Erdélyi Balázs – Bódai Viktória

Fermentia Kft.: BactoFil oltóanyag

gyártása

Szeretettel köszöntjük Vendégeinket!

 A „GYOKI” fermentációs kísérleti üzem
története

2006 2006
1990 GYKI
Fermentia
Fermentációs megszűnése Kft.
1951-1967
GYKI – üzem megalapítása
Berlini utca áthelyezése

GYKI
alapítása -
1950 KÖBIKULA

12 originális
készítmény
800 szabadalom 2
 Fermentia Mikrobiológiai Kft.

Talajbaktérium gyártása 2007. óta

• Unikum a versenytársak között: ISO 9001 és ISO 14001

• Fejlett termelőeszközök és tapasztalt, jól képzett
munkatársak
• A tenyészetek aktivitásának folyamatos ellenőrzése
 Talajbaktériumok
• Természetesen a talajban élő (PGPR – Plant Growth
közösségek Promoting Rhizobacteria)
• Előnyös tulajdonságaik miatt
kiválasztott törzsek

• Baktériumközösségek,
mikróbakozmoszok

• Intenzív termelés miatt

átlagosan 3-4 nagyságrenddel
csökkent a talajok
mikróbaszáma
 PGPR – mit várhatunk?
- Nitrogén kötés (Azotobacter, Rhizobacterium,
Azospirillum)
- Fitohormon (PGRs) termelés (Azospirillum,
Micrococcus)
- Tápanyag felvételének javulása – P, K mobilizálás
(Bacillus)
- Biokontroll - sziderofór termelés (Pseudomonas,
Cellvibrio)
- Talajszerkezet minőségének javulása (Streptomyces,
Micrococcus)
 Mitől lesz megbízható a baktériumtrágya?
High-Tech technológiával készül a BactoFil® termékcsalád

A talajbaktériumok minőségét gyakorlatilag

100%-ban a gyártástechnológia dönti el.
.
 Megfelelő termelő eszközök
1. Steril munkára alkalmas, felszerelt mikrobiológiai
laboratóriumok
2. Aszeptikus léptéknövelésre alkalmas
fermentorpark a kiszolgáló energia és
segédenergia rendszerekkel
3. Megfelelő hűtőkapacitás
 Fermentorpark
• Léptéknöveléshez szükséges fermentorpark
• Szabályozott paraméterek: pH, DO
• Archivált adatok, visszaellenőrizhetőség
• Karbantartások kidolgozása és betartása ISO9001
• Steril futások
Folyamatszabályozás – XXI. sz.
Szabályozott
és archivált
paraméterek:
- T
- Nyomás
- pH
- DO
- Keverés
- habzás
 Fermentorpark

ISO9001

Karbantartások kidolgozása és betartása

Az éves tisztítási polírozást megelőző és azt követő állapot.

 Mikrobiológiai laboratórium
Feladatai:
1. Ellenőrzött törzsfenntartás (WSC)
2. Gyártásközi és késztermék minták vizsgálata
3. Üzemi oltóanyagok előállítása
4. Együttes kijuttatás vizsgálata
Szükséges eszközök:
Lamináris box, mikroszkóp, inkubátorok, VRK/HPLC,
spektrofotométer, autóklávok, ultramély fagyasztó, mérlegek,
centrifugák
ISO9001
 Minőségi oltóanyag gyártás
1) A szükséges tulajdonságok fenntartása:
• Nitrogénkötés ellenőrzése – szaporítás N-mentes táptalajon
• Foszfátmobilizálás: feltisztulási zónák
• PGRs termelés: VRK nyomonkövetés
• Megfelelő oltóanyag mennyiség:
sejtszám, azaz cfu
2) Steril munkára alkalmas laborok és aszeptikus
gyártósor
3) Gyártásirányítási és archiválási rendszer
4) Gyártásközi minőség-ellenőrzés (HACCP)
 Ellenőrzött törzsfenntartás
1. Életképes, homogén tenyészetek biztosítása

2. Törzsek elvárt tulajdonságainak ellenőrzése

1. Fitohormon termelés – VRK
2. Foszfor mobilizálás – feltisztulási zónák
3. Nitrogén kötés – nitrogén mentes táptalajok alkalmazása
4. EPS termelés – alkoholos kicsapás
5. Sziderofór – CAS agar, UV fény alatti fluoreszkálás

ISO9001
 Ellenőrzött törzsfenntartás
Életképes, homogén tenyészetek folyamatos
biztosítása
Törzsek elvárt tulajdonságainak ellenőrzése:

1. Fitohormon termelés – VRK,

•Auxin: IAA
•Zeatin
•Gibberelin
•Abscizinsav
TLC, hormonok mérése
 Ellenőrzött törzsfenntartás
Életképes, homogén tenyészetek folyamatos biztosítása
Törzsek elvárt tulajdonságainak ellenőrzése:

2. Foszfor mobilizálás – feltisztulási zónák

 Ellenőrzött törzsfenntartás
Életképes, homogén tenyészetek folyamatos biztosítása
Törzsek elvárt tulajdonságainak ellenőrzése:

4. EPS termelés – alkoholos kicsapás

 Ellenőrzött törzsfenntartás
Életképes, homogén tenyészetek folyamatos biztosítása
Törzsek elvárt tulajdonságainak ellenőrzése:
5. Sziderofór – CAS agar, UV fény alatti fluoreszkálás
 A BactoFil törzsek pH toleranciája

pH Ab (7,07) Al (5,27) Av (5,95) Mr (5,25) Pf (4,6) Bm (5,06) Bc (6,9) Bp (6,4) Cg (5,08) Cf (4,94)
K +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
6,00 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
5,50 +++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ ++
5,00 ++ ++ +++ +++ + ++ +++ 0 + +
4,50 0 ++ ++ ++ + 0 +++ 0 0 +
4,00 0 ++ ++ + 0 0 +++ 0 0 0
3,50 0 + 0 0 0 0 ++ 0 0 0
3,00 0 + 0 0 0 0 ++ 0 0 0

Magyarázat: a törzsek kezdőbetűi utáni zárójelben a 2 napos tenyészetek pH értéke látható.

A „K” a pH állítás nélkül szélesztett kontroll sejtszám, amihez képest viszonyítottuk a pH állított tenyészetek cfu értékeit.
A +++ jelenti azt, hogy a Bürker kamrában számolt sejtszám kinőtt Petri csészén. A ++ egy, míg a + két nagyságrendi

cfu (élőképes csíraszám) csökkenést jelent.

 Kiszerelés - hűtőkapacitás
• 1. Egyedileg tenyésztett törzsek, homogén
tenyészetének gyors lehűtése
• 2. Kiszerelés után folyamatos, konstans
hőmérséklet biztosítása

Nemzeti Klímavédelmi
Hatóság

ISO9001
 A Micrococcus roseus törzs életképessége
az oltott talajban

Mintavétel ideje Csúcsmagasság (rel %)

Zimány62-semleges pH Zimány33-gyengén savanyú pH
oltott talaj oltott talaj

A csúcsmagasság arányos az oltótörzs sejtszámával a talajban

oltás előtt 0,15 0,08
oltás után 1 héttel 2,12 2,03
oltás után 2 héttel 2,00 4,04
oltás után 4 héttel 3,80 2,84

A M. roseus törzs szignifikánsan kimutatható az oltott talajokban

 In vivo nyomonkövetés a. talajban
A csúcsmagasság arányos
az oltótörzs sejtszámával a talajban
A nem oltott talaj DNS profilja

P. fluorescens

A. brasilense
A. vinelandii B. megaterium
A. lipoferum
M. roseus
B. circulans
Az oltott talaj DNS profilja

P. fluorescens
A BactoFil törzsek DNS profilja
B. megaterium
A. vinelandii
A. lipoferum
A. brasilense

M. roseus
B. circulans
Hatás nyomonkövetése a talajban
Hatás nyomonkövetése a talajban
Hatás nyomonkövetése a talajban
BactoFil A10 és B10
 Nitrogénkötők
Hasznos Baktérium Hatásmód, Lehetséges
Élőhely
tulajdonság komponens hatékonyság gazdanövény

Azotobacter Növénymentes Bármilyen

talajban vagy a 5 – 10 kg * ha-1 talajban,
Cyano- talajfelszínen N2- évente gazdanövény
baktérium fajok semleges
A légköri Asszociatív
nitrogén módon gyökér- Gabonafélék,
Azospirillum 5 – 30 kg * ha-1
belsőben a sejt köles, kukorica,
biológiai Herbaspirillum
közötti
N2- évente
cirok stb.
megkötése járatokban
Rhizobium Jól látható Pillangósok
gyökér- 30 –260 kg * ha-1
Bradyrhizobium
N2- évente (lucerna, borsó,
gümőkben
Synorhizobium bab, szója)

TALAJÖKOLÓGIA HEFOP 3.3.1.előadás

 Az Azotobacter nemzetség
•Nagyméretű, ovális krumpi alakú sejtek
•Pálcák, coccusok, kokkoid formáig is változhat, pleomorf
•egyedül vagy párosával fordul elő, de láncba is állhat
•endospórát nem képez, de mikrocisztát igen
•kataláz pozitív
•Optimális hőmérsékletük: 20-30°C (in vitro)
•néha mozgásképes, csillók
•Gram negatív, néha Gram- variabilis
•víz/talajban élnek
•Minimum pH 4,5, jól levegőzött talajt kedveli, oxigénvédelmi
mechanizmusa van
•öreg kultúrákban mikrociszta képződik
• UV ellenálló
• kiszáradás ellen véd
Néhány faj: A. vinelandii; A. chrococcum; A. agilis;
A. armeniacus, A. beijerinckii; A. nigricans;
A.macrocytogenes; A. paspali; A. salinestris;
A. tropicalis; (A. beijerinckii subsp.acidotolerans)
 Az Azospirillum nemzetség
• Szabadon élő nitrogénkötő mikroorganizmusok, de gyökér közelben
asszociatív
• Sejtjei spirillum alakúak, poláris flagellummal mozognak
• Gram-negatív baktérium
• Aerobok, mikroaerofilek
• Általában a trópusi és a mérsékelt övi talajok, rizoszférában
• képes cisztát alkotni, és aggregálódni
• extracelluláris poliszacharidokat termel
• Oxidáz pozitívak, általában kataláz pozitívak
Izolálása:
• Az Azospirillum törzs talajjal vagy gyökér darabokkal inokulált
nitrogénmentes táptalajon izolálható
Képviselői:
A. amazonense ; A. brasilense; A. canadense; doebereinerae;
A. halopraeferens, A. lipoferum; A. oryzae;
 Rhizobium törzsek
• Szimbióta nitrogénkötő baktérium
• Aerob, kemotróf, spórát nem képez
• Könnyen szaporítható in vitro
• A sejtek kicsik (0,5-0,9 x 1,2-3,0 µm)
• Gram negatív, pálca
• Mozgásképesek
• Extracelluláris poliszacharidot termelnek
• Hajszálgyökereken történő behatolásra
a gazdanövény felgyorsított sejtosztódással
válaszol: gyökérgümő képzés

Néhány képviselője:
R. alamii; R. alkalisoli, R. aggregatum,R. borbori; R.cellulosilyticum; R. daejeonense; R.
endophyticum; R. etli; R. leguminosarum; R. mediterraneum; R. phaseoli; R. japonicum; R.
tibeticum;

32
 Pseudomonas sp.
A Pseudomonas sp. általánosan elterjedt
talajfertőtlenítő hatású, sziderofór termelő
és foszfor mobilizáló talajbaktérium.
Fontosabb fajok: P. fluorescens, P. putida

•Aerob,
•Gram negatív,
Fe3+ •Mozgó pálca,
•Sziderofor termelés: pseudobacin
(Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 9td)
http://www.jbc.org/content/270/45/26723.full.
html#content-block
 Micrococcus roseus
A Micrococcus roseus EPS termelése
miatt a talajszerkezet javítás, foszfát
immobilizálás, valamint PGR
aktivitása miatt fontos baktérium.
•Aerob,
•Gram pozitív,
•Gömbölyű,
• egyesével, párosával, öregedésnél
szőlőfürtszerűen rendeződnek,
•Mozgásképtelenek
•nincs ismert nyugvó stádiumuk
(Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 9td)
 Bacillus sp.

• Gram +, obligát aerob, spóraképző

• Általában jól szaporíthatóak
• Kálium mobilizálás
• Foszfor (PO4) mobilizálás
• Celluláz aktivitás

Talajoltás szempontjából jelentős fajok:

B. cereus, B. megaterium, B. circulans, B. thuringiensis, B.
subtilis, több száz faj
 Streptomyces sp.
Actinomycetales osztályába tartozó,
Gram+, álhifát képező sugárgombák.
Aerob, spóraképzők
Az egészséges talaj illatáért felelős baktériumok
Lassabban nőnek

Szerepük a talajoltásban: biokontroll, talajszerkezet

javítása, lebontási folyamatok
Fontosabb fajok: S. albus, S. griseoviridis
 Cellvibrio sp.
A Cellvibrio fajok mezőgazdasági művelésre bevont talajokban gyakran előforduló aerob
cellulózbontó baktériumok.
• Jól alkalmazkodtak a talaj klímájához, azaz 4-20°C között szaporodnak.
(a beforgatott kukoricaszár a talaj felső 15-30 cm-ben kerül elbontásra)
• Cellulázokon kívül számos már extracelluláris enzimet termelnek (xilanáz)
• Nitrogénkötők jelenlétében fordulnak elő.

•Aerob,
•Gram negatív,
•mozgó,
•enyhén hajlott,
•apró pálca formájú nemzetség.
(Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 9th ed)

Cellvibrio sp .
 BactoFil Cell
A BactoFil Cell a cellulózbontó baktérium (Cellvibrio ostraviensis)
mellett nitrogén fixáló és talajfertőtlenítő baktériumokat is
tartalmaz.
A Pseudomonas fluorescens általánosan elterjedt talajfertőtlenítő
és foszfor mobilizáló hatású talajbaktérium.
A nitrogénkötő Azotobacter vinelandii a cellulózbontók által
termelt cukrokat hasznosítva a növények számára felhasználható
nitrogént állít elő. Javítja a növények tápanyagellátását és
gyorsítja a cellulózbontás folyamatát. Nitrogéntermelésük révén
csökkentik a pentozán-hatást.

pH: 5,1±0,5; cfu: min. 3 x 109

Azotobacter sp .
 Az elbontandó alapanyagok
A kukoricarost cellulóz/xilán alapú rostokból áll. A fák anyagának összetételéhez hasonlóan
a különösen kemény kukoricarost (pl. kukoricacsutka) nemcsak cellulózt tartalmaz, mint
szénhidrátot, hanem hemicellulózt is, ami pentóz (arabinóz és xilóz) egységekből álló
poliszacharidok (arabinán és xilán) elegye.
A hemicellulóz a cellulózzal ellentétben
heteropolimer, nagyrészét arabinoglukán
alkotja. Ennek 65%-a xilóz, 35%-a
arabinóz. A hemicellulóz fermentálható
cukrokká való bontásáról (szacharifikáció)
számos kutatás zajlott.

Ezt a műveletet celluláz és

xilanáz enzimeket termelő
baktériumokkal végezhetjük.
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!

40