naõo tuyû.

Chæ ñònh choïc doø dòch naõo tuûy (DNT) khaûo saùt vi sinh laâm saøng

¦ DNT neân ñöôïc choïc doø ñeå khaûo saùt vi sinh laâm saøng tröôùc caùc beänh nhaân coù caùc trieäu
chöùng nghi ngôø vieâm maøng naõo.

¦ Khoâng neân choïc doø DNT tröôùc caùc beänh nhaân coù daáu hieäu gia taêng aùp löïc noäi soï. Daáu hieäu
naày ñöôïc khaùm phaù qua soi ñaùy maét thaáy gai thò bò phuø neà.

Thôøi ñieåm choïc doø DNT

¦ Caøng sôùm caøng toát, ngay sau khi coù chaån ñoaùn laâm saøng.

¦ Tröôùc khi beänh nhaân duøng khaùng sinh ñieàu trò heä thoáng.

Caùch laáy vaø chuyeân chôû

¦ DNT phaûi ñöôïc choïc doø bôûi moät baùc só chuyeân khoa, phöông phaùp voâ truøng.

¦ 5-10ml DNT ñöôïc laáy vaøo 2 loï voâ truøng naép chaët (coù theå duøng tube naép vaøng voâ truøng hay
tube Eppendorf biopure) roài göûi ngay ñeán phoøng thí nghieäm, khoâng chaäm treã. Moät loï khaûo
saùt vi khuaån hoïc vaø moät loï khaûo saùt sinh hoùa teá baøo.

¦ Coù theå caáy ngay taïi giöøông vôùi chai 2 maët thaïch caáy DNT vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm (xem
höôùng daãn vaø qui trình söû duïng chai 2 maët thaïch caáy DNT vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm)

52
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Quan saùt ñaïi theå

Ghi nhaän caùc tính chaát ñaïi theå cuûa DNT, nhö laø:

¦ Trong, keo

¦ Ñuïc, muû

¦ Vaøng, hay vaøng chanh

¦ Coù maùu, coù sôïi fibrin, coù caën

Khaûo saùt vi khuaån hoïc

Khaûo saùt vi khuaån hoïc theo caùc böôùc sau

1. Söûa soaïn beänh phaåm

Ö Neáu DNT ñuïc, khoâng caàn ly taâm.

Ö Caùc tröôøng hôïp khaùc, ly taâm DNT 10 ñeán 15 phuùt ôû toác ñoä cao nhaát cuûa maùy ly taâm
baøn. Laáy phaàn caën khaûo saùt vi theå vaø nuoâi caáy, phaàn nöôùc laøm phaûn öùng hoùa mieãn
dòch phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan vaø laøm phaûn öùng sinh hoùa.

2. Khaûo saùt vi theå

Ö Laøm pheát soi töôi

Nhoû moät gioït caën ly taâm vaøo lame kính, ñaäy lamelle leân. Ñoïc döôùi quang tröôøng
x400, ñoùng bôùt hay haï bôùt tuï quang ñeå thaáy roõ ñoä töông phaûn. Tìm:

­ Baïch caàu (ña nhaân hay lympho), hoàng caàu

­ Vi khuaån, naám men

­ Ñôn baøo (Naegleria fowleri)

Neáu coù naám men nghi Cryptococcus neoformans, quan saùt dòch naõo tuûy döôùi gioït möïc

taøu hay vôùi nigrosin 20%

Ö Laøm pheát nhuoäm

­ Gram

­ Khaùng acid (neáu coù yeâu caàu)

Keát quaû pheát nhuoäm vaø keát quaû soi töôi phaûi thoâng baùo ngay cho Baùc só ñieàu trò.

53
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

3. Caáy phaân laäp vi khuaån gaây beänh

Ö Vì laø maãu beänh phaåm khoâng bò ngoaïi nhieãm neân coù theå caáy nhieàu maàm caáy.

Ö Coù theå chæ caàn caáy vaøo thaïch naâu coù boå sung XV (CAXV), uû ôû nhieät ñoä 35-37oC trong
bình neán.

Ö Neáu khoâng coù ñieàu kieän maø DNT laø cuûa treû con, coù theå caáy vaøo hoäp BA coù vaïch moät
vaïch S. aureus thaúng goùc vôùi ñöôøng caáy maàm caáy ñeå kích thích H. influenzae moïc
ñöôïc, uû ôû nhieät ñoä 35-37oC trong bình neán.

Ö Phaàn DNT coøn laïi coù theå caáy löu döï phoøng (back-up) vaøo dung dòch BHI.

Ö Theo doõi lieân tieáp trong toái ña 3 ngaøy, baát cöù luùc naøo coù söï hieän dieän cuûa khuùm vi
khuaån, tieán haønh ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà. Neáu coù ñieàu kieän, ñònh type hay group
huyeát thanh cuûa vi khuaån.

Ö Vì vieâm maøng naõo muû (VMNM) laø moät beänh nguy hieåm, ñe doïa tính maïng, neân moät
khi coù vi khuaån moïc thì phaûi tieán haønh nhuoäm Gram khuùm vi khuaån vaø keát hôïp vôùi
tính chaát khuùm vi khuaån moïc treân moâi tröôøng phaân laäp, phaûi traû lôøi keát quaû taïm thôøi
cho Baùc só laâm saøng ngay.

Ö Neáu coù yeâu caàu tìm C. neoformans, caáy DNT treân thaïch Sabouraud, vaø treân BHI, uû ôû
nhieät ñoä 35-37oC. Cuõng theo doõi lieân tuïc trong 3 ngaøy.

Ö Neáu coù yeâu caàu tìm M. tuberculosis, caáy DNT vaøo moâi tröôøng Lowenstein-Jensen
(neân caáy 3 oáng), uû ôû nhieät ñoä 35-37oC. Theo doõi lieân tuïc trong 2 thaùng.

Tìm khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån gaây beänh thöôøng gaëp trong DNT

baèng caùc phöông phaùp hoùa mieãn dòch

Coù theå phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån gaây beänh coù trong DNT baèng moät trong
caùc phaûn öùng hoùa mieãn dòch nhö:

¦ Tuï latex vôùi boä thuoác thöû MENINGITEX, PASTOREX..

¦ Ñieän di mieãn dòch ñoái löu (CCIE)

¦ ELISA

54
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau
Trong caùc phöông phaùp treân thì phöông phaùp tuï latex cho keát quaû nhanh nhaát (khoâng quaù 3
phuùt), ñôn giaûn nhaát (coù theå thöïc hieän ngay taïi giöôøng beänh), ít chòu aûnh höôûng cuûa caùc thoâng
soá kyõ thuaät, vaø raát nhaïy caûm.

Taùc nhaân vi khuaån gaây vieâm maøng naõo

¦ Treû sô sinh (cho ñeán 2 thaùng tuoåi)

Ö Escherichia coli,

Ö Caùc Enterobacteriaceae khaùc (Salmonella spp, Citrobacter spp),

Ö Streptococcus agalactiae (nhoùm B),

Ö Listeria monocytogenes,

¦ Caùc löùa tuoåi khaùc

Ö Haemophilus influenzae type b(a),

Ö Neisseria meningitidis,

Ö Streptococcus pneumoniae,

Ö Mycobacterium tuberculosis,

Ö Listeria monocytogenes(b),

Ö Cryptococcus neoformans(b),

Ö Staphylococci(c).

Baûng 1: Bieän luaän keát quaû sinh hoùa-teá baøo-vi theå-ñaïi theå dòch naõo tuyû ñeå töø ñoù coù theå suy
ñoaùn ra ñöôïc taùc nhaân vi sinh vaät gaây vieâm maøng naõo muû

Thoâng soá VMN vi khuaån VMN lao VMN vi naám VMN virus
Baïch caàu Ña nhaân Ñôn nhaân Ñôn nhaân Ñôn nhaân
Glucose Raát thaáp Thaáp Thaáp Bình thöôøng
5-20mg/100ml 20-40mg/100ml 20-40mg/100ml 65-70mg/100ml
Protein Taêng Taêng Taêng Hôi taêng trong
giai ñoaïn ñaàu
Vi theå Thöôøng phaùt hieän Hieám khi thaáy Thöôøng phaùt AÂm tính
ñöôïc vi khuaån ñöôïc AFB hieän ñöôïc vi naám
Ñaïi theå Ñuïc Vaøng chanh Ñuïc nheï Trong

(a)
Laø taùc nhaân gaây VMNM thöôøng gaëp nhaát ôû tuoåi töø 6th. ñeán 2t. Hieám ôû tuoåi treân 5t.
(b)
Gaëp ôû ngöôøi bò suy giaûm mieãn dòch (vd AIDS)
(c)
Gaëp ôû ngöôøi chòu phaåu thuaät soï naõo hay sau daãn löu

55
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau
Caâu hoûi oân taäp
1. Cho bieát caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå caáy dòch naõo tuûy, vaø thôøi ñieåm toát nhaát ñeå laáy dòch
naõo tuûy.
2. Haõy cho bieát caùc caùch laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm
xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng.
3. Haõy cho bieát phöông tieän laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû thích hôïp nhaát cho caùc beänh
vieän hieän nay, vaø phaân tích caùc öu khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông tieän naøy.
4. Haõy cho bieát qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng thöïc hieän taïi phoøng thí nghieäm ñoái
vôùi beänh phaåm dòch naõo tuûy.
5. Haõy cho bieát caùc vi khuaån gaây beänh coù theå gaëp ñöôïc trong caáy dòch naõo tuûy.
6. Haõy cho bieát caùc phöông phaùp hoaù mieãn dòch phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi
khuaån gaây beänh vieâm maøng naõo muû coù trong dòch naõo tuyû. Phaân tích caùc öu khuyeát
ñieåm cuûa caùc phöông phaùp naøy.
7. Bieän luaän keát quaû sinh hoùa teá baøo xeùt nghieäm dòch naõo tuûy.

Naegleria fowleri C. neoformans soi döôùi C. neoformans

soi töôi döôùi KHV KHV ñaûo phase soi töôi döôùi KHV

Hình 15:
Moät soá hình aûnh quan saùt
tröïc tieáp pheát soi töôi hay
pheát nhuoäm Gram caùc maãu
dòch naõo tuyû beänh nhaân
VMNM

Neisseria meningitidis qua Streptococcus pneumoniae

pheát Gram dòch naõo tuûy qua pheát Gram dòch naõo tuûy

56
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Saûn phaåm lieân quan:

Chai hai maët thaïch CAXV ñeå caáy dòch naõo tuyû hay caùc

chaát dòch khoâng taïp nhieãm khaùc

Muïc ñích söû duïng

Chai caáy hai maët thaïch CAXV ñaõ ñöôïc nghieân cöùu saûn xuaát ra ñeå thöïc hieän ñöôïc kyõ thuaät
caáy taïi giöôøng hay caáy trong phieân tröïc caùc maãu dòch naõo tuyû; hay caùc dòch khoâng taïp
nhieãm khaùc nhö dòch maøng phoåi, muû abcess, dòch maøng buïng, dòch maøng tim, dòch khôùp...

Ñoùng goùi

Chai caáy hai maët thaïch CAXV laø chai baèng polystyrene coù ñoå hai maët thaïch CAXV treân
hai maët hoâng cuûa chai. Chai coù naép vaën chaët vôùi maët naép baèng cao su deã daøng ñaâm kim
bôm maàm caáy vaøo. Chai coøn coù moät naép ngoaøi boïc baûo veä lôùp naép trong. Taát caû ñöôïc boïc
kín baèng maøng co.
Naép ngoaøi
Caùch söû duïng

¦ Xeù raùch maøng co, ruùt naép ngoaøi khoûi naép

trong. Naép cao su

¦ Môû naép trong ñeå cho beänh phaåm traùng leân

Naép trong
hai maët thaïch, sau ñoù vaën chaët laïi naép
Thaïch CAXV
trong. Coù theå khoâng môû naép trong maø
Thaân chai
duøng bôm tieâm huùt laáy beänh phaåm roài
polystyrene
bôm beänh phaåm qua naép cao su (sau khi Thaïch CAXV
saùt truøng baèng coàn vaø ñeå khoâ) ñeå traùng leân
hai maët thaïch. Ñeå chai naèm leân maët beân
(khoaûng vaøi phuùt cho moãi maët beân) ñeå
beänh phaåm ñöôïc traùng ñeàu leân 2 maët
thaïch. Sau ñoù döïng ñöùng chai leân, nôùi
Hình 16: Caáu truùc cuûa chai 2 maët thaïch
loûng naép trong, ñaäy naép ngoaøi leân, cho CAXV duøng caáy dòch naûo tuyû vaø
caùc dòch khoâng taïp nhieãm khaùc.

57
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau
vaøo bình neán vaø ñeå vaøo tuû aám 35-37oC. Neáu laø tuû aám CO2 thì khoâng caàn cho vaøo bình neán.

¦ Quan saùt khuùm vi khuaån moïc treân hai maët thaïch moãi ngaøy trong 2 ngaøy.

¦ Do maët thaïch caáy beänh phaåm laø thaïch CAXV giaøu boå döôõng vaø giaøu XV, do vaäy taát caû caùc
vi khuaån duø khoù moïc nhö H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae ñeàu coù theå moïc
ñöôïc. Khi thaáy coù söï hieän dieän cuûa baát kyø khuùm vi khuaån naøo moïc treân maët thaïch thì phaûi
laøm pheát nhuoäm Gram ñeå quan saùt hình thaùi vi khuaån vaø tieán haønh ñònh danh, khaùng sinh
ñoà theo höôùng maø hình aûnh Gram vi khuaån gôïi yù.

MENINGITEX – phaùt hieän nhanh khaùng nguyeân hoøa tan

caùc vi khuaån thöôøng gaây vieâm maøng naõo muû

Nguyeân taéc thöû nghieäm

Thöû nghieäm thöïc hieän döïa theo nguyeân taéc cuûa phaûn öùng tuï latex, caùc khaùng theå ñaëc hieäu
ñöôïc gaén treân haït latex seõ bò tuï laïi khi gaëp caùc khaùng nguyeân töông öùng, vaø hieän töôïng tuï
naày seõ thaáy ñöôïc baèng maét thöôøng.

Thaønh phaàn thuoác thöû

Moät boä thuoác thöû goàm 5 tube naép chaët chöùa thuoác thöû laø 1 ml huyeàn dòch caùc haït latex ñaõ
ñöôïc gaén khaùng theå ñaëc hieäu Neisseria meningitidis group A (loï NMA), Neisseria
meningitidis group B (loï NMB), Neisseria meningitidis group C (loï NMC), Haemophilus
influenzae (loï Hib) vaø Streptococcus pneumoniae (1 loï PNE). Ngoaøi ra coøn coù loï chöùa 200ml
khaùng nguyeân chöùng (loï C[+]). Hoäp thuoác thöû phaûi ñöôïc baûo quaûn taïi nhieät ñoä 4oC, coù haïn
duøng 2 naêm töø sau ngaøy saûn xuaát.

Phöông phaùp thöïc hieän thöû nghieäm

Chuaån bò moät lame soi kính hieån vi môùi, lau saïch baèng coàn, roài sau ñoù lau khoâ. Nhôù khi caàm
lame phaûi caàm treân caïnh lame chöù khoâng caàm treân maët lame. Duøng buùt acetone hay buùt môõ
keû 5 oâ treân lame. Nhoû leân moãi oâ moät gioït (khoaûng 10ml) dòch naõo tuûy (DNT). Laéc maïnh caùc
tube thuoác thöû MENINGITEX ñeå thaønh huyeàn dòch ñuïc ñeàu nhö söõa. Sau ñoù nhoû treân oâ ñaàu

58
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau
tieân moät gioït (khoaûng 10ml) NMA, oâ thöù 2 moät gioït (khoaûng 10ml) NMB, oâ thöù 3 moät gioït
(khoaûng 10ml) NMC, oâ thöù 4 moät gioït (khoaûng 10ml) Hib, oâ thöù 5 moät gioït (khoaûng 10ml)
PNE. Thay ñaàu coâne sau moãi laàn laáy vaø nhoû thuoác thöû treân lame. Duøng que taêm troän ñeàu
gioït thuoác thöû vaøo gioït dòch naõo tuûy, vöøa troän vöøa traûi roäng hoãn hôïp ra cho gaàn ñaày maët oâ,
nhôù thay que taêm sau khi troän hoãn hôïp trong moãi oâ. Sau khi troän xong, giöõ caïnh lame giöõa
hai ngoùn troû vaø caùi vaø laéc nghieâng tôùi roài nghieâng lui trong voøng 3 phuùt, vöøa laéc vöøa quan
saùt xem oâ naøo tuï laïi ñeå ghi nhaän keát quaû [+] khaùng nguyeân hoøa tan cuûa vi khuaån gaây beänh
coù trong dòch naõo tuûy töông öùng vôùi khaùng theå ñaëc hieäu coù trong gioït thuoác thöû. Coù hieän
töôïng tuï trong oâ khi caùc haït latex khoâng coøn ôû daïng huyeàn dòch ñuïc ñeàu nhö söõa maø tuï laïi
thaønh haït lôïn côïn traéng treân neàn dung dòch trong daàn ñi. Haït lôïn côïn traéng caøng lôùn khi phaûn
öùng tuï caøng maïnh, caøng nhoû khi phaûn öùng tuï caøng yeáu. Neáu sau 3 phuùt phaûn öùng tuï chöa
thaáy roõ, coù theå quan saùt qua moät göông loõm aûnh phaûn chieáu cuûa caùc oâ qua göông loõm ñeå
phaùt hieän hieän töôïng tuï.

Kieåm tra thuoác thöû

Cöù moãi vaøi thaùng kieåm tra thuoác thöû xem coù coøn ñuû nhaïy khoâng vôùi chöùng [+] vaø vôùi nöôùc
muoái sinh lyù. Thöïc hieän treân 2 lame soi kính hieån vi, moãi lame cuõng keû 5 oâ. Thöïc hieän nhö
treân nhöng treân moät lame, thay vì nhoû vaøo moãi oâ 1 gioït DNT, cho vaøo moãi oâ moät gioït 10 ml
chöùng [+] (töø loï C[+]), vaø treân lame kia cuõng thay vì nhoû vaøo moãi oâ 1 gioït DNT thì nhoû vaøo
moãi oâ moät gioït 10 ml nöôùc muoái sinh lyù. Thuoác thöû coøn hieäu löïc khi caû 5 oâ nhoû chöùng [+] ñeàu
coù hieän töôïng tuï so vôùi caû 5 oâ nhoû nöôùc muoái sinh lyù ñeàu khoâng coù hieän töôïng tuï.

DNT

Ñoïc keát quaû: Hib

NMA NMB NMC Hib PNE

Chöùng aâm (nöôùc muoái SL) Chöùng [+]

Hình 17: Moâ taû caùch laøm xeùt nghieäm phaùt hieän caùc vi khuaån gaây beänh coù trong dòch naõo tuûy
baèng boä thuoác thöû MENINGITEX

59
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Hình 18: Chai 2 maët thaïch CAXV caáy dòch naõo tuyû vaø caùc dòch khoâng taïp
nhieãm khaùc, raát thích hôïp trong caùc phieân tröïc khi phoøng thí
nghieäm khoâng coù nhaân vieân tröïc chuyeân khoa vi sinh.

B C D

Hình 19: Caùc phöông tieän thích hôïp ñeå laáy dòch naõo tuyû coù theå laø: (A) Tube
ly taâm voâ truøng 15ml naép vaën (traùi), (B) tube voâ truøng 5ml, tube
voâ truøng 1.8ml, vaø (D) tube naép baät kieåu Eppendorf biopure.

60
 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau
Ly taâm 3000 rpm/10 min.
DNT ñuïc DNT trong
D0

Nhoû 3-5 gioït DNT leân CAXV

Caáy traûi ñeàu
KSTT qua nhuoäm GRAM

UÛ 37oC/CO2/qua ñeâm

Neáu coù hieän dieän VK

MENINGITEX phaùt hieän
KN hoøa tan
KSTT qua nhuoäm GRAM
Neáu khoâng coù VK
Laøm KSÑ tröïc tieáp Nhoû 3-5 gioït DNT leân CAXV
Caáy traûi ñeàu

Neáu coù hieän dieän VK Neáu khoâng coù VK

KQ sô boä hình daïng
vaø Gram vi khuaån UÛ 37oC/ CO2/qua ñeâm

KQ sô boä cuûa KQ sô boä hình daïng Chôø KQ caáy

Chôø KQ caáy MENINGITEX vaø Gram vi khuaån

D1 KQ sô boä KSÑ tröïc tieáp

Ñònh danh, khaùng sinh ñoà Coù VK moïc Khoâng coù VK moïc KQ chung cuoäc aâm nghieäm

Sô ñoà 5: QUI TRÌNH VI SINH LAÂM SAØNG MAÃU DÒCH NAÕO TUÛY

D2
Keát quaû chung cuoäc:
Ñònh danh VK vaø KSÑ
61