Isolamento e

Purificação de Produtos Naturais

CCD e Cromatografia
em coluna
Willian Andrioli

Macaé 2019
1
CROMATOGRAFIA

SEPARAÇÃO
IDENTIFICAÇÃO
QUANTIFICAÇÃO
CROMATOGRAFIA VERSATILIDADE

Escala analítica Identificação e quantificação

Escala preparativa

Compostos orgânicos
Compostos inorgânicos

Compostos polares
Compostos apolares

Compostos de baixa massa molar

Compostos de alta massa molar
Compostos polares e apolares

Citrus sinensis
T. terrestris

V. vinifera Taninos hidrolisáveis

Flavonoides
Alta massa molecular

Baixa massa molecular

 CLASSIFICAÇÃO

Cromatografia

Planar Coluna

Líquido Líquido Gás Fluído super

crítico

CCC CLAE
CP CCD CG CFSC
 Fase estacionária (FM): sólido ou líquido.

 COLUNA Dentro da coluna ou espalhada como um

filme

A fase móvel pode ser um gás ou um

líquido

PLANAR →
CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) E
EM CAMADA DELGADA (CCD)

1. Aplicação
2. Desenvolvimento
3. Análise
 PLACAS PRONTAS

Suporte de vidro, poliéster, alumínio

Preparo de placas manualmente
 ATIVAÇÃO DAS PLACAS
Retirar a água da superfície do adsorvente → aquecimento

Maior retenção
Maior reprodutibilidade
 APLICAÇÃO DA AMOSTRA

Ponto
1 a 5 mm

1 2 3 4 5

Spot Contínuo
Capilares de vidro

Seringas
Aplicadores automáticos
DESENVOLVIMENTO
CUBAS CROMATOGRÁFICAS

Cilíndricas

Retangulares
ASCENDENTE
 Saturação da cuba
1. Vapor em equilíbrio com a fase líquida

2. Vapor do solvente adsorve na fase estacionária

3. Solvente migrando na placa evapora

Maior reprodutibilidade

Rapidez
 DESENVOLVIMENTO BI-DIMENSIONAL

Aplicação 1o eluição Rotação 90° 2o eluição

Diferentes fases móveis: diferentes separações

HORIZONTAL
 1. Placa (virada para baixo)
2. Placa de vidro
3. Reservatório com a fase móvel
4. Dispositivo para colocar a fase móvel em contato com a placa
5. Placa
6. Pratelerira de condicionamento

Não há efeito da gravidade

Velocidade de migração é constante
Melhor separação
Melhor controle das condições de separação (saturação, evaporação)
 VISUALIZAÇÃO

1. COMPOSTOS COLORIDOS: visíveis a olho nú

2. COMPOSTOS INCOLORES: uso de reveladores químicos

2.1. Imersão em IODO

Compostos orgânicos
com insaturações
conjugadas
 2.2. Nebulização com reagentes específicos
Compostos orgânicos ou inorgânicos: formação
de um composto colorido

Vanilina sulfúrica

Anisaldeído sulfúrico

Reagente de Dragendorff
UV Anisaldeído
2.3. Exposição a luz UV: dupla ligação conjugada e aromáticos
 Análise Qualitativa
Fator de retenção e cor das manchas
RF = dr/dm

IMPORTANTE!!!

Comparações entre amostra e

padrões analisados: exatamente
nas mesmas condições

Revelação ajuda na identificação

Fig. 2. HPTLC fingerprint of flavonoids of the selected plants (image 366 nm, after
derivatization). Extracts of the individual sample, 10 μl (2 mg/mL) were spotted onto the
activated TLC plate. Ethyl acetate:formic acid:glacial acetic acid:water (100:11:11:27) as
solvent system. Natural products–polyethylenglycol reagent (NP/PEG) was used as
flavonoid derivatizing agent. The track number 1. C. roseus, 2. O. sanctum, 3. T.
cordifolia, 4. A. marmelos, 5. rutin (15 μg), 6. rutin (10 μg), 7. rutin (5 μg), 8. F.
golmerata, 9. P. corlifolia, 10. T. terrestris, 11. M. cetrifolia.
 Utilização de técnicas auxiliares
Amostras complexas e/ou desconhecidas
Extração da substância da placa e identificação por técnicas auxiliares

1. Localizar a mancha (luz UV ou

revelando nas extremidades)
2. Raspar a camada do adsorvente e
transferir para um tubo
3. Adicionar um solvente no qual o
composto de interesse é solúvel
4. Centrifugar e separar o
sobrenadante
5. Usar técnicas auxiliares de
identificação no sobrenadante
Espectrofotometria por absorção no UV-VIS
Espectrometria de Massas
Infra-vermelho
Espectro de Ressonância Magnética Nuclear
Cromatografia em camada delgada de alta eficiência

Cromatografia em camada delgada

Cromatografia em camada delgada de alta eficiência

 Comparação CCD e CCDAE
CCD CCDAE
Diâmetro médio da partícula de sílica 20 m 5 m
Tamanho da placa 20 x 20 cm 10 x 10 cm
Volume aplicado da mostra 1 – 5 L 0,1 – 0,2 L
Número de amostras por placa 7 – 10 10 –20
Diâmetro da mancha 3 – 6 mm 1 mm
Distância de migração do solvente 10 – 15 cm 3 – 6 cm
Tempo de corrida 30 – 200 min 3 – 20 min
Limites de detecção 5 ng 0,5 ng

Caminhos múltiplos: bandas alargadas

Redução do alargamento
- placas bem preparadas
- fase estacionária com partículas
pequenas e de tamanho homogêneo
 Cyclography
Cromatografia Circular ou Chromatotron
CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA
(CCC)
TIPOS DE COLUNAS
 PREPARAÇÃO DA COLUNA: empacotamento

Prepara-se uma suspensão da FE na FM (p.e.: sílica em hexano)

Adiciona-se a suspensão na coluna contendo um pouco de FM

Abrir a torneira para abaixar o nível da FM

Vibrar a coluna para que o recheio sedimente de forma homogênea

APLICAÇÃO DA AMOSTRA
2.1 Incorporar a amostra em sílica
e acomodar no topo da FE.

2.2 Solubilizar a amostra

e colocar no topo da FE.
DESENVOLVIMENTO
 TIPOS DE DESENVOLVIMENTO

ELUIÇÃO ISOCRÁTICA: a composição da fase móvel é mantida

constante durante a análise

Separação de 4 compostos
FE: sílica
FM: C6H6:EtOAc (7:3)
ELUIÇÃO POR GRADIENTE: a composição da fase móvel é alterada
durante a análise

Força da fase móvel é aumentada

C6H6:AcOEt (9:1) C6H6:AcOEt (5:5)

 Cromatografia em colunas
Amostra in natura
Frações Clássica

Flash

CLV – C. Líquida à Vácuo

Fases Estacionárias - FE Clássica
Flash

CLV

Sílica gel 60Å

70-230 mesh
Sílica gel 60Å (0,063-0,200 mm)
Sílica gel 60Å 5-40µm 230-400 mesh
(0,040-0,063 mm)
 Porque usar cromatografia flash?
Cromatografia clássica: longa e tediosa
Flash
Técnica mais rápida: tempo de separação
1 a 3h.
Para fins preparativos
Barato e de fácil operação

Ar pressurizado,
coluna de vidro,
válvulas e
reservatório
Cromatografia liquida a vácuo (CLV)
Década de 70. Impatience of Australian chemists with classical
column chromatography.

Filtro de Buchner com disco poroso.

Preenchimento com oxido de alumínio grau

CCD ou silica gel.

Torneira de três vias para controlar vácuo

provido por bomba (20-70 mm Hg)
 Procedimento de CLV
(1) Preenchimento da coluna: colocação de silica 60H e
abastecimento com fase móvel apolar

(2) Aplicação da amostra: ao topo da coluna a amostra é aplicada e

protegida com areia ou algodão.

(3) Eluição: uso de fase móvel isocrática sob vácuo. Recolher cada
gradiente em um frasco até a secura, repetir o procedimento com o
gradiente seguinte

(4) Aumentar a polaridade de rapidamente (5, l0, 20, 50 até 100%). De

20 a 25 frações é suficiente pra esgotar a amostra.
 Uso da Cromatografia Líquida à Vácuo

Método rápido, separação inicial de amostras em grande

quantidade.

Sílica pode ser reutilizada

Uso de grandes quantidades de solvente

Separação de grande várias classes químicas de produtos

naturais: terpenos, alcaloides, policetídeos, flavonoides, etc.

Método simples e barato

Referências

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