Mikrobiális törzsfejlesztés

Genetikai és molekuláris biológiai

alapok
 Genom
• Az adott faj kromoszómakészletének (= nukleáris
genom) és a mitokondrium / kloroplaszt (=
extranukleáris genom) együttes genetikai anyaga.
• Ide tartoznak az episzómák is
• Episzóma: Genetikai elem baktériumokban,
amely képes szabadon replikálódni a
citoplazmában vagy beépül a baktérium
kromoszómába és a kromoszómával együtt
replikálódik
Genom
Gén
 Lókusz
• A gén helye a kromoszómán
• Gyakran a"gén" szinonimájaként is
használatos.
 ORF
• open reading frame = nyitott leolvasási keret
• a DNS egy lehetséges fehérjekódoló szakasza,
amely start kodonnal kezdődik, stop kodonnal
végződik
 Exon és intron
• E: a genomikus szekvencia érett mRNS-ben
megjelenő része, csak ez kódol fehérjét
• I: Eukarióták mRNS-ének fehérje kódoló
szakaszait megszakító DNS darab. Az mRNS
érése során (splicing) az intronok kivágódnak
Promóter-operátor-terminátor
 Promóter
• A transzkripció kezdő pontja előtti szakasz,
ahová az RNS polimeráz kötődik. Jellegzetes
szekvenciája a TATA-box
 Operátor
• A promóter és a struktúrgén között
elhelyezkedő DNS szakasz, amely a represszor
fehérje kötőhelyéül szolgál
 Terminátor (lánczáró, stop)
kodonok
• Az UAA (ochre), az UAG (amber) és az UGA
(opal) kodonok nem aminosavat, hanem a
szintézis leállítását jelentik
 Géntérkép
• A kapcsoltsági térkép a kromoszómán, amely a
gének lineáris elrendeződését mutatja a
közöttük lévő távolságokkal
• Ritkábban egyetlen génen belül is értelmezik,
ahol az interallélikus (= intragénikus!)
rekombinációs adatok alapján az egyes allélek
mutációs pontjainak elrendeződését jelenti
 Prokarióta génexpresszió
• transzkripció és transzláció egy térben, egymás
után szorosan követik egymást
• transzkripció szabályozása jelentős részben
represszor fehérjék segítségével: a promóter és
az RNS polimeráz általában elég a transzkripció
elindításához
• transzkripciós egységenként több fehérjekódoló,
nyitott leolvasási keret (open reading frame, ORF)
policisztronos mRNS a jellemző
 Eukarióta génexpresszió
• transzkripció és transzláció külön térben, egymástól jól
elválasztva
• három féle RNS polimeráz: pol-I, pol-II, pol-III
• transzkripció szabályozása jelentős részben aktiváló jellegű,
transzkripciós faktor fehérjék segítségével: a promóter és az
RNS polimeráz önmagában nem elég a transzkripció
elindításához
• transzkripciós egységenként egy fehérjekódoló, nyitott
leolvasási keret (open reading frame, ORF) monocisztronos
mRNS)
• a mRNS érési folyamaton megy keresztül, mielőtt kijutna a
sejtmagból, egy átlagos gén jóval hossszabb mint az érett
mRNS: exonok, intronok, splicing
 cDNS
• Copy vagy komplementer DNS
• DNS, amely az mRNS-ről, mint mintáról reverz
transzkripcióval készül. Intront nem tartalmaz.
• Szekvenciájából következtetni lehet a kódolt
fehérje aminosav sorrendjére
cDNS
Northern analízis
Southern blot analízis
Hibridizáció
PCR
 Restrikciós endonukleázok
• DNS-en belül 4–6 bázisból álló, meghatározott
szakaszokat „ismernek fel”, és ott a DNS
mindkét szálát elhasítják
• Escherichia coli-ból elsőként izolált: EcoRI
• Minden restrikciós enzim nevének első 3
betűje az őt előállító mikroorganizmus latin
nevéből ered, az első betű a genus nevének
első betője, a következő kettő pedig a fajnév
első két betűje
 Plazmid
• élesztőgombákban, mind baktériumokban
megtalálható cirkuláris szerkezetű DNS,
melynek önreplikációs képessége van
 Klónozó vektor
• A plazmid akkor válik jól használható vektorrá,
ha:
mérete kicsi, max. 5 kB,
van replikációs origója,
vannak szelekcióra alkalmas un. marker gének
rajta,
minél többféle restrikciós enzim hasítási hely, de
egy enzimhasítási helyből csak egy legyen,
nehogy feldarabolódjon a plazmid
Klónozó vektor
Replikációs origó
Ligálás
TA-cloning
Ligálás
 Lac operon

IPTG: izopropil-thiogalaktozid (allolaktóz analóg)

X-gal: chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-
galactoside (X-gal).
Laktóz-allolaktóz
Ligálás
Transzformáció
 Kompetens sejt
• A sejt azon állapota, amikor DNS-t fel tud
venni
• E. coli: mesterséges kompetencia kialakítása
 Kompetens sejt
• Elektroporáció: nagy térerősség átmeneti
lyukat képez a sejtfalon
• Kinti nagy plazmid koncentráció beszivárog
Elektroporációs küvetta

E. coli sejtek
 E. coli transzformáció
• Természetes körülmények között nincs
transzformáció
• Ca2+-ionok, hősokk; elektroporáció
• Plazmid DNS-sel transzformálható, mert az
nem linearizálódik
• recA1 mutáció (rekombináció)
• endA1 mutáció (nukleáz inaktiválás)