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OPU/IVP POSIBILIDADES Obtención de oocitos

• Deben estar en estado inmaduro para ser
utilizados in vitro (FISIOLOGIA)
• Formas de colecta
– Matadero
– In vivo

50-100 terneros/ año

Organigrama del PIV Aspiración oocitos

• Piezas matadero
EMBRIONES DE FECUNDACIÓN IN VITRO
Recuperación Maduración Fertilización Cultivo
Criopreservación: • Mantenerlas 37ºC
1) Congelación
– <2hrs
Cosecha de Blastocistos

2) Vitrificación

• Lavar y desinfectar
– SSF y Alcohol
TE • Aspirar
OPU
– FL 2-8mm
• Diluir
– HEPES gaseificado (min4Hrs)
RECEPTORAS

J.E.Correa. Biotecnicas y biotecnologia Factibilidad Tecnica. Universidad Austral de Chile.

Aspiración folicular en ovarios

Producción de embriones in vitro
postmortem
• Materiales y Equipos • Colección y transporte de ovarios
• Obtención de oocitos
• Selección de oocitos
• Maduración
• Fertilización Solución salina ó (PBS) más antibióticos
Kanamicina 25mg/Lt
• Cultivo Penicilina 100 UI/Lt
4h es el intervalo óptimo Gentamicina 100 µg/Lt
para la maduración mantener a 30°C
(Blondin et al., 1997) (Sirard y First, 1988; Madison et al.,
1992)

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Area de obtención de oocitos

Area de obtención de oocitos Por Aspiración

Obtención de oocitos: matadero Obtención de oocitos: in vivo

• Matadero o postmortem • Ovum pick up (OPU)
– Disección: se corta la superficie del ovario con bisturí ó – Laparoscopía
por medio de un dispositivo que contiene 4 hojas
espaciadas cada 2mm (Süss y Madison 1983) – US
– Aspiración: más eficiente en tiempo • Transvaginal OPU
– Semanal
– Adultos-prepúberes
• 4 –8 oocitos por colecta

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Filtración
Búsqueda

Decantación Características de los COCs

Clasificación de oocitos

A: Bueno; Completamente rodeado por más de 3 capas de células del cúmulus y ooplasma
homogéneo.
A1: oocitos rodeados de un cúmulo denso.
A2: oocitos rodeados de un cúmulo translúcido.

L Leibfried. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science.
1979 .
Alvarez, G. M; Dalvit, G. C; Achi, M. V; Miguez, M. S. Immature oocyte quality and maturational competence of porcine
cumulus-oocyte complexes subpopulations. Biocell (Mendoza) v.33 n.3 Mendoza. 2009. ISSN 1667-5746.

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Clasificación de oocitos
CATEGORIA CARACTERISTICAS
CATEGORIA 1 Presenta tres capas compactas de células
del cumulus que los rodean en toda su
superficie.
CATEGORIA 2 Se presentan rodeados parcialmente por
tres capaz compactas de células del
cumulus.
CATEGORIA 3 Se encuentran rodeadas por células del
cumulus expandidas.
CATEGORIA 4 Oocitos desnudos

JC Gardon. Utilización de antisuero H-Y para sexar embriones bovinos en diferentes estadios del desarrollo embrionario, obtenidos por fertilización in vitro. Tesis doctoral 1999,
Universidad de Córdoba.

Maduración Oocitos
• Medio de Maduración
– Maduración
• Expansión células del cumulus
• Citoplasma
• Nuclear: Inducir la meiosis II
– Medio TCM199
• FSH
• LH
• 17βEstradiol

Filipiak, Y.; Larocca, C. Manual de fertilización in vitro en bovinos. Facultad de Veterinaria. Universidad de la República.
Uruguay.

Maduración Oocitos
• Medio de Maduración
– TCM199
– Gaseificado 6hrs antes
– Lavar 2-3 veces con Medio de Maduración
– Transferir Cajas de Petri
– Gotas de maduración con Ac. Mineral
– Incubadora x 24hrs
– 38ºC
– CO2 5%
– Humedad 95-98%

Filipiak, Y.; Larocca, C. Manual de fertilización in vitro en bovinos. Facultad de Veterinaria. Universidad de la República.
Uruguay.

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Maduración Remoción células de cúmulus

Fertilización
• Tasas de fertilización in vitro 70 a 80%
– Bovinos
– Ovinos
– Caprinos
– (Gordon, 1994).
• Solo un espermatozoide debe entrar por
oocito

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Fertilización Cultivo
• Gotas
– 25 µl de semen
• Durante el cultivo ocurre
– 25µl con 10mcrg/ml – Activación del genoma embrionario
heparina incubado por 4h
– Alternativa: 80 µl PHE: – Compactación de blastómeros
Penicillamine +
hypotaurine + epinephrine – Diferenciación del trofoblasto y embrioblasto
• Se colocan 1-10 COC´S – Formación y la expansión de blastocele
por gota
• Aceite de parafina
• 39C
• 18-24h

Cultivo
• Sistemas de cultivo
– Oviducto de oveja o conejo: 4-5d
• No es especie-específico
– Cocultivo con células somáticas
• Células oviductales: BOEC
• Células epiteliales
• Células de la granulosa
• Células Vero
– Cultivo con medios sintéticos
• KSOM, CR1aa, CR2, TCM-199, CZB, SOF, USU, Ham F-10,
Menezo B, etc

– (Marquant-Leguienne y Humblot, 1998).

Cultivo Cultivo hasta eclosión

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