广东药科大学学报

Journal of Guangdong Pharmaceutical University Aug． 2020，

36( 4)

天然药物化学

不同产地的大枣药材 UPLC 指纹图谱及含量

测定方法研究
曾杉，甘伟发，史紫娟
( 国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

摘要: 目的 建立不同产地大枣药材的指纹图谱和质量分数测定的 UPLC 法。方法 选择 15 批全国不同

产地的大枣药材，采用 UPLC 法建立大枣药材指纹图谱，色谱条件: 色谱柱为 Waters HSS T3 柱( 150 mm
×2．1 mm，
1．6 μm) ，流动相为 0．1%磷酸-乙腈( 梯度洗脱) ，流速为 0．25 mL / min，柱温为 30 ℃ ，波长为 254
nm; 采用 UPLC 法测定大枣药材中环磷腺苷的质量分数，色谱条件: 色谱柱为 Waters BEH C18 柱( 100 mm
×2．1 mm，
1．7 μm) ，流动相为甲醇-0．05 mol / L KH2 PO4 溶液( 体积比 8 ∶92) ，流速为 0．4 mL / min，柱温为
30 ℃ ，波长为 259 nm。结果 指纹图谱研究确定了 14 个共有特征峰，各特征峰分离度良好，并指认了鸟
5-羟甲基糠醛和芦丁 4 个已知化合物; 15 批不同产地大枣药材中环磷腺苷的质量分数范
苷、环磷腺苷、
围为 101 ～ 441 μg / g，不同产地间的差异不大，山西省、河南省、甘肃省的较高，山东省和河北省的较低。
结论 建立的不同产地大枣药材的指纹图谱和含量测定的方法稳定可重复，满足方法学考察要求，可作
为大枣药材质量控制方法。
关键词: 大枣; 超高效液相色谱法; 指纹图谱; 环磷腺苷
中图分类号: Ｒ284．2 文献标志码: A 文章编号: 2096-3653( 2020) 04-0458-05
DOI: 10．16809 / j．cnki．2096－3653．2020031707

Study on UPLC fingerprint and determination of Ziziphus jujube from different

habitats
ZENG Shan，GAN Weifa，SHI Zijuan
( Guangdong Medi-world Pharmaceutical Company Limited，Foshan 528303，China)
*
Corresponding author Email: 309381753@ qq．com

Abstract: Objective To establish UPLC fingerprints and determination method of Ziziphus jujube from
different habitats． Methods 15 batches of jujube products were selected from different habitats． UPLC was
used to establish fingerprints of Ziziphus jujube． Waters HSS T3 ( 150 mm×2．1 mm，1．6 μm) column was
used with 0．1% phosphoric acid and acetonitrile as mobile phase( gradient elution) at the flow rate of 0．25
mL / min． The column temperature was 30 ℃ and detection wavelength was set at 254 nm． The content of
cAMP in Ziziphus jujube was determined by UPLC． Waters BEH C 18 ( 100 mm× 2．1 mm，1．7 μm) column
was used with 0．05 mol / L KH2 PO4 and methanol as mobile phase( 8 ∶92) at the flow rate of 0．4 mL / min．
The column temperature was 30 ℃ and detection wavelength was set at 259 nm． Ｒesults A total of 14
common peaks were characterized， and the characteristic peaks were well-separated． The Guanosine，
cAMP，5-hydroxymethylfurfural and Ｒutin were determined by reference substances． The determination of
cyclic adenosine in 15 batches of Ziziphus jujube was 101 ～ 441 μg / g． There was little difference between
different habitats． It was higher in Shanxi， Henan and Gansu， and it was lower in Shandong and Hebei．
Conclusion The present methodology meets the technical requirements， which can be a basis for the
intrinsic quality control standard for Ziziphus jujube．
Key words: Ziziphus jujube; UPLC; Fingerprints; cAMP

收稿日期: 2020-03-17
作者简介: 曾杉( 1985—) ，硕士，制药工程师，从事中药分析、中药配方颗粒与经典名方研究，电话: 0757-28388531，Email:
309381753@ qq．com。
第4期 曾杉，等．不同产地的大枣药材 UPLC 指纹图谱及含量测定方法研究 459

大枣( Ziziphus jujuba Mill．) 俗名又称红枣，是鼠 究院，批号: 100080-201610) ，5-羟甲基糠醛 ( 中国食

李科植物枣的成熟果实，临床上具有补中益气、养血 品药品检定研究院，批号: 111977-201501) ，鸟苷 ( 中
安神的效果，具有很高的食用和药用价值。 大枣在 国食品药品检定研究院，批号: 111977-201501) ; 甲
中药复方中入药的历史十分悠久，在《伤寒论》、《本 醇、乙腈为 HPLC 级，实验用其他试剂均为 AＲ 级。
草纲目》、《千金翼方》等多部古籍中均有入药记载。 1．3 样品
现代药理学研究表明，大枣在抗肿瘤、改善心脑血管 15 批大枣药材 ( 编号 S1-S15) 分别从河南、山
系统、增强人体免疫力和造血功能等方面均有明显 东、山西、甘肃、河北等不同产地购得，其中编号 S1-
［1-2］
药效 。大枣化学成分复杂，含有多达上百种成 S3 采集地点为山东省临沂市平邑县，编号 S4-S6 采
分，主要成分为核苷酸类、生物碱类、皂苷类、黄酮 集地点为河南省安阳市内黄县，编号 S7-S9 采集地
类、糖类化合物等，其中包括环磷腺苷 ( cAMP ) 、尿 点为甘肃省武威市民勤县，编号 S10-S12 采集地点
嘧啶、鸟苷、芦丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多种化 为山西省长治市沁源县，编号 S13-S15 采集地点为
［3］
学成分 。 河北省沧州市沧县，按 2015 年版《中国药典 》检验
中药配方颗粒是饮片采用传统水煎煮方式提取 均合格。
后通过现代成型工艺制备所得的颗粒制剂，具有服
2 指纹图谱方法的建立
用、贮藏方便且易于携带等诸多优点。 中药配方颗
粒质量标准的提高需深入开展药材饮片特征图谱研 2．1 色谱方法

究，并 建 立 原 料 质 量 控 制 体 系
［4］
。环 磷 腺 苷 色谱 柱: Waters HSS T3 ( 150 mm × 2． 1 mm，

( cAMP) 是大枣的主要水溶性成分之一，果实中含 1．6 μm) ; 流动相: 0．1% 磷酸溶液 ( A) -乙腈 ( B) ，梯

量最高，在生理生化过程中作为反向调节的第二信 度洗脱 ( 0 ～ 3 min，0% B; 3 ～ 12 min，0% → 10% B;

使，在基因转录和蛋白质合成中发挥重要作用。 美 12 ～ 25 min，10% → 20% B; 25 ～ 30 min，20% → 95%

国药典委员会出版的《草药法典 》( Herbal Medicines B) ; 柱温: 30 ℃ ; 流速: 0．25 mL / min; 波长: 254 nm;

Compendium) 标 准 集 中 收 载 了 大 枣 的 相 关 质 量 标 进样量: 1 μL; 理论塔板数按环磷腺苷峰计应不低

准，该标准以环磷腺苷为含量测定指标并规定其质 于10 000。

量分数不得少于 0．010%。目前，对于大枣药材指纹 2．2 对照品溶液的制备

图谱和含量研究文献相对甚少
［5-7］
，2015 年版《中国 取环磷腺苷、5-羟甲基糠醛、鸟苷、芦丁对照品

药典》制定的大枣药材标准中仅通过性状、显微、薄 适量，精密称定，加 40%( 体积分数，下同) 甲醇制成

层鉴别等项目控制大枣药材的质量，并无含量测定 每 1 mL 分 别 含 环 磷 腺 苷 50 μg、5-羟 甲 基 糠 醛

和指纹图谱项
［8］
。本研究建立了 15 批不同产地大 20 μg、鸟苷 50 μg、芦丁 20 μg 的对照品溶液，即得。

枣药材的指纹图谱和含量测定的 UPLC 法，完善和 2．3 供试品溶液的制备

提高了大枣药材的质量控制标准，为提高大枣配方 取大枣药材粉末 ( 过三号筛 ) 约 2． 0 g，精密称

颗粒的质量控制水平提供了依据。 定，置具塞量瓶中，精密加入 40% 甲醇 20 mL，称定

质量，超声处理( 500 W，
40 kHz) 20 min，取出，放冷，
1 仪器与试药 用 40% 甲醇补足损失质量，
5 000 r / min 离心 5 min，
1．1 仪器 取上清液，滤过，即得。
H-class UPLC 高效液相色谱仪 ( PDA 二极管阵 2．4 共有峰的确认
列检测器，Water 公司 ) ; AL104 型电子天平 ( Mettler 精密吸取“2．2”项下的对照品溶液和“2．3”项下
Toledo 公司) ; KQ-500DE 型超声仪 ( 昆山超声仪器 供试品溶液各 1 μL，进样测定，记录色谱图，结果显
有限公司) ; M Millipore Synergy UV 超纯水仪 ( 美国 示峰 6、峰 7、峰 9 和峰 14 保留时间分别与鸟苷、环
默克公司) 。 磷腺苷、
5-羟甲基糠醛和芦丁对照品保留时间相对
1．2 试药 应，见图 1。
对照品: 环磷腺苷 ( 中国食品药品检定研究院， 2．5 指纹图谱方法学考察
批号: 140709-201404) ，芦丁 ( 中国食品药品检定研 2．5．1 精密度试验 取同一批药材 ( 编号: S4) 按
 460 广东药科大学学报 第 36 卷

“2．3”项方法制备溶液，连续进样 6 次，以环磷腺苷
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为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的 ＲSD 值均 !## .
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小于 1．0%，相对峰面积 ＲSD 值均小于 5．0%，表明仪 $"# /%)
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器精密度良好。

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2．5．2 稳定性试验 取同一份供试品 ( 编号: S4) 溶 %"# /+
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液，按“2．1”项色谱条件分别在 0、
2、4、
8、12、
16、
24 h %## /*
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进样测定，以环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对 /!
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保留时间的 ＲSD 值均小于 1．0%，
相对峰面积 ＲSD 值
# $ ) * + %#%$%)%*%+$#$$$)$*
均小于 5．0%，
表明供试品溶液 24 h 内稳定性较好。 "
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图1 对照品及大枣药材的 HPLC 色谱图 "

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Figure 1 HPLC of reference substances and Ziziphus jujube

峰 6．鸟苷; 峰 7．环磷腺苷; 峰 9． 5-羟甲基糠醛; 峰 14．芦丁。
图3 15 批大枣药材对照指纹图谱
2．5．3 重复性试验 取同一批药材 ( 编号: S4) ，按
Figure 3 HPLC reference fingerprint of 15 batches of Ziziphus
“2．3”项方法平行制备 6 份供试品溶液进样测定，以
jujube
环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的
ＲSD 值均 小 于 1． 0%，相 对 峰 面 积 ＲSD 值 均 小 于
表1 15 批大枣药材相似度分析结果
5．0%，表明方法重复性良好。
Table 1 Ｒesults of similarities test of 15 batches of Ziziphus
2．5．4 中间精密度试验 取 同 一 批 药 材 ( 编 号: jujube
S4) ，由不同实验人员在不同日期按“2．3”项方法平
编号 相似度 编号 相似度
行制备 6 份样品进样测定，以环磷腺苷为参照峰，计
S1 0．989 S9 0．984
算各特征峰相对保留时间的 ＲSD 值均小于 1．0%，
S2 0．990 S10 0．928
相对峰面积 ＲSD 值均小于 5．0%，表明方法中间精
S3 0．990 S11 0．981
密度良好。
S4 0．993 S12 0．973
2．6 指纹图谱的测定
S5 0．993 S13 0．930
取 15 批不同产地的大枣药材按“2．3”项方法制
S6 0．978 S14 0．932
备供试品溶液进行测定，将结果导入相似度软件进
S7 0．978 S15 0．955
行拟合并生成对照指纹图谱，选择峰面积稳定的色 S8 0．984 Ｒ 1．000
谱峰作为共有峰，最终确定 14 个稳定的共有峰，并
通过对照品指认其中的鸟苷、环磷腺苷、
5-羟甲基糠
醛和芦丁 4 个已知峰，相似度计算结果显示 15 批大
3 大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定
枣药材样品的指纹图谱相似度均高于 0．90 以上，表 3．1 对照品溶液的制备
明不同产地的大枣药材成分差异不大，质量稳定，结 取环磷腺苷对照品适量，精密称定，加 40% 甲
果见图 2、图 3 和表 1。 醇制成每 1 mL 含环磷腺苷 10 μg 的溶液，即得。
第4期 曾杉，等．不同产地的大枣药材 UPLC 指纹图谱及含量测定方法研究 461

3．2 供试品溶液的制备 “3．3”项色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐

取本品粉末( 过三号筛 ) 约 1．0 g，精密称定，置 标、环磷腺苷的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得
具塞量瓶中，精密加入 40% 甲醇溶液 10 mL，称定质 线性回归方程 Y = 0．7 046 X － 0．040 7，r = 1．000 0，
量，超声处理( 500 W，
40 kHz) 30 min，放冷后用 40% 表明环磷腺苷质量浓度在 1．073 ～ 42．92 μg / mL 范围
甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。 内与峰面积线性关系良好。
3．3 色谱条件 3．4． 2 精密度试验 取 大 枣 药 材 ( 编 号: S8) 按
色谱 柱 为 Waters BEH C 18 色 谱 柱 ( 100 mm × “3．2”项方法制备供试品溶液，连续进样 6 次，计算
2．1 mm，
1．7 μm) ; 以甲醇-0．05 mol / L KH 2 PO 4 溶液 环磷腺苷峰面积 ＲSD 值为 0．09%，表明仪器精密度
溶液( 体积比 8 ∶92) 为流动相; 检测波长为 259 nm; 良好。
进样量为 1 μL; 流速为 0．4 mL / min; 柱温为 30 ℃ 。 3．4．3 稳定性试验 取新制备的供试品溶液 ( 编
按上述色谱条件取对照品、空白溶剂和供试品溶液 号: S8) 分别在 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，
进行，色谱图见图 4。 计算环磷腺苷色谱峰峰面积 ＲSD 值为 0．26%，表明
供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

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3．4．4 重复性试验 取同一批大枣药材 ( 编号: S8)
同法平行制备 6 份溶液进样，计算环磷腺苷平均质
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量分数为 221 μg / g，其 ＲSD 值为 0．49%，表明方法
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重复性良好。
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(% !"#$% 3．4．5 加样回收率试验 精密称取折干后量分数

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)% ()$* 为 221 μg / g 的 大 枣 药 材 粉 末 ( 编 号: S8，水 分:
% 18．5%) 约 0．5 g，平行 6 份，各加入环磷腺苷对照品
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97．80 μg，按“3．2”项方法制备供试品溶液，进样测
"
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-
定，分别计算加样回收率，结果见表 2。 可见，腺苷
加样平均回收率为 104．10%，ＲSD 值为 3．81%，表明
图4 环磷腺苷对照品、空白溶剂及大枣药材的色谱图
Figure 4 HPLC of cAMP，blank control and Ziziphus jujube
方法准确度良好。
3．5 15 批大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定
3．4 方法学考察 取 15 批不同产地大枣药材样品，按“3．2”项方法制
3．4．1 线性关系考察 精密称取环磷腺苷对照品 备供试品溶液，按“3．3”项色谱条件测定环磷腺苷的
10．73 mg，置 50 mL 量瓶中，加 40% 甲醇定容，作为 质量分数，结果见表 3。可见，
15 批不同产地的大枣
储备液。分别精密量取上述储备液稀释成 1． 073、 的环磷腺苷质量分数在 101 ～ 441 μg / g 之间，不同
5．365、
10．73、21．46、42．92 μg / mL 的对照溶液，精密 产地间的差异不大，以山西省、河南省、甘肃省的较
吸取各浓度对照品溶液 1 μL，注入液相色谱仪，按 高，山东省和河北省的较低。

表2 环磷腺苷加样回收率试验结果
Table 2 Ｒesults of recovery of cAMP

称样量 / g 样品中的量 / μg 加入量 / μg 测得量 / μg 回收率 / % 平均回收率 / % ＲSD / %

0．507 0 91．32 97．80 197．69 108．76

0．509 7 91．80 97．80 195．90 106．44
0．501 1 90．26 97．80 193．08 105．14
104．10 3．81
0．500 7 90．18 97．80 193．54 105．68
0．508 0 91．50 97．80 188．47 99．15
0．507 4 91．39 97．80 188．65 99．45
 462 广东药科大学学报 第 36 卷

表3 15 批大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定结果 指标，其他 3 个成分不作测定要求。

Table 3 Determination results of cAMP in 15 batches of 本研 究 测 定 了 15 批 不 同 产 地 的 大 枣 药 材
Ziziphus jujube UPLC 指纹图谱，共确定了 14 个特征峰，指认了鸟
w( 环磷腺苷) / w( 环磷腺苷) / 苷、环磷腺苷、5-羟甲基糠醛和芦丁 4 个已知峰，相
编号 －1
编号 －1
( μg·g ) ( μg·g ) 似度计算结果显示 15 批大枣药材的指纹图谱相似
S1 101 S9 256 度均高于 0．90 以上。 同时建立了大枣药材中环磷
S2 132 S10 351 腺苷质量分数测定方法，结果显示 15 批不同产地的
S3 168 S11 358 大枣的环磷腺苷质量分数在 101 ～ 441 μg / g 之间，
S4 233 S12 441 不同产地间的差异不大，以山西省、河南省、甘肃省
S5 261 S13 132 的较高，山东省和河北省的较低，与文献［6］中山东

S6 284 S14 138

大枣药材含量( 168 μg / g) 基本相符。
综上所述，本研究中建立大枣药材指纹图谱和
S7 262 S15 153
质量分数测定的方法简单易操作，稳定性和重复性
S8 221
均良好，可作为大枣药材的质量控制方法。
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( 责任编辑: 陈翔)
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