Machine Translated by Google
J. Thú y. Khoa học. (2005), 6(1), 7–19
Phân lập và định danh Escherichia coli O157:H7 bằng các phương
pháp phát hiện khác nhau và xác định phân tử bằng PCR ghép kênh và
RAPD
Ji-Yeon Kim1,2, So-Hyun Kim2 ,Nam Hoon Kwon2 ,Won Ki Bae2 ,Ji-Youn Lim2 , Hye Cheong Koo2 ,
Jun-Man Kim2 , Kyoung Min Noh2 , Woo Kyung Jung2 , Công viên Kun Taek2, Công viên Yong-Ho2,*
1
Cục Chẩn đoán bệnh động vật, Cơ quan Nghiên cứu và Kiểm dịch Thú y Quốc gia, Anyang 430-824, Hàn Quốc
2
Khoa Vi sinh, Trường Cao đẳng Thú y và Trường Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Đại học Quốc gia Seoul,
Seoul 151-742, Hàn Quốc
Escherichia coli O157:H7 được công nhận là mầm bệnh lây
truyền qua thực phẩm đáng kể, vì vậy việc xác định nhanh
chóng là rất quan trọng để quản lý vệ sinh thực phẩm và
điều tra dịch tễ học nhanh chóng. Dữ liệu phổ biến hạn
chế về độc tố Shiga sản sinh ra E. coli (STEC) và E. coli
O157:H7 trong thực phẩm và động vật ở Hàn Quốc khiến việc
đánh giá rủi ro trở nên khó khăn và các phương án quản lý
và kiểm soát không rõ ràng. Tỷ lệ phổ biến của các sinh
vật được kiểm tra bằng bộ kit-E mới được phát triển. coli
O157:H7 Bộ kit nhanh. Để phân lập E. coli O157:H7, phương
pháp nuôi cấy thông thường, phân tách từ tính miễn dịch
và bộ kit nhanh E. coli O157:H7 đã được áp dụng, đồng thời
thực hiện PCR đa hình và DNA đa hình được khuếch đại ngẫu
nhiên (RAPD) để xác định phân tử. Có mối liên quan phân tử
cao giữa 11 chủng phân lập của Hàn Quốc và 17 chủng của
Hoa Kỳ ở mức 63%. Ngoài ra, sự khác biệt rõ rệt giữa các
dòng phân lập ở lợn và bò cũng đã được xác định. Nó ngụ ý
rằng RAPD có khả năng phân biệt các chủng có nguồn gốc khác
nhau, tuy nhiên nó không thể phân biệt giữa các chủng phân
lập theo sự khác biệt về mức độ độc lực của chúng.
Trong các xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh, 45,5% chủng phân
lập cho thấy khả năng kháng kháng sinh với hai loại kháng sinh trở lên.
Không giống như các chủng phân lập từ các quốc gia khác,
các chủng E. coli O157:H7 phân lập trong nước chủ yếu
kháng ampicillin và tetracylines. Tóm lại, việc áp dụng bộ
kit nhanh E. coli O157:H7 có thể hữu ích để phát hiện E.
coli O157:H7 do độ nhạy và sự tiện lợi của nó. Hơn nữa,
phân tích kết hợp PCR đa kênh cùng với RAPD có thể hỗ trợ
khảo sát các đặc điểm của các chủng phân lập.
Từ khóa: Escherichia coli O157:H7, PCR multiplex,
RAPD
*Tác giả liên hệ
ĐT: 82-2-880-1257; Fax: 82-2-871-7524
E-mail: yhp@snu.ac.kr
Giới thiệu
Escherichia coli (STEC) sản sinh độc tố Shiga đã được công
nhận là nguyên nhân quan trọng gây ra các bệnh ở người như
hội chứng tan máu tăng urê huyết (HUS) [29,36]. STEC là một
trong những nguyên nhân quan trọng nhất gây ra bệnh do thực
phẩm trên toàn thế giới. Kể từ báo cáo đầu tiên của Riley et
al. [38], STEC có liên quan đến các đợt bùng phát và các
trường hợp bệnh lẻ tẻ ở người, từ tiêu chảy không biến chứng
đến viêm đại tràng xuất huyết và HUS. Bệnh ở người sau khi
nhiễm STEC thường dẫn đến triệu chứng riêng ở đường ruột,
chẳng hạn như đau bụng và tiêu chảy có máu hoặc không có
máu, hoặc ít gặp hơn là các biến chứng toàn thân nghiêm
trọng. Các biến chứng liên quan đến nhiễm trùng STEC phần lớn
liên quan đến sự phát triển của bệnh lý vi mạch huyết khối ở
một số vị trí. Điều này đặc biệt phổ biến ở thận và kết quả
cuối cùng là sự phát triển của HUS, được đặc trưng bởi bộ
ba suy thận cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu. Một số cơ quan
khác ngoài thận thường liên quan đến các biến chứng liên
quan đến STEC. Hệ thống thần kinh trung ương và tuyến tụy
là mục tiêu thường xuyên [1]. Ngoài con người, STEC có thể
gây thiệt hại cho động vật. Ví dụ, STEC gây hoại tử ống thận
ở chuột và làm tổn thương một số tế bào nội mô ở lợn và thỏ.
Chó săn thỏ được tiêm STEC sẽ phát triển các tổn thương
mạch máu ở cầu thận tương tự như những tổn thương gặp ở
bệnh nhân mắc HUS [3].
Người ta đã phát hiện ra rằng STEC sản sinh ra một họ độc
tố tế bào có liên quan được gọi là độc tố Shiga (Stxs).
Chúng được phân loại thành hai lớp chính là Stx1 và Stx2.
Trong khi họ Stx1 rất đồng nhất, một số biến thể Stx2 đã
được xác định. Các biến thể này là: Stx2c và Stx2d được tạo
ra bởi các chủng phân lập STEC ở người, Stx2e thường được
tìm thấy trong STEC gây bệnh cho lợn và Stx2f, được mô tả
gần đây trong các phân lập STEC từ chim bồ câu hoang dã [40].
STEC có thể tạo ra Stx1, Stx2 (hoặc các biến thể của nó) hoặc cả hai. Stx2
Machine Translated by Google

8 Ji-Yeon Kim và cộng sự.

chịu trách nhiệm về các tổn thương hoại tử nghiêm trọng ở ống thận hiệu quả của việc phân lập E. coli O157:H7, bao gồm Fluorocult E.

và cái chết của những con chuột được điều trị cho ăn EHEC sở hữu cả coli O157:H7 (Merck, Đức), thạch Chromocult (Merck, Đức), thạch

Stx1 và Stx2. Sự khác biệt về độc tính này cũng được thấy rõ khi các Rainbow O157 (RB; Biolog, Hoa Kỳ) và Biosynth Culture Media O157:H7
tế bào nội mô mạch máu thận của con người được điều trị bằng Stx1 (BCM O157:H7; Biosynth, Thụy Sĩ). Sau khi xác định được các khuẩn

hoặc Stx2 tinh khiết. Chúng có khả năng vượt qua biểu mô phân cực lạc đáng ngờ, việc xác nhận các phân lập là E. coli O157:H7 phụ thuộc

nguyên vẹn thông qua một quá trình đòi hỏi năng lượng và quan trọng vào nhận dạng sinh hóa và chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên

nhất là chất độc di chuyển qua hàng rào này vẫn duy trì hoạt động soma và kháng nguyên roi (O157, H7). Các bước này là cần thiết vì

sinh học của nó; tổn thương tế bào biểu mô. Ngoại trừ Stx, có một các vi khuẩn đường ruột khác có thể âm tính với sorbitol và có thể

số yếu tố độc lực có thể góp phần gây bệnh ở STEC. Gen eae mã hóa sở hữu các kháng nguyên giống hệt hoặc phản ứng chéo với kháng nguyên

intimin là protein màng ngoài có kích thước từ 94 đến 97 kDa được O157. Tuy nhiên, Feng [16] báo cáo rằng vi khuẩn E. coli O157:H7 lên

tạo ra bởi tất cả các mầm bệnh đường ruột gắn và loại bỏ (A/E) bao men sorbitol đã được phát hiện từ thực phẩm và số lượng các chủng

gồm STEC O157:H7. như vậy ngày càng tăng đã được xác định ở Châu Âu. Hơn nữa, sự

biến đổi về kiểu hình ngày càng tăng ở các phân lập O157 đã được ghi

Đây là yếu tố bám dính vi khuẩn duy nhất được xác định cho đến nay nhận trong các nghiên cứu ở Châu Âu có khả năng dẫn đến việc xác

là yếu tố quan trọng trong đường ruột trong mô hình động vật. Một định nhầm O157:H7 như một số loài khác [49].

yếu tố độc lực giả định khác là độc tố RTX được chỉ định là EHEC

hemolysin, được mã hóa bởi operon hly EHEC . Có hai loại tan máu

được mã hóa bằng plasmid khác nhau, cả hai đều thuộc họ độc tố RTX,

đã được mô tả cho STEC. Alpha hemolysin được hình thành bởi các Việc phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 từ các mẫu thực phẩm đòi

huyết thanh STEC gây bệnh phù nề ở lợn tạo ra biến thể Stx 2e. Hơn hỏi phải làm giàu và phân lập bằng môi trường chọn lọc và/hoặc chỉ

nữa, các kiểu huyết thanh STEC cũng có thể có các yếu tố độc lực bổ thị, nhưng thiếu tính đặc hiệu để xác định STEC [36,39,53].

sung như protein được tiết ra để truyền tín hiệu được mã hóa bởi Vì vậy, cần có các phương pháp nhạy hơn để cải thiện khả năng phát

EspA, EspB và EspD và thụ thể intimin được dịch mã bởi tir [7]. hiện STEC O157:H7 từ các mẫu thực phẩm và môi trường. Ngoài các

phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa vào các đặc điểm sinh hóa,

các phương pháp kiểu gen khác nhau đã được chứng minh là hữu ích
Nhiễm STEC thường liên quan đến việc tiêu thụ thịt bò xay, sữa trong việc xác định loài, phân loại dịch tễ học và xác định mối liên

nguyên liệu và các sản phẩm từ bò bị ô nhiễm, do đó gia súc bị nghi quan di truyền giữa vi khuẩn gây bệnh và không gây bệnh [44].

ngờ là ổ chứa chính [15]. Nhưng vi khuẩn cũng đã được phân lập từ

vật nuôi [6] và động vật hoang dã [48]. Hơn nữa, những đợt bùng phát Ngoài ra, liều lây nhiễm thấp của vi khuẩn E. coli O157:H7 (từ 50 đến

bệnh do thực phẩm gần đây liên quan đến việc ăn các sản phẩm tươi 100 sinh vật) đòi hỏi phải phát triển các kỹ thuật phát hiện nhạy

sống đã làm gia tăng mối lo ngại rằng những thực phẩm bị nhiễm STEC cảm. Ví dụ, kỹ thuật phân tách từ trường miễn dịch (IMS) đã được sử

này có thể là nguồn gây bệnh ngày càng tăng [43]. Trong những thập kỷ dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm tra vi sinh thông

qua, sự bùng phát các bệnh do STEC gây ra có liên quan đến việc tiêu thường để phân lập các vi sinh vật cụ thể [9,20]. IMS cho phép thu

thụ rau diếp lá [2], khoai tây [9], mầm củ cải [50] và rau sống [34]. giữ và tập trung nhanh chóng vi khuẩn từ một phạm vi nền mẫu. Các hạt

Các đợt bùng phát liên quan đến trái cây cũng do tiêu thụ nước táo từ tính được sử dụng cho IMS có sẵn trên thị trường, được phủ sẵn

ép tươi [13]. kháng thể hoặc sẵn sàng để liên hợp kháng thể. Các hạt này thường có

dạng hình cầu 2-3 µm chứa Fe2O4 và Fe3O4 để làm cho chúng có tính

siêu thuận từ. Chúng chỉ có từ tính khi có từ trường và dễ dàng tách

Việc phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 trong phòng thí nghiệm lâm ra khỏi nhau khi loại bỏ từ trường. Bằng cách tác dụng một từ

sàng phụ thuộc vào việc phân biệt các kiểu huyết thanh gây bệnh với trường mạnh vào bên ngoài bình phản ứng, các hạt và vi khuẩn bị bắt

hệ vi khuẩn trong phân bình thường có chứa các chủng E. coli hội sinh. có thể được cố định vào thành bình. Điều này cho phép loại bỏ có

May mắn thay, E. coli O157:H7 có hai dấu hiệu sinh hóa bất thường; chọn lọc phần còn lại của mẫu bao gồm vi khuẩn không phải mục tiêu

quá trình lên men D-sorbitol bị trì hoãn và thiếu hoạt tính β D- và các hạt hữu cơ khác. Các hạt sau đó được giải phóng bằng cách

glucuronidase, giúp phân tách các chủng O157:H7 khỏi các chủng E. rút nam châm. Bước đơn giản này của quy trình IMS có thể giúp chúng

coli không gây bệnh về mặt kiểu hình [49]. Một trong những chất đánh tôi tách STEC khỏi các mẫu một cách dễ dàng. Gần đây, các hạt từ tính

dấu này (lên men sorbitol bị trì hoãn) cho phép phát triển một số môi miễn dịch dùng để phân tách E. coli O26 và O111 đã được thương mại

trường chọn lọc (ví dụ Sorbitol MacConkey; SMAC) giúp nhận biết ban hóa. Với việc sử dụng IMS, tỷ lệ phân lập E. coli O157 đã được cải

đầu các khuẩn lạc đáng ngờ phân lập từ phân có máu. Độ chọn lọc của thiện rõ rệt.

thạch SMAC đã được cải thiện khi bổ sung cefixime-rhamnose (CR-SMAC),

cefixime-tellurite (CT-SMAC) và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide

(MSA-MUG). Ngoài việc cải tiến thạch SMAC, môi trường chọn lọc mới

đã được phát triển để tăng

Wright và cộng sự. [51] cho thấy độ nhạy phát hiện của IMS tăng gấp

100 lần so với cấy truyền trực tiếp từ

Machine Translated by Google

Xác định phân tử E. coli O157:H7 9

nước dùng làm giàu. Tuy nhiên, IMS thủ công (MIMS) rất chủng không sản xuất Stx, được lấy từ Mỹ

tốn nhiều công sức khi phải lấy số lượng lớn mẫu Bộ sưu tập văn hóa loại (ATCC). Bảy vi khuẩn E. coli O157:H7

đã phân tích. Vì vậy, một IMS tự động kết hợp với một các chủng được lấy từ trung tâm tham khảo E. coli

ELISA tích hợp (EiaFoss; Foss, Đan Mạch) sẽ tăng (Đại học bang Pennsylvania, Hoa Kỳ) và sáu chủng đã được

hiệu quả và giảm bớt khối lượng công việc. Phương pháp này có thể kiểm tra lấy từ Đại học Cornell. Ngoài ra, mười một

khoảng 81-108 mẫu mỗi ngày, sau khi làm giàu qua đêm Các chủng phân lập của Hàn Quốc được phát hiện trong nghiên cứu này cũng được liệt kê.

[37]. Phương pháp ngưng kết latex (Verotox F-Assay) dành cho

tính năng phát hiện Stxs đã được phát triển và sẵn có [24]. Nó Bộ sưu tập mẫu

dựa trên việc sử dụng các hạt latex được nhạy cảm với Từ tháng 4 năm 2000 đến tháng 6 năm 2002, tổng cộng 1.682 mẫu

kháng thể chống lại hai loại độc tố này được phát hiện bằng đã đuợc góp nhặt. Trong đó có 1.042 mẫu phân được

ngưng kết mủ thụ động đảo ngược (RPLA). Ngoài ra, thu thập từ lợn và gia súc tại 3 lò mổ và từ

các phương pháp phát hiện gen Stx hoặc sản xuất Stx đã được thịt gà tại các nhà máy chế biến thịt. Lấy mẫu bọt biển

được chứng minh là hữu ích trong việc xác định STEC. Trong số rất nhiều Phương pháp này được sử dụng để thu thập 286 mẫu thịt lợn và thịt bò và

của các kỹ thuật phát hiện có sẵn trên thị trường, chúng tôi đã chọn quá trình đồng nhất được tiến hành để xử lý các mẫu từ

một trong những xét nghiệm sắc ký miễn dịch thị giác, E. coli các thị trường bán lẻ. Tổng cộng đã thu được 355 mẫu gà

O157:H7 Rapid kit (Dong-A Pharm, Hàn Quốc). Các từ các nhà máy chế biến thịt gà và chợ bằng cách rửa sạch

hiệu quả của bộ sản phẩm vẫn chưa được xác định. Chúng tôi các mẫu có đệm nước peptone (BPW; Becton

đã kiểm tra khả năng phát hiện STEC O157:H7 của nó so sánh Dickinson, Mỹ).

với IMS được chứng minh là một trong những hệ thống nhạy cảm nhất Đối với mẫu phân, một cốc phân được đưa vào

các kỹ thuật phát hiện. mỗi 100 ml cốc đựng mẫu và thân thịt lợn, thịt bò

Việc phân lập vi khuẩn E. coli thuộc nhóm huyết thanh O157 đã từ ba lò mổ được tiến hành bằng miếng bọt biển

hiếm khi được báo cáo ở các nước châu Á ngoại trừ Nhật Bản; mặc dù phương pháp lấy mẫu trong vòng 24 giờ sau khi giết mổ [19]. Vì
phân lập E. coli O157 từ các nguồn lâm sàng ở Ấn Độ, mỗi xác chết, ba địa điểm đã được điều tra; bụng, chân và

Trung Quốc, Hàn Quốc và Hồng Kông đã được báo cáo ngắn gọn hông. Để lau bằng miếng bọt biển tiệt trùng, diện tích 5 x

[47]. Dữ liệu về tỷ lệ lưu hành hạn chế về STEC và E. coli 10 cm được giới hạn bằng khuôn nhựa vô trùng. Các

O157:H7 trong thực phẩm và động vật ở nước ta đã gây ra khu vực được phân định sau đó được lau bằng miếng bọt biển tiệt trùng

đánh giá những rủi ro khó khăn và các phương án để thực hiện đã được làm ẩm bằng cách cho vào lọ khử trùng

quản lý và kiểm soát không rõ ràng. với 10 ml BPW trong Bộ lấy mẫu thịt/thân thịt gà tây

Mục tiêu của nghiên cứu này là (i) kiểm tra các

tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli O157:H7 tại các lò mổ và cơ sở bán lẻ

Bảng 1. Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này
thị trường, (ii) để mô tả đặc điểm của các chủng phân lập bằng cách xác định
Chủng vi
stx1, stx2, eaeA và hlyA trong xét nghiệm PCR ghép kênh, (iii) đến Mẫu số một gen Stxs Nguồn
khuẩn
so sánh kiểu gen của chủng phân lập Hàn Quốc và Hoa Kỳ
A1 43888 - ,- ATCC
phân lập và (iv) so sánh hiệu quả giữa các
A2 43889 - ,+ ATCC
phương pháp nuôi cấy thông thường, IMS và E. coli O157:H7
A3 43892 + ,- ATCC
bộ chẩn đoán thương mại, bộ kit nhanh E. coli 0157:H7.
A4 43894 + ,+ ATCC
Nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin về những phát triển mới
C1 29 (4-FS) + ,- Cornell U.
bộ chẩn đoán vì khả năng phát hiện, nhanh chóng và tiện lợi
C2 - ,- Cornell U.
để biểu diễn. Các thủ tục chẩn đoán được kiểm tra trong phần này 40 (1398)
C3 - ,- Cornell U.
nghiên cứu có thể được áp dụng một cách chính xác vào các lĩnh vực cần 41 (973)

giám sát sự hiện diện của sinh vật, đặc biệt là thực thi C4 42 (75) + ,+ Cornell U.

Điểm kiểm soát tới hạn phân tích mối nguy (HACCP) C5 43 (796) + ,+ Cornell U.
chương trình. Và kết quả kiểu gen của các dòng phân lập có thể C 6 - ,+ Cornell U.
44 (1489)
hình dung sự quyết tâm của dịch tễ học Hàn Quốc P1 3009-88 (3D) + ,+ Penn. Đại học

đặc trưng. Cùng nhau, chúng ta có thể đề xuất giải pháp hiệu quả P2 - ,+ Penn. Đại học
3077-88 (3E)
chiến lược kiểm soát chống nhiễm trùng STEC ở người và P3 3104-88 (3C) + ,+ Penn. Đại học
động vật và ô nhiễm thực phẩm trong các sản phẩm chăn nuôi. P4 3299-85 (3A) + ,+ Penn. Đại học

P5 C7-88 (4E) + ,- Penn. Đại học

Nguyên liệu và phương pháp - ,+
P6 C681-87 (4D) Penn. Đại học

P7 - ,- Penn. Đại học

C999-87 (4B)
Chủng vi khuẩn
a Các chủng: A1-4 (chủng ATCC), C1-6 (chủng của Đại học Cornell) và P1-7
Các chủng E. coli O157:H7 được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong
(các chủng từ trung tâm tham khảo E. coli của Đại học bang Pennsylvania)
b
Bảng 1. Bốn chủng, một chủng tạo ra cả Stx1 và Stx2, và Sự hiện diện của Stx1 và Stx2. “-” và “+” biểu thị âm và

một loại chỉ sản xuất Stx1, một loại chỉ sản xuất Stx2 và một loại tích cực, tương ứng.
Machine Translated by Google
10 Ji-Yeon Kim và cộng sự.
(Nasco, Mỹ) và cho vào thùng đá. Khi đến phòng thí nghiệm, các
mẫu được phân tích ngay lập tức hoặc giữ ở nhiệt độ 4oC không
quá 24 giờ trước khi phân tích. Mỗi mẫu được đặt vô trùng
trong túi dạ dày chứa 90 ml BPW và trộn bằng máy dạ dày và ủ
ở 37o C trong 6 giờ và 24 giờ. Trường hợp mẫu thịt lấy từ chợ
bán lẻ có trọng lượng 25 g, sau đó được chuyển vô trùng vào
túi nhựa vô trùng (Whirl-Pak, Nasco, Mỹ) và bảo quản ở nhiệt
độ 4o C. Sau khi đến, mẫu được đồng nhất hóa với 225 ml BPW
và ủ ở nhiệt độ 4°C. 37oC trong 6 giờ và 24 giờ.
Mẫu gà được lấy từ hai nhà máy chế biến thịt gà. Thân gà
được thu thập từ dây chuyền tại nhà máy chế biến sau khi rửa
sạch bên trong, bên ngoài và ngay trước khi đưa vào bể lạnh.
Tất cả các xác chết đã được moi ruột, kiểm tra và tiến hành
các bước rửa lặp lại. Mỗi thân thịt được đặt vào một túi nhựa
vô trùng riêng có 400 ml BPW. Để rửa sạch thân thịt, mỗi thân
thịt được xoa bóp kỹ trong 3-5 phút.
Sau đó, chỉ lấy 50 ml nước dùng cho vào ống hình nón (Becton
Dickinson, Mỹ) và cho vào nước đá để vận chuyển đến phòng thí
nghiệm trong vòng 4 giờ. Mười ml mỗi mẫu được chuyển vào 90
ml BPW để làm giàu sơ bộ.
Quy trình làm giàu
Như đã mô tả ở trên, môi trường ủ 6 giờ với BPW đã được
sử dụng trực tiếp để phân tích IMS. Mặt khác, môi trường ủ
24 giờ với BPW đã được sử dụng cho phương pháp nuôi cấy
thông thường và phân tích bộ kit E. coli O157:H7 Rapid. Sau
24 giờ ủ, 10 ml mỗi nước canh được chuyển vào 90 ml nước
canh E. coli đã biến tính (mEC; Becton Dickinson, Hoa Kỳ)
được bổ sung novobiocin (20 mg/l) (Difco, Hoa Kỳ) để làm giàu
chọn lọc thứ cấp.
Phân tích E. coli O157:H7 bằng IMS Một phần
mililit của chất đồng nhất đã được làm giàu được trộn với
20 µl hạt polystyrene từ tính được phủ kháng thể E. coli O157
(Dynabeads, Na Uy). Quy trình tách và rửa được thực hiện theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Các hạt đã rửa được hòa lại trong
100 µl dung dịch đệm rửa và 50 µl được cấy ria trên thạch
SMAC bổ sung cefixime (0,05 mg/l) và Tellurite (2,5 mg/l, CT-
SMAC, Dynabeads, Na Uy). Các đĩa CT-SMAC được ủ ở 37o C trong
18-24 giờ và cấy khuẩn lạc âm tính với sorbitol để khẳng định
trên thạch Chromocult (Merck, Đức), được giữ ở 37o C qua đêm.
Các chủng E. coli O157 giả định này đã được xét nghiệm khả
năng vận động và xét nghiệm ngưng kết với O157 và kháng huyết
thanh H7 tiên mao (Difco, Hoa Kỳ). Để thử nghiệm khả năng vận
động, các khuẩn lạc nuôi cấy qua đêm được cấy vào môi trường
thử nghiệm khả năng vận động (Difco, Hoa Kỳ) và ủ ở 37o C
trong 24 giờ.
Thí nghiệm này được lặp lại 3 lần để tăng khả năng vận động
của các chủng phân lập. Và đặc tính sinh hóa của chúng được
xác định bằng API 20E (BioMérieux, Pháp). Các chủng ngưng kết
được xác định kiểu huyết thanh (kháng nguyên O157 và H7) đã
được thực hiện PCR đa pha để xác định sự hiện diện của một số
yếu tố độc lực.
Phương pháp nuôi cấy thông
thường Sau quy trình tăng sinh chọn lọc thứ cấp với 90 ml
canh thang mEC, một vòng canh thang đầy được cấy vào môi
trường thạch CT-SMAC. Sau 24 giờ ủ ở 37° C, có tới 5 khuẩn
lạc không màu được chuyển lên môi trường thạch Chromocult và
ủ ở 37° C qua đêm. Các khuẩn lạc màu tím được kiểm tra bằng
các xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn để xác nhận E. coli [22].
Những trường hợp được xác định là E. coli đã được kiểm tra
khả năng vận động và xét nghiệm ngưng kết trên lam kính bằng
cách sử dụng huyết thanh kháng O157 và huyết thanh H7 tiên mao
như được mô tả trong IMS. Sự hiện diện của các gen độc lực
được kiểm tra bằng phương pháp PCR ghép kênh.
Phân tích bằng bộ kit nhanh E. coli O157:H7
Đối với xét nghiệm bộ kit nhanh E. coli O157:H7, 100 µl môi
trường nuôi cấy tăng sinh thứ cấp (như đã đề cập ở trên)
được thêm vào giếng mẫu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút
trước khi ghi lại kết quả. Kết quả xét nghiệm được giải thích
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các chủng dương tính với E.
coli O157:H7 được áp dụng để xác định thêm bằng phương pháp
multiplex PCR và PCR nhằm phát hiện kháng nguyên vi khuẩn roi
H7.
Chuẩn bị DNA cho Multiplex PCR, phân tích PCR Flagellar H7 và
RAPD Các chủng E.
coli O157:H7 phân lập từ ba thí nghiệm được sử dụng trong
nghiên cứu này được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu
5% (Korea Media, Korea). Các chủng tiêu chuẩn của Hoa Kỳ và
các chủng ATCC cũng được nuôi cấy trên môi trường thạch máu
cừu 5%. Sau khi nuôi cấy qua đêm, các khuẩn lạc nghi ngờ từ
mỗi đĩa được cấy vào Tryptic Soy Broth (TSB; Difco, USA), và
ủ nước canh ở 37o C trong 24 giờ. Phương pháp đun sôi được
sử dụng để thu được mẫu DNA như đã mô tả trước đây [36]. Một
phần dịch nuôi cấy 1 ml được ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút
trong 5 phút và loại bỏ phần nổi phía trên. Các viên tế bào
được hòa lại trong 1,0 ml nước cất vô trùng. Các tế bào được
đun sôi trong 15-20 phút và chất không hòa tan được loại bỏ
bằng cách ly tâm trong 5 phút. Chất nổi phía trên được thu
thập và sử dụng làm mẫu.
Multiplex PCR cho stx1, stx2, eaeA, và hlyA, và khuếch đại gen
H7 ở lá cờ PCR Multiplex PCR để
phát hiện gen stx1, stx2, eaeA và EHEC hlyA được thực hiện
bằng máy luân nhiệt GeneAmp PCR (Model 2400, Perkin-Elmer,
USA ).
Các mồi oligonucleotide cho Stx1, Stx2, eaeA và hlyA đã được
tổng hợp như mô tả trước đây [14]. Trình tự oligonucleotide
của các mồi và kích thước dự đoán của sản phẩm khuếch đại PCR
được liệt kê trong Bảng 2. Mỗi cặp mồi
Machine Translated by Google
đã được xác định là đặc hiệu đối với E. coli và đã được chứng minh
là không khuếch đại các sản phẩm có thể phát hiện được bằng phương
pháp điện di trên gel agarose (Sigma, Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng các
mẫu DNA có nguồn gốc từ nhiều loài vi khuẩn Gram dương và Gram âm
từ nhiều loại thực phẩm và động vật khác nhau. nguồn.
Các xét nghiệm PCR được thực hiện trong thể tích 50 µl chứa
4 µl mẫu axit nucleic được chuẩn bị từ môi trường nuôi cấy
và các chủng đối chiếu. Và 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 10 mM KCl,
3 mM MgCl2; Nồng độ 20 pmol của mỗi mồi, 0,2 mM dNTP và 1 U
Taq DNA polymerase (Promega, Hoa Kỳ) đã được thêm vào hỗn hợp
phản ứng. Điều kiện PCR bao gồm bước biến tính ban đầu ở 95o
C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ 95o C trong 20 giây, 58o C
trong 40 giây và 72o C trong 90 giây. Chu kỳ kéo dài cuối cùng
được thực hiện ở 72oC trong 5 phút. Các đoạn DNA khuếch đại
được phân giải bằng phương pháp điện di trên gel sử dụng gel
agarose 1,5% trong dung dịch đệm Tris acetate-EDTA (TAE). Gel
được nhuộm bằng 0,5 µl ethidium bromide (EtBr) mỗi ml, hiển
thị và chụp ảnh dưới ánh sáng tia cực tím.
Một phân tích khuếch đại PCR khác đã được thực hiện để xác
nhận sự hiện diện của gen H7 tiên mao. Các mồi PCR cho H7
trước đây đã được mô tả bởi Gannon et al. [18]. Trình tự
oligonucleotide của mồi và kích thước dự kiến được liệt kê
trong Bảng 2. Xét nghiệm PCR H7 tiên mao được thực hiện trong
thể tích phản ứng 100 µl chứa 2,5 U Taq DNA polymerase
(Promega, Hoa Kỳ), 0,2 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl và 20
pmol mồi H7 tiên mao. Các phản ứng được thực hiện bằng máy
điều nhiệt GeneAmp PCR. Điều kiện PCR ở 94o C trong 1 phút,
65o C trong 2 phút và 72o C trong 2 phút. Chu kỳ kéo dài cuối
cùng được thực hiện ở 72oC trong 5 phút. Các sản phẩm PCR
khuếch đại được phân tách trên gel agarose 1,5% trong đệm
TAE, sau đó nhuộm EtBr và chụp ảnh dưới ánh sáng tia cực tím.
Lấy dấu vân tay RAPD
Để tăng khả năng tái lập của phân tích RAPD, hai
Bảng 2. Các mồi được sử dụng trong PCR ghép kênh, PCR H7 tiên mao và xét nghiệm lấy dấu vân tay RAPD
Lót Trình tự oligonucleotide (5'-3')
stx1-F ACACTGGATGATCTCAGTGG
stx1-R CTGAATCCCCCCCCATTATG
stx2-F CCATGACAACGGACAGCAGTT
stx2-R CCTGTCAACTGAGCAGCACTTTG
eaA-F GTGGCGAATACTGGCGAGACT
eaA-R CCCCATTCTTTTTCACCGTCG
hlyA-F ACGATGTGGTTTATTCTGGA
hlyA-R CTTCACGTGACCATACATAT
H7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC
H7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC
CRA22 CCGCAGCCAA
CRA23 GCGATCCCCA
Xác định phân tử E. coli O157:H7 11
các loại mồi ngẫu nhiên 10 mer (gọi tắt là CRA22 và CRA23) đã
được sử dụng để điều tra các chủng E. coli O157:H7 phân lập
và các chủng đối chiếu. Dựa trên kết quả thu được, mồi CRA22
và CRA23 đã được tổng hợp thương mại để phân tích các chủng
E. coli O157:H7. Hai mươi ng mỗi mồi có hàm lượng 70% G+C
dẫn đến các mẫu dải PCR phức tạp và không thể lặp lại [31].
Hai mồi, CRA22 và CRA23, được kết hợp theo tỷ lệ cân bằng mol
và được sử dụng ở mức 20 pmol mỗi mồi trên 100 µl hỗn hợp phản
ứng. Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong tổng thể tích
100 µl chứa 3 mM MgCl2, 0,2 mM mỗi dNTP, 20 pmol mỗi mồi PCR,
2 U Taq DNA polymerase (Takara, Nhật Bản) và 10 µl mẫu. Điều
kiện nhiệt độ bao gồm bước biến tính ban đầu ở 94°C trong 4
phút, sau đó là 30 chu kỳ 94° C trong 20 giây, 45° C trong 30
giây và 72° C trong 1 phút. Chu kỳ kéo dài cuối cùng được thực
hiện ở 72oC trong 10 phút. Phản ứng được thực hiện bằng máy
điều nhiệt GeneAmp PCR. Sản phẩm PCR được phân giải trên gel
agarose 1% trong đệm TAE. Gel agarose được nhuộm trong dung
dịch EtBr (0,5 mg/ml) để hiển thị các dải DNA khuếch đại.
Các kiểu dải được tạo ra bởi RAPD-PCR và khoảng cách di truyền
giữa các chủng được phân tích bằng chương trình Số Một với
Gel-Doc (Bio-Rad, Hoa Kỳ). Ngoài ra, khả năng phân biệt được
xác định theo phương pháp chỉ số số được mô tả bởi Hunter và
Gaston [23]. Giá trị D chỉ ra rằng hai phân lập được chọn ngẫu
nhiên từ quần thể thử nghiệm sẽ được chỉ định vào các nhóm
phân loại khác nhau. Công thức của giá trị D như sau.
S
D 1 =1 – ⁄ N( ) N – 1 nj( nj – 1 )
j = 1
S = tổng số loại khác nhau, nj= số lượng phân lập đại diện
cho từng loại và N = số lượng phân lập trong quần thể thử
nghiệm. Biểu đồ tổng thể từ lấy mẫu đến RAPD được hiển thị
trong Hình 1.
Kích thước dự kiến Thẩm quyền giải quyết
614 bp Fagan và cộng sự [14]
779 bp Fagan và cộng sự [14]
890 bp Fagan và cộng sự [14]
165 bp Fagan và cộng sự [14]
625 bp Gannon và cộng sự [18]
Neilan và cộng sự [31]
Neilan và cộng sự [31]
Machine Translated by Google

12 Ji-Yeon Kim và cộng sự.

Hình 1. Quy trình phân lập STEC từ mẫu phân và thịt.

Xét nghiệm gây độc tế bào Vero bộ lọc (Minisart; Sartorius, Đức). Tế bào Vero được nuôi cấy trong
Sau khi xác nhận vi khuẩn E. coli O157:H7 từ các chủng phân lập môi trường thiết yếu tối thiểu Eagles (EMEM; Gibco, Hoa Kỳ) được

trong nghiên cứu này bằng PCR ghép kênh và PCR vi khuẩn Flagellar bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (FBS) và gentamicin (100 Phag/

H7, các phân lập được thực hiện bằng xét nghiệm gây độc tế bào tế ml). Hai trăm µl tế bào Vero trong EMEM (2,5 × 105 tế bào/ml) được

bào Vero để xác định đặc điểm của chúng. Thử nghiệm được tiến hành đặt vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy mô 96 giếng (Costar, Hoa Kỳ) và

như mô tả trước đây của Yoh et al. [52] và Kim và cộng sự. [26]. ủ ở 37o C trong 24 giờ. Năm mươi µl dịch lọc nuôi cấy được thêm
Tóm lại, dịch lọc nuôi cấy thu được từ TSB sau khi ủ ở 37o C trong vào mỗi giếng. Sau khi ủ ở 37oC trong môi trường 10% CO2 trong 3

24 giờ được sử dụng cho xét nghiệm. Dịch nổi và dịch chiết nuôi cấy ngày, hiệu ứng gây bệnh tế bào (CPE) trên

được lọc qua lỗ vô trùng có kích thước lỗ 0,2 µm

Machine Translated by Google

Xác định phân tử E. coli O157:H7 13

Tế bào Vero được kiểm tra dưới kính hiển vi đảo ngược Ủy ban Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm Lâm sàng (NCCLS).

(DMIRB/E; Leica, Đức). Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định

mức “yếu” nằm trong khoảng từ 0% đến 30% và mức “mạnh” là Kết quả
từ 30% đến 100% tế bào Vero bị chết. Kết quả là
được thể hiện trong Bảng 5. Phân lập vi khuẩn E. coli O157:H7

Trong nghiên cứu này, tổng cộng 1.682 mẫu đã được kiểm tra.

Xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh Chín vi khuẩn E. coli O157:H7 được phân lập từ các mẫu phân và

Độ nhạy cảm với kháng sinh của 11 E. coli O157:H7 hai được lấy từ các mẫu thịt. Tuy nhiên, không có E. coli

các chủng phân lập được xác định bằng phương pháp Bauer và Kirby [5]. MỘT O157:H7 được phát hiện từ các mẫu nước rửa gà.
tổng số 23 đĩa kháng khuẩn đậm đặc được thử nghiệm Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 của ba

ampicillin (10 µg), amikacin (30 µg), amoxicillin/clavulanic các phương pháp khác nhau là khác nhau (Bảng 3). Trong truyền thống

axit (20/10 µg), carbenicillin (100 µg), cefixime (5 µg), phương pháp này, bảy chủng phân lập đã thu được thông qua kiểu hình

cefotaxime (30 µg) cephalothin (30 µg), cloramphenicol đặc điểm (chất lên men không sorbitol tạo thành không màu

(30 µg), ciprofloxacin (5 µg), erythromycin (15 µg), khuẩn lạc trên thạch CT-SMAC và khuẩn lạc màu tím trên

gentamicin (10 µg), imipenem (10 µg), kanamycin (30 µg), thạch Chromocult). 11 chủng phân lập được phát hiện bởi E.

levofloxacin (5 µg), axit nalidixic (30 µg), norfloxacin coli O157:H7 Bộ xét nghiệm nhanh và 10 chủng phân lập nghi ngờ trong IMS

(10 µg), ofloxacin (5 µg), polymyxin B (300 U), sparfloxacin được tiếp tục áp dụng cho các thử nghiệm về độ chuyển động và sự ngưng kết. TRONG

(5 µg), streptomycin (10 µg), tetracycline (30 µg), xét nghiệm độ kết dính và độ di động, các chủng phân lập từ cùng

tobramycin (10 µg) và trimethoprim/sulfamethoxazole mẫu cho thấy kết quả giống nhau bất kể khác nhau

(1,25/23,75 µg). Tất cả các đĩa kháng khuẩn được mua từ các phương pháp cách ly Ở thử nghiệm độ linh hoạt, tất cả 11 chủng đều

Becton Dickinson (Mỹ). Sau 24 giờ ủ trong TSB, tích cực. Trong thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O157, tất cả

phân lập được nuôi cấy trong môi trường canh thang Muller-Hinton (MHB, Difco, chủng cho thấy dương tính, nhưng một trong số chúng không kết tụ

USA) trong 8 giờ, pha loãng theo thang MacFarland số 0,5 và chống lại kháng huyết thanh H7.

được áp dụng lên bề mặt thạch Muller-Hinton (MHA, Difco,

HOA KỲ). Các đĩa được đặt bằng bộ phân phối đĩa (Becton Đặc tính của các chủng E. coli O157:H7 phân lập bằng

Dickinson, Mỹ) và các đĩa được ủ trong 18 giờ ở PCR ghép kênh cho các gen Stx1, Stx2, eaeA và hlyA ,

37o C. Đo vùng ức chế sinh trưởng. Các và bằng PCR H7 tiên mao

kết quả được giải thích theo hướng dẫn của National Sau khi xác định bằng xét nghiệm độ di động và độ kết dính

Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng ba phương pháp khác nhau

phương pháp Tích cực (%) Tiêu cực (%)

Văn hóa truyền thống 0,42 (7/1.682)a 99,58 (1.675/1.682)b

Phân tách miễn dịch từ trường 0,59 (10/1.682) 99,41 (1.672/1.682)

E. coli O157:H7 Bộ kit nhanh 0,65 (11/1.682) 99,35 (1.671/1.682)

Một

Số tích cực/Không. của các mẫu được kiểm tra

b
Số âm/Không. của các mẫu được kiểm tra

Bảng 4. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 phân lập

Đĩa kháng khuẩn Kháng (%) Đĩa kháng khuẩn trung gian (%) Kháng (%) Trung cấp (%)

Thuoc ampicillin 27,2 54,5 Kanamycin 0 27,3

Amikacin 0 0 Levofloxacin 0 0

Amoxicilin/ Axit nalidixic 0 9.1

9.1 45,5
axit clavulanic Norfloxacin 0 0
Carbenicillin 9.1 72,7 Ofloxacin 0 0
Cefixim 0 0 Polymyxin B 0 36,4
Cefotaxim 0 18.2 Sparfloxacin 0 0

Cefalothin 18.2 27,3 Streptomycin 0 36,4

Cloramphenicol 0 0 Tetracycline 18.2 36,4

Ciprofloxacin 0 0 Tobramycin 0 0

Erythromycin 100 0 Trimethoprim/

0 0
gentamicin 0 0 sulfamethoxazole

Imipenem 0 0
Machine Translated by Google

14 Ji-Yeon Kim và cộng sự.

Bảng 5. Kết quả PCR multiplex, PCR H7, xét nghiệm kháng huyết thanh, xét nghiệm khả năng vận động và xét nghiệm tế bào vero

Sự hiện diện của một Xét nghiệm kháng huyết thanhb

Vận động Verocell
Cô lập
stx1 stx2 eaA hlyA H7 O157 H7 thử nghiệm
xét nghiệm

P010726-18 + - + + + + + + ++
P010726-21 + + + + + + - + +
P010726-22 + + + + + + - + +
P010726-23 + - + + + + + + ++
P010726-24 + - + + + + + + ++
P010726-25 + + + + + + + + ++
P010726-26 + - + + + + + + ++
E010206-13-2 + - + + + + + + ++
J010303-11-1 + + + + + + + + ++
O157-R1-3-2 + + + + + + - + ++
O157-C-1-2 + - + + + + + + +
Một

+; hiện tại, -; vắng mặt.

b
+; tích cực, -; tiêu cực.
c
++; tác dụng gây bệnh tế bào mạnh (CPE), +; CP yếu.

chống lại huyết thanh kháng O157 và H7, PCR ghép kênh và P1 và P2 (Hoa Kỳ) và Nhóm D bao gồm O157-R1-3-2

PCR H7 tiên mao được thực hiện bằng cách sử dụng mồi cho stx1, (Bò Hàn Quốc). Nhóm E gồm 2 nhóm nhỏ là E1 và E2.

gen stx2, eaeA và hlyA . Như thể hiện trong Bảng 5, tất cả 11 Phân nhóm E1 bao gồm hai chủng phân lập từ bò Hàn Quốc,

có gen stx1 , trong khi sáu dòng phân lập có gen stx2 . mười một P010726-21 và P010726-24. Phân nhóm E2 bị phá vỡ

các chủng phân lập được xác nhận là E. coli O157:H7 vì tất cả chúng đều giảm 5 chủng phân lập của Hàn Quốc (P010726-18, P010726-22,

mang gen eaeA và hlyA . Kích thước khuếch đại cụ thể của P010726-23, P010726-25 và O157-C-1-2) và 14 Hoa Kỳ

Các gen stx1, stx2, eaeA , hlyA lần lượt là 614 bp, 779 bp, 890 cô lập; 4 chủng ATCC (A1, A2, A3, A4), 6 chủng

bp và 165 bp tương ứng. Sản phẩm PCR đại diện cho của Đại học Cornell (C1, C2, C3, C4, C5 và C6) và 4

mỗi yếu tố trong số bốn yếu tố độc lực STEC mục tiêu đã được khuếch đại chủng của Đại học bang Pennsylvania (P3, P4, P5 và

với chủng tiêu chuẩn, ATCC 43894 làm đối chứng dương (làn đường P7). Các chủng này thuộc phân nhóm E2 có hệ số tương đồng

12 trong Hình 2). khoảng 75%. Kết luận có 2 chủng phân lập từ lợn ở Hàn Quốc

Sau khi được xác nhận bằng các xét nghiệm về độ di động và kháng huyết thanh, có kiểu gen khác biệt với các chủng khác. Ba

các chủng phân lập được tiếp tục áp dụng cho xét nghiệm H7 tiên mao và phân lập từ bò Hàn Quốc (P010726-18, 22 và 23)

xét nghiệm PCR đa kênh để xác nhận sự hiện diện của tế bào hình roi cho thấy độ tương đồng cao với các chủng phân lập của Mỹ ở mức 80%. Các

gen. Trong xét nghiệm PCR H7 tiên mao, tất cả 11 chủng phân lập đều được Các chủng cô lập ở Hoa Kỳ tiết lộ các mô hình gần gũi với nhau ngoại trừ

được tìm thấy chứa gen H7. Mặc dù một người bị cô lập không phản ứng ba chủng của Đại học bang Pennsylvania (P1, P2 và

chống lại kháng huyết thanh H7, tất cả chúng đều sở hữu gen H7 (Bảng 5). P6). Trong số ba, P1 và P2 có độ tương tự 70% và P6

phát hiện tương tự với hai chủng lợn từ Hàn Quốc ở mức 65%

Phân tích dấu vân tay RAPD mức độ. Sáu chủng Hàn Quốc từ bò có hệ số

Mười một chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 được so sánh với mức độ tương đồng từ 63% đến 80%. Sự phân biệt đối xử
17 chủng E. coli O157:H7 thu được từ ATCC công suất (giá trị D) của xét nghiệm lấy dấu vân tay RAPD này là

(4 chủng), Đại học Cornell (6 chủng), Bang Pennsylvania 0,86.

Đại học (7 chủng) sử dụng xét nghiệm RAPD. Tiêu biểu

Mẫu RAPD cho tất cả 28 chủng được thử nghiệm được khuếch đại bằng hai Xét nghiệm gây độc tế bào Vero

từng đoạn mồi (CRA22 và CRA23) được hiển thị trong Hình 3. Tác dụng gây độc tế bào của các chủng E. coli O157:H7 phân lập được

Tính đa hình DNA ở các chủng phân lập được thể hiện rõ nhất được đo bằng xét nghiệm gây độc tế bào Vero. CPE của 8 chủng phân lập

giữa các bộ khuếch đại ở vùng 2501 bp, 500 bp. Hình 3 mạnh, ngược lại ba là yếu. Kết quả CPE của

minh họa một chương trình dendro được xây dựng từ các cấu hình khuếch đại 11 chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 được phân lập trong Bảng 5.

được tạo bởi CRA22 và CRA23. Chương trình dendro cũng

gồm 5 nhóm có hệ số tương đồng tại Xét nghiệm đĩa nhạy cảm với kháng sinh

63%. Nhóm A bao gồm J010703-11-1, E010206 (tiếng Hàn Tổng cộng có 23 đĩa kháng khuẩn đã được sử dụng trong nghiên cứu này.

lợn) và P6 (Mỹ) có hệ số tương đồng Năm trong số 11 chủng E. coli O157:H7 phân lập (45,5%) được

dao động từ 65% đến 90%. Nhóm B chỉ bao gồm kháng với hai hoặc nhiều chất kháng khuẩn (Bảng 4). Tất cả

một chủng, P010726-26 (bò Hàn Quốc). Nhóm C chứa các chủng phân lập kháng với erythromycin (100%) sau đó là
Machine Translated by Google

Xác định phân tử E. coli O157:H7 15

Hình 2. Kết quả xét nghiệm PCR đa kênh để phát hiện các gen Stx1 (614 bp), Stx2 (779 bp), eaeA (890 bp) và hlyA (165 bp) ở các
chủng E. coli O157:H7. Ngõ 1, P010726-18; ngõ 2, P010726-21; ngõ 3, P010726-22; ngõ 4, P010726-23; ngõ 5, P010726-24; ngõ 6,
P010726-25; ngõ 7, P010726-26; ngõ 8, E010206-13-2; ngõ 9, J010303-11-1; ngõ 10, O157-R1-3-2; ngõ 11, O157-C-1-2; ngõ 12, ATCC 43894
(đối chứng dương); Dấu DNA M, 100 bp.

Hình 3. Mẫu RAPD của 11 chủng phân lập của Hàn Quốc và 17 chủng của Hoa Kỳ. Ngõ M, điểm đánh dấu DNA 1 kb; ngõ 1, P010726-18; ngõ
2, P010726-21; ngõ 3, P010726-22; ngõ 4, P010726-23; ngõ 5, P010726-24; ngõ 6, P010726-25; ngõ 7, P010726-26; ngõ 8, E010206-13-2;
ngõ 9, J010303-11-1; ngõ 10, O157-R1-3-2; ngõ 11, O157-C-1-2; ngõ 12, A1; ngõ 13, A2; ngõ 14, A3; ngõ 15, A4. làn 16-21, các chủng
C1, C2, C3, C4, C5 và C6 tương ứng (các chủng của Đại học Cornell); làn 22-28, các chủng P1, P2, P3, P4, P5, P6 và P7 tương ứng
(các chủng của Đại học Bang Pennsylvania).

ampicillin (27,2%), cephalothin (18,2%) và tetracycline chuyên sâu khi số lượng lớn mẫu được phân lập [37]. Bộ kit
(18,2%) (Bảng 4). E. coli O157:H7 Rapid cho thấy độ nhạy tương đối cao và chỉ
mất 10 phút để được chứng minh là dương tính. Do độ nhạy
Cuộc thảo luận và tốc độ nhanh, phương pháp này sẽ hữu ích để phát hiện
vi khuẩn E. coli O157:H7 từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau.

Nghiên cứu này được thực hiện để xác định mức độ phổ biến nguồn.

của STEC ở gia súc, lợn và gà bằng các phương pháp phát
hiện khác nhau và xác định các đặc điểm phân tử của các
chủng phân lập bằng PCR ghép kênh và RAPD.
Phương pháp nuôi cấy thông thường cho tỷ lệ phát hiện
thấp nhất. Có thể là do thiếu khả năng phát hiện vi khuẩn E.
coli O157:H7 có kiểu hình sinh hóa bất thường [49]. Trong
trường hợp phương pháp IMS, tỷ lệ phát hiện tương đối
cao, tuy nhiên IMS quá tốn công sức.
Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 khác nhau giữa
các quốc gia được kiểm tra và phương pháp phát hiện mà họ
áp dụng. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli O157:H7 từ thịt bò băm
công nghiệp là 0,12% ở Pháp [46], và nhà nghiên cứu người
Pháp khác đã báo cáo rằng không có phân lập vi khuẩn E. coli
O157:H7 trong 1.200 mẫu [7]. Ở Thụy Sĩ, không phát hiện thấy
vi khuẩn E. coli O157:H7 nào từ 400 mẫu [15]. Năm loại vi
khuẩn E. coli O157:H7 (3,3%) được phân lập từ thịt bò và bò bán lẻ
Machine Translated by Google

16 Ji-Yeon Kim và cộng sự.

tháng 7 đến tháng 8 là 20,2%. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng sự

phân bố của E. coli O157:H7 đạt đỉnh điểm từ tháng 7 đến tháng 8

[21,41]. Điều kiện ấm hơn và ẩm hơn trong những tháng mùa hè có thể

tạo điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại và phát triển của STEC [21].

Việc lấy mẫu nhiều hơn được tiến hành trong mùa hè, sẽ phát hiện
được nhiều vi khuẩn E. coli O157:H7 hơn.

Thứ ba, hầu hết các sản phẩm thịt được lấy từ các chợ bán lẻ quy mô

lớn, có điều kiện vệ sinh tương đối tốt hơn so với các chợ bán lẻ

hoặc cửa hàng bán thịt quy mô nhỏ [10,11].

Theo xét nghiệm kháng huyết thanh hình roi H7 và PCR, một chủng
phân lập của Hàn Quốc không phản ứng trong xét nghiệm kháng huyết thanh.

Tuy nhiên, nó cho thấy kết quả dương tính khi xét nghiệm PCR đối với gen H7.

Từ kết quả này, có thể giả định chủng E. coli O157:H7 không biểu hiện

đặc tính mặc dù mang gen H7. Vì vậy, cần thực hiện xác định phân tử

bằng PCR để khẳng định.

Chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm lấy dấu vân tay RAPD để hiểu cơ
bản về mối liên quan phân tử giữa các chủng E. coli O157:H7 phân lập

từ Hàn Quốc và Hoa Kỳ. Do PFGE khám phá toàn bộ chiều dài của nhiễm

sắc thể trong khi RAPD chỉ khám phá các phần được chọn ngẫu nhiên

của nó nên phân tích RAPD có thể là phương pháp thay thế cho phương

pháp gõ PFGE [36]. Nhìn chung, sự đồng thuận cao giữa kết quả của

hai phương pháp là tốt cho việc phân biệt chủng [25].

Hơn nữa, Maurer và cộng sự. [28] tuyên bố rằng việc lấy dấu vân tay

bằng RAPD cho thấy nhiều khác biệt di truyền giữa các chủng E. coli
Hình 4. Sơ đồ dendrogram được xây dựng từ dữ liệu RAPD bằng
phương pháp UPGAMA. ở gia cầm hơn là phân tích đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP).

Do đó, phân tích dấu vân tay RAPD được sử dụng cho nghiên cứu này

vì ưu điểm của nó là tiết kiệm thời gian và chi phí, độ nhạy và

phân ở Thái Lan và 36 (8,7%) STEC ở Tây Ban Nha [33]. Tỷ lệ nhiễm không cần kỹ năng đặc biệt để thực hiện.

STEC ở gia súc Bắc Mỹ và châu Âu dao động từ 0 đến 10% [4]. Sự khác

biệt trong việc phát hiện STEC giữa các nghiên cứu này có lẽ là do mô Kết quả mô hình RAPD trong nghiên cứu này so sánh với nghiên cứu

hình phát tán STEC bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn uống, tuổi tác, điều của Radu et al. [36]. Họ đã báo cáo 2 cụm và 22 phân lập trong số 28

kiện môi trường và sự thay đổi theo mùa [27]. Những lý do khiến tỷ chủng [36]. Trong số 22 chủng phân lập, 3 nhóm chiếm ưu thế đã được

lệ phát hiện thấp trong nghiên cứu này có thể được tóm tắt thành ba quan sát và có từ 3 đến 5 dải khác nhau. Tuy nhiên, nghiên cứu của

yếu tố. Thứ nhất, nguồn lấy mẫu hạn chế có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ chúng tôi đã tiết lộ rằng các mẫu RAPD-PCR quá đa dạng để có thể phân

phát hiện [6,9]. Hầu hết các nguồn mẫu (80%) trong công việc này biệt các mẫu của từng chủng E. coli O157:H7 khi các mẫu được phân

được lấy từ các mẫu rửa phân bò và gà. Theo khảo sát tỷ lệ nhiễm vi tích dựa trên số dải của chúng. Sử dụng 2 mồi CRA22 và CRA23 đã tạo

khuẩn E. coli O157:H7 từ vật nuôi là dưới 0,7% [6,9]. Tuy nhiên, tỷ ra ít nhất 7 băng, trừ 4 chủng.

lệ STEC ở bê và bò cái tơ cao hơn nhiều so với tỷ lệ ở bò trưởng

thành ở các quốc gia khác [12,21,33,41]. Các tác giả này đã chứng Hơn nữa, sức mạnh phân biệt đối xử (giá trị D) tiết lộ 0,86. Các

minh rằng thú non (bê và bò cái tơ) thải ra STEC thường xuyên hơn kiểu dải đa dạng này tạo ra giá trị D cao và sự khác biệt giữa các

thú trưởng thành. Trong nghiên cứu này, hầu hết các mẫu phân được chủng, vì vậy hai mồi này được khuyến nghị phân tích các đặc điểm

lấy từ gia súc trưởng thành khỏe mạnh. Tổng hợp các nghiên cứu này phân tử sâu hơn bằng phân tích RAPD. Ở mức độ tương tự 63%, RAPD

lại với nhau, sự khác biệt về tuổi tác có thể là do tỷ lệ phát hiện đã tạo ra 5 cụm. Ngoại trừ nhóm B và D, đặc biệt là nhóm E cho thấy

vi khuẩn E. coli O157:H7 thấp hơn là do nguồn mẫu. Thứ hai, sự thay mối liên quan di truyền giữa các chủng cao ở mức 75%. Hầu hết các

đổi theo mùa có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ phát hiện trong nghiên cứu chủng ở Hoa Kỳ đều có kiểu mẫu tương tự ngoại trừ 3 chủng của Đại

này. Mặc dù mẫu được thu quanh năm nhưng số mẫu được thu vào tháng học bang Pennsylvania.

1 và tháng 2 nhiều hơn (38,3%). Tỷ lệ lấy mẫu

Hơn 50% các chủng bò phân lập của Hàn Quốc có gen giống với các
chủng bò phân lập của Hoa Kỳ. Tuy nhiên, lý do khiến kiểu di truyền

khác biệt giữa lợn và bò phân lập từ Hàn Quốc có thể phụ thuộc vào

sự khác biệt về nguồn gốc loài của chúng.

Machine Translated by Google
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng sự phân biệt nguồn có
thể được xác định bằng RAPD [32,35]. Vì vậy, kỹ thuật này có
thể được sử dụng khi nghiên cứu dịch tễ học của vi khuẩn E.
coli O157:H7. Mặc dù RAPD có khả năng phân biệt các chủng có
yếu tố độc lực khác nhau từ các nguồn khác nhau, nhưng chúng
tôi không thể xác định sự khác biệt về kiểu gen giữa các
chủng chỉ sở hữu stx1 hoặc stx2 và các chủng sở hữu cả stx1
và stx2. RAPD đã tiết lộ rằng họ không thể phân biệt giữa các
chủng phân lập theo sự khác biệt của chúng về mức độ độc lực
trong một số nghiên cứu [8,30].
E. coli O157:H7 được cho là nhạy cảm với nhiều loại kháng
sinh [42]. Khoảng 45,5% các chủng hiện tại cho thấy khả năng
kháng kháng sinh đối với hai hoặc nhiều loại thuốc chống vi
trùng được sử dụng trong nghiên cứu này. Tình trạng kháng
kháng sinh của họ là chống lại erythromycin (100%), tiếp theo
là ampicillin (27,2%), cephalothin (18,2%) và tetracycline
(18,2%). Mô hình kháng kháng sinh được quan sát phổ biến
nhất với ampicillin (25,4%), tetracycline (23,8%) và
streptomycin (14,3%) và ít gặp hơn với cephalothin (11,1%)
và axit nalidixic (6,4%) ở Ấn Độ [25]. Nghiên cứu của Hoa Kỳ
về tình trạng kháng thuốc kháng sinh cho thấy tất cả các
chủng phân lập đều kháng tilmicosin và hầu hết các chủng phân
lập đều nhạy cảm với trimethoprim/sulfamethoxazole và ciprofoloxacin [17].
Ở Malaysia, tình trạng kháng thuốc được quan sát chủ yếu đối
với bacitracin (100%), sulphafurazole (77%), ampicillin
(57%), cephalothin (53%) và carbenicillin (30%) [36]. Các mô
hình kháng kháng sinh với ampicillin, fosfomycin, kanamycin
và vancomycin đã được quan sát thấy ở Nhật Bản [45].
Từ những dữ liệu này, E. coli O157:H7 chủ yếu kháng ampicillin
và tetracycline. Mô hình đề kháng của các chủng phân lập ở
Hàn Quốc tương tự như ở Malaysia. Khả năng thay đổi mô hình
kháng thuốc không loại trừ tỷ lệ nhóm kháng trung gian bộc
lộ tương đối cao với carbenicillin (72,7%), ampicillin
(54,5%), amoxicillin/axit clavulanic (45,5%), kanamycin
(27,3%), polymyxin. B (36,4%), streptomycin (36,4%),
tetracycline (36,4%) và cephalothin (27,3%).
Nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli
O157:H7 không cao như các quốc gia khác.
Tuy nhiên, vi khuẩn E. coli O157:H7 đã được phân lập từ
nhiều công đoạn chế biến vật nuôi khác nhau từ giết mổ đến
chế biến. Vì vậy, các chương trình điều tra cẩn thận hơn
như HACCP nên được áp dụng để thiết lập tất cả các đàn bò
sữa, lò mổ và nhà máy chế biến thịt. Bộ dụng cụ đo nhanh vi
khuẩn E. coli O157:H7 được kiểm tra trong nghiên cứu này
dường như rất hữu ích trong việc phát hiện sự nhiễm vi khuẩn
E. coli O157:H7 với độ chính xác và nhanh chóng cao. Ngoài
ra, kết quả RAPD chỉ ra rằng các chủng phân lập từ gia súc
Hàn Quốc có liên quan về mặt di truyền với các chủng của Hoa
Kỳ ở mức tương tự 70%, có thể có cơ chế lây nhiễm tương
tự ở động vật và các nguồn liên quan. Cần phải có chương
trình theo dõi và giám sát liên tục để kiểm tra ô nhiễm vi
sinh vật trong thức ăn nhập khẩu.
Xác định phân tử E. coli O157:H7 17
được thực hiện để giảm thiểu nguy cơ lây lan các mầm bệnh
chính từ thực phẩm.
Sự nhìn nhận
Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Cục Phát triển Nông thôn,
Bộ Nông Lâm và cũng được hỗ trợ bởi dự án Brain Korea 21.
Người giới thiệu
1. Acheson DWK, L thu nhập LL, Jacewicz MS, Keusch GT.
Tương tác độc tố Shiga với tế bào biểu mô ruột.
Escherichia coli O157:H7 và các chủng E. coli sinh độc tố Shiga .
Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ, Washington DC, 1998.
2. Ackers ML, Mahon BE, Leahy E, Goode B, Damrow T, Hayes PS, Bibb
WF, Rice DH, Barrett TJ, Hutwagner L, Griffin PM, Slutsker L. Sự
bùng phát bệnh truyền nhiễm Escherichia coli O157:H7 liên quan
đến lá tiêu thụ rau diếp.
J Lây nhiễm Dis 1998, 177, 1588-1593.
3. Angela R, Melton C, O'Brien AD. Cấu trúc, sinh học và độc tính
tương đối của các thành viên họ độc tố Shiga đối với tế bào và
động vật. Escherichia coli O157:H7 và độc tố Shiga sản sinh ra
các chủng E. coli . Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ, Washington DC,
1998.
4. Armstrong GL, Hollingsworth J, Morris JG Jr. Các mầm bệnh truyền
qua thực phẩm mới nổi: Escherichia coli O157:H7 như một mô hình
xâm nhập của mầm bệnh mới vào nguồn cung cấp thực phẩm của các
nước phát triển. Epidemiol Rev 1996, 18, 29-51.
5. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Thử nghiệm độ nhạy cảm
với kháng sinh bằng phương pháp đĩa đơn tiêu chuẩn hóa.
Am J Clin Pathol 1966, 45, 493-496.
6. Beutin L, Geier D, Steinruck H, Zimmermann S, Scheutz F. Tỷ lệ
lưu hành và một số đặc tính của Escherichia coli sinh ra
verotoxin (độc tố giống Shiga) ở bảy loài vật nuôi khỏe mạnh
khác nhau. J Clin Microbiol 1993, 31, 2483-2488.
7. Bouvet J, Bavai C, Rossel R, Le Roux A, Montet MP, Ray-Gueniot
S, Mazuy C, Arquilliere C, Vermozy Rozand C. Tỷ lệ nhiễm
Escherichia coli và E. coli O157:H7 sản sinh độc tố verotoxin
trong xác lợn từ ba lò mổ của Pháp. Int J Thực phẩm Vi sinh 2001,
71, 249-255.
8. Chansiripornchai N, Ramasoota P, Sasipreeyajan J, Svenson SB.
Phân biệt các chủng Escherichia coli (APEC) gây bệnh cho gia cầm
bằng phân tích DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD). Vi sinh
thú y 2001, 80, 75-83.
9. Chapman PA, Siddons CA, Cerdan Malo AT, Harkin MA. Nghiên cứu
kéo dài 1 năm về Escherichia coli O157 trên gia súc, cừu, lợn và
gia cầm. Epidemiol Lây nhiễm 1997, 119, 245- 250.
10. Chapman PA, Siddons CA, Cerdan Malo AT, Harkin MA. Một nghiên
cứu kéo dài một năm về Escherichia coli O157 trong các sản phẩm
thịt bò và thịt cừu sống. Epidemiol Lây nhiễm 2000, 124, 207-213.
11. Chapman PA, Cerdan Malo AT, Ellin M, Ashton R, Harkin MA.
Escherichia coli O157 ở gia súc và cừu khi giết mổ, trên thịt bò
và thịt cừu và trong thịt bò sống và
Machine Translated by Google
18 Ji-Yeon Kim và cộng sự.
sản phẩm thịt cừu ở Nam Yorkshire, Vương quốc Anh. Int J Thực phẩm Vi
sinh 2001, 64, 139-150.
12. Cobbold R, Desmarchelier P. Một nghiên cứu dài hạn về tỷ lệ lưu
hành của vi khuẩn Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC) ở ba đàn
bò sữa Úc. Vi sinh thú y 2000, 71, 125-137.
13. Cody SH, Glynn MK, Farrar JA, Cairns KL, Griffin PM, Kobayashi J,
Fyfe M, Hoffman R, King AS, Lewis JH, Swaminathan B, Bryant RG,
Vugia DJ. Sự bùng phát bệnh nhiễm Escherichia coli O157:H7 từ nước
táo thương mại chưa tiệt trùng. Ann Intern Med 1999, 130, 202-209.
14. Fagan PK, Hornitzky MA, Bettelheim KA, Djordjevic SP.
Phát hiện các gen hemolysin (EHEC hlyA) giống độc tố giống shiga
(stx1 và stx2), intimin (eaeA) và Escherichia coli (EHEC) hemolysin
(EHEC hlyA) trong phân động vật bằng PCR ghép kênh. Appl Environ
Microbiol 1999, 65, 868-872.
15. Fantelli K, Stephan R. Tỷ lệ lưu hành và đặc điểm của các chủng
Escherichia coli và Listeria monocytogenes sinh Shigatoxin phân
lập từ thịt băm ở Thụy Sĩ. Int J Thực phẩm Vi sinh 2001, 70, 63-69.
16. Feng P. Escherichia coli kiểu huyết thanh O157:H7: phương tiện
lây nhiễm mới và sự xuất hiện của các biến thể kiểu hình. Bệnh lây
nhiễm mới nổi 1995, 1, 47-52.
17. Galland JC, Hyatt DR, Crupper SS, Acheson DW.
Tỷ lệ lưu hành, độ nhạy cảm với kháng sinh và tính đa dạng của
các chủng Escherichia coli O157:H7 phân lập từ nghiên cứu dọc các
lô chăn nuôi bò thịt. Appl Environ Microbiol 2001, 67, 1619- 1627.
18. Gannon VP, D'Souza S, Graham T, King RK, Rahn K, Read S. Sử dụng
gen tiên mao H7 làm mục tiêu trong các thử nghiệm PCR đa bội và
cải thiện độ đặc hiệu trong việc xác định các chủng Escherichia
coli gây xuất huyết đường ruột . J Clin Microbiol 1997, 35,
656-662.
19. Gill CO, Badoni M, McGinnis JC. Lấy mẫu vi sinh của các miếng thịt
và thịt bò sản xuất bằng cách cắt bỏ hoặc dùng tăm bông. J Thực
phẩm Prot 2001, 64, 325-334.
20. Hepburn NF, MacRae M, Ogden ID. Sự sống sót của Escherichia coli
O157 trong chất thải của lò mổ. Lett Appl Microbiol 2002, 35,
233-236.
21. Heuvelink AE, van den Biggelaar FL, Zwartkruis-Nahuis J, Herbes
RG, Huyben R, Nagelkerke N, Melchers WJ, Monnens LA, de Boer E.
Sự xuất hiện của Verocytotoxin sản xuất Escherichia coli O157 tại
các trang trại bò sữa Hà Lan. J Clin Microbiol 1998, 36, 3480-3487.
22. Hitchins AD, Feng P, Watkins WD, Rippey SR, Chandler LA.
Escherichia coli và vi khuẩn Coliform. Trong chúng ta
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (ed.). Sổ tay phân tích vi
khuẩn. tái bản lần thứ 8. trang 4.01-4.29, AOAC International,
Gaithersburg, 1998.
23. Hunter PR, Gaston MA. Chỉ số số về khả năng phân biệt đối xử của
các hệ thống đánh máy: Một ứng dụng của chỉ số đa dạng của Simpson.
J Clin Microbiol 1988, 26, 2465-2466.
24. Karmali MA, Petric M, Bielaszewska M. Đánh giá phương pháp ngưng
kết mủ vi mô (Xét nghiệm Verotox-F) để phát hiện và xác định đặc
tính của Verotoxin (độc tố Shiga) trong Escherichia coli. J Clin
Microbiol 1999, 37, 396-399.
25. Khan A, Das SC, Ramamurthy T, Sikdar A, Khanam J, Yamasaki S,
Takeda Y, Nair GB. Kháng kháng sinh, gen độc lực và hồ sơ phân tử
của độc tố Shiga
sản xuất chủng Escherichia coli phân lập từ nhiều nguồn khác nhau
ở Calcutta, Ấn Độ. J Clin Microbiol 2002, 40, 2009-2015.
26. Kim SH, Yang SJ, Koo HC, Bae WK, Kim JY, Park JH, Baek YJ, Park
YH. Hoạt tính ức chế của Bifidobacteria longum HY 8001 chống lại
độc tố tế bào Vero của Escherichia coli O157:H7. J Food Prot 2001,
64, 1667-1673.
27. Kudva IT, Hatfield PG, Hovde CJ. Đặc điểm của Escherichia coli
O157:H7 và các kiểu huyết thanh E. coli sinh độc tố Shiga khác
được phân lập từ cừu. J Clin Microbiol 1997, 35, 892-899.
28. Maurer JJ, Lee MD, Lobsinger C, Brown T, Maier M, Thayer SG. Kiểu
phân tử của Escherichia coli gia cầm được phân lập bằng cách
khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình.
Avian Dis 1998, 42, 431-451.
29. Morgan D, Newman CP, Hutchinson DN, Walker AM, Rowe B, Majid F.
Verotoxin sản sinh ra các bệnh nhiễm trùng Escherichia coli O157
liên quan đến việc tiêu thụ sữa chua.
Epidemiol Lây nhiễm 1993, 111, 181-187.
30. Motta TR, Moreira-Filho CA, Mendes RP, Souza LR, Sugizak MF, Baueb
S, Calich VL, Vaz CA. Đánh giá tính đa hình DNA được khuếch đại
bởi các đoạn mồi tùy ý (RAPD) như các yếu tố liên quan đến di
truyền để phân biệt các chủng Paracoccidioides brasiliensis độc
lực và không độc lực .
FEMS Immunol Med Microbiol 2002, 33, 151-157.
31. Neilan BA, jacobs D, Goodman AE. Sự đa dạng di truyền và phát sinh
loài của vi khuẩn lam độc hại được xác định bởi đa hình DNA trong
locus phycocyanin. Appl Environ Microbiol 1995, 61, 3875-3883.
32. Nucci C, da Silveira WD, da Silva Correa S, Nakazato G, Bando SY,
Ribeiro MA, Pestana de Castro AF.
Nghiên cứu so sánh vi sinh vật phân lập Edwardsiella tarda ở các
nước khác nhau từ cá và
con người. Vi sinh thú y 2002, 89, 29-39.
33. Orden JA, Cid D, Ruiz-Santa-Quiteria JA, Garcia S, Martinez S, de
la Fuente R. Escherichia coli sinh Verotoxin (VTEC), E. coli gây
bệnh đường ruột (EPEC) và E. coli gây hoại tử (NTEC) được phân
lập từ gia súc khỏe mạnh ở Tây Ban Nha. J Appl Microbiol 2002, 93,
29-35.
34. Pebody RG, Furtado C, Rojas A, McCarthy N, Nylen G, Ruutu P, Leino
T, Chalmers R, de Jong B, Donnelly M, Fisher I, Gilham C, Graverson
L, Cheasty T, Willshaw G, Navarro M , Salmon R, Leinikki P, Wall
P, Bartlett C. Một đợt bùng phát quốc tế về bệnh nhiễm Escherichia
coli O157 sản sinh độc tố tế bào Vero ở khách du lịch; một thách
thức đối với mạng lưới giám sát bệnh truyền nhiễm châu Âu.
Epidemiol Lây nhiễm 1999, 123, 217-223.
35. Pereira MS, Leal NC, Leal TCA, Sobreira M, de Almeida AMP, Siqueira-
Junior JP, Campos-Takaki GM. Phân loại Staphylococcus vàng ở người
và bò bằng RAPD-PCR và ribotyping-PCR. Lett Appl Microbiol 2002,
35, 32-36.
36. Radu S, Ling OW, Rusul G, Karim MIA, Nishibuchi M.
Phát hiện Escherichia coli O157:H7 bằng PCR ghép kênh và xác định
đặc tính của chúng bằng cách định hình plasmid, kháng kháng sinh,
phân tích RAPD và PFGE. Phương pháp vi sinh J 2001, 46, 131-139.
37. Reinders RD, Barna A, Lipman LJA, Bijker PGH.
So sánh độ nhạy của phương pháp tách từ miễn dịch thủ công và tự
động để phát hiện Shiga
Machine Translated by Google

Xác định phân tử E. coli O157:H7 19

Escherichia coli O157:H7 sinh độc tố trong sữa. J Appl Microbiol của vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 gây xuất huyết đường ruột
2002, 92, 1015-1020. được phân lập từ một đợt bùng phát ở Nhật Bản vào năm 1996. Đại lý

38. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR, kháng khuẩn Chemother 1998, 42, 431-432.

Herbert RJ, Olcott ES, Johnson LM, Hargrett NT, Blake PA, Cohen ML. 46. Vernozy-Rozand C, Ray-Gueniot S, Ragot C, Bavai C, Mazuy C, Montet

Viêm đại tràng xuất huyết liên quan đến một loại huyết thanh MP, Bouvet J, Richard Y. Tỷ lệ nhiễm Eshcherichia coli O157:H7 trong

Escherichia coli hiếm gặp . N Engl J Med 1983, 308, 681-685. thịt bò băm công nghiệp. Lett Appl Microbiol 2002, 35, 7-11.

39. Sanderson MW, Gay JM, Hancock DD, Gay CC, Fox LK, Besser TE. Độ nhạy 47. Vuddhakul V, Patararungrong N, Pungrasamee P, Jitsurong S, Morigaki

của nuôi cấy vi khuẩn để phát hiện Escherichia coli O157:H7 trong T, Asai N, Nishibuchi M. Phân lập và xác định đặc tính của Escherichia
phân bò. J Clin Microbiol 1995, 33, 2616-2619. coli O157 từ phân bò và thịt bò bán lẻ ở Thái Lan. FEMS Microbiol

Lett 2000, 182, 343-347.

40. Schmidt H, Scheef J, Morabito S, Caprioli A. Wieler LH, Karch H. Một

biến thể độc tố Shiga 2 mới (Stx2f) từ Escherichia coli được phân 48. Wallace JS, Cheasty T, Jones K. Phân lập verocytotoxin sản sinh

lập từ chim bồ câu. Appl Environ Microbiol 2000, 66, 1205-1208. Escherichia coli O157 từ chim hoang dã. J Appl Microbiol 1997, 82,
399-404.

41. Shinagawa K, Kanehira M, Omoe K, Matsuda I, Hu D, Widiasih DA, Sugii 49. Ware JM, Abbott SL, Janda JM. Một vấn đề chẩn đoán mới: phân lập

S. Tần suất vi khuẩn Escherichia coli sinh độc tố Shiga ở gia súc chủng Escherichia coli O157:H7 có đặc tính sinh hóa bất thường. Chẩn

tại một trang trại chăn nuôi và tại một lò mổ ở Nhật Bản. Vi sinh đoán Microbiol Infect Dis 2000, 38, 185-187.

thú y 2000, 76, 305-309.

42. Swerdlow DL, Woodruff BA, Brady RC, Griffin PM, Tippen S, Donnell HD 50. Watanabe Y, Ozasa K, Mermin JH, Griffin PM, Masuda K, Imashuku S,

Jr, Geldreich E, Payne BJ, Meyer A Jr, Wells JG. Một đợt bùng phát Sawada T. Sự bùng phát nhiễm Escherichia coli O157:H7 tại nhà máy ở
vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 do nước gây ra ở Missouri, liên Nhật Bản. Bệnh lây nhiễm mới nổi 1999, 5, 424-428.

quan đến tiêu chảy ra máu và tử vong. Ann Intern Med 1992, 117,
812-819. 51. DJ Wright, Chapman PA, Siddons CA. Tách từ miễn dịch là một phương

43. Tauxe RV. Các bệnh truyền qua thực phẩm mới nổi: một thách thức sức khỏe pháp nhạy cảm để phân lập Escherichia coli O157 khỏi các mẫu thực

cộng đồng đang gia tăng. Bệnh lây nhiễm mới nổi 1997, 3, 425-434. phẩm. Epidemiol Lây nhiễm 1994, 113, 31-39.

44. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing 52. Yoh M, Frimpong EK, Honda T. Tác dụng của các chất kháng khuẩn, đặc

DH, Swaminathan B. Giải thích các mẫu giới hạn DNA nhiễm sắc thể biệt là fosfomycin, đối với việc sản xuất và giải phóng độc tố Vero

được tạo ra bằng phương pháp điện di trên gel trường xung: tiêu do vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 gây xuất huyết đường ruột. FEMS

chí để phân loại chủng vi khuẩn. J Clin Microbiol 1995, 33, 2233-2239. Immunol Med Microbiol 1997, 19, 57-64.

53. Zhao T, Doyle MP, Shere J, Garber L. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Escherichia

45. Tsuboi I, Ida H, Yoshikawa E, Hiyoshi S, Yamaji E, Nakayama I, coli O157:H7 xuất huyết đường ruột trong một cuộc khảo sát trên đàn

Nonomiya T, Shigenobu F, Shimizu M, O'Hara K, Sawai T, Mizuoka K. bò sữa. Appl Environ Microbiol 1995, 61, 1290-1293.

Nhạy cảm với kháng sinh