- kết tinh được

• Đa số [C,H,O,N]  rắn / tO thường

- mp rõ ràng
(trừ arecolin; pilocarpidin dạng lỏng)
(nếu bền tO)

- bay hơi được,

• Đa số [C,H,O,N]  lỏng / tO thường
- bền nhiệt,
(trừ sempervirin, conessin và Δ’ )
- cất kéo được

(nicotin, coniin)
2
 Trong tự nhiên, các alkaloid thường có. . .

- mùi : thường không mùi

- vị : thường đắng
(piperin, capsaicin cay; aconitin không đắng !!!)
- màu : thường không màu (trừ n.Δ)
(berberin, palmatin vàng, chelidonin, colchicin vàng nhạt,
pyocyanin xanh, ibogain đỏ, jatrorrhizin đỏ cam)
- []D : thường < 0 o (tả triền; nhưng d-tubocurarin !)
ephedrin: dạng l mạnh gấp 3 dạng d.
- pKa : thường từ 7 – 9.

3
 Dạng alkaloid trong cây

(đa số)

dạng base dạng muối dạng glycosid

(hiếm) (ít)

• với acid vô cơ (ít gặp: morphin sulfat)

• với acid hữu cơ thường (succinic, gallic, tannic…)

• với acid hữu cơ đặc biệt (meconic, tropic, aconitic…)

4
 Nói chung, các alkaloid base:

* có độ phân cực kém đến trung bình

- tan trong dmhcơ kém phân cực  phân cực trung bình;
- khó tan trong các dmhcơ quá kém phân cực (EP, n6).
- áp dụng chiết & tinh chế (kiềm hóa, biến alkaloid muối
thành alk. base, chiết alk. base bằng Bz, DCM, Cf, Et2O...)
* đa số có tính kiềm
 dễ bị kéo vệt trên bản si-gel pha thuận (Si-OH).
khắc phục : thêm kiềm vào pha động, vết sẽ gọn.
* kém bền (nhất là khi + tO + thời gian)
 nên chiết dưới dạng alkaloid muối (bền hơn)
5
• alk. base: thường kém tan / nước (trừ các alk có N IV)
dễ tan / dmhcơ kém phcực
cafein, coniin, colchicin, nicotin, spartein, ephedrin, pilocarpin
tan trong nước; morphin, strychnin kém tan trong ether.

• alk. muối: dễ tan / nước (– Bb.Cl; Bb.NO3)

kém tan / dmhcơ kém ph.cực (≠ EP)
berberin clorid, berberin nitrat kém tan / nước
Lobelin.HCl, reserpin.HCl, apoatropin.HCl lại tan / CHCl3

• alk. phenol: dạng base tan được / d.dịch kiềm

(morphin base, cephaelin base)
6
 Coctanol
Coctanol log Pow = log
Cnước

Cnước

log Pow càng lớn càng dễ tan / dmhc kém ph.cực

7
Trừ cocain, apoatropin, truxillins khó tan / nước
(log Pow lớn, như đa số các alk bình thường khác)
Các alkaloid tropan khác lại dễ tan / nước (log Pow nhỏ)

Hyoscyamin 1,53 Cocain 3,08

Scopolamin 1,34 Apoatropin 3,21
Pelletierin 0,45 Truxillins 4,30
Ψ-Pelletierin 0,63 Quinin 3,44
Ecgonin -0,60 Reserpin 4,40

8
Các alk morphinan thường tan được / nước
(log Pow nhỏ)

alkaloid log Pow pKa

morphin 0.87 8.2
oxymorphon 1.15 9.3
hydromorphon 1.06 8.2
hydrocodon 1.83 8.9
oxycodon 1.87 8.9
codein 1.39 8.2
nor-codein 0.89 9.2
9
Strychnin
- khó tan trong ether
- dễ tan trong CHCl3.
- rất dễ tan / hỗn hợp Et2O - CHCl3 (1 : 1)

Một số alkaloid (ephedrin, cafein)

có thể thăng hoa được ở áp suất thường
 dùng pp thăng hoa để tinh chế
(trộn bột trà với vôi, đun / cát),

10
1. Dao động dãn N – H (stretching)
- cho 1-2 băng yếu ở vùng 3200-3500 cm–1
- các băng này yếu hơn và sắc hơn băng do –OH.
• Amin I cho 2 băng
- mạch thẳng: vùng (3400-3300) và (3330-3250)
- thơm : 2 băng vùng > so với mạch thẳng.
• Amin II cho 1 băng vùng (3350-3310) cm–1

• Amin III ở dạng muối.HX: sẽ có thêm 1 băng 2530-2600

(do xuất hiện liên kết N-H trong R3NH+.X–)
11
2. Dao động uốn N – H (bending/scissoring; vừa  mạnh)
• amin I : cho băng ở vùng (1650-1580) cm–1
• amin II: cho băng ở vùng 1515 ± 20 cm–1

3. Dao động dãn C – N (stretching; vừa  yếu)

• mạch thẳng cho băng ở vùng (1250-1020) cm–1
• thơm cho băng ở vùng
- 1340-1250 cm–1 (amin bậc I)
- 1350-1280 cm–1 (amin bậc II)
- 1360-1310 cm–1 (amin bậc III)
12
 4. Dao động dãn C=O (stretching)
Thường cho 2 băng mạnh vùng 1750-1650 cm–1

5. Dao động dãn -C-O (carbinol stretching)

- vùng 1200-1100 cm–1 (vừa đến mạnh)

6. Dao động dãn -O-H (các alk. có -OH)

- morphin base có băng 3282 cm–1

(R.M. Silverstein, Spectrometric Identification of Org. Cpds.,

6th Edt., John Wiley & Sons, Inc., 1998, pp 99-106.)
13
 Dao động dãn C=O (stretching) của

- caffein base: 1693, 1644 (đều < 1700 !)

- paracetamol: 1650

- cocain base: 1734, 1706 (đều > 1700 !)

- cocain.HCl: 1728, 1711 (và 2530: dãn N-H)

- heroin base: 1759, 1738 (đều > 1700 !)

- heroin.HCl: 1759, 1735 (và 2600: dãn N-H)

- lactose, morphin: không có

14
Nhóm chức băng hấp thụ (cm–1)

O-H 3400-3200

N-H 3300-3000

=C-H 3100-3000

CH=O 2700

C=O 1700 (mạnh)

C=C 1680-1600

benzen 1600

C–O 1260-1000

benzen 900-650 (mạnh, đặc hiệu)

15
 alkaloid -XH C=O C–O & khác
1447, 1366, 1230,
heroin base 1759, 1738
1211, 1192, 1052
1444, 1369, 1244,
heroin. HCl 2600 (-NH) 1759, 1735
1198, 1176, 1155
1272, 1253, 1106
cocain base 1734, 1706
1106, 1035
1265, 1230, 1105
cocain. HCl 2538 (-NH) 1729, 1712
1071, 1025
3182, 1471 1442, 1241, 1117,
morphin base (-OH) 1086, 942, 800
1648, 1503, 1474,
morphin. HCl 3367 (-OH)
1315, 1065, 940

16
 updated 21-9-2012

hợp chất -XH C=O khác

caffein pure 1693, 1644 1547, 1237, 758, 743

caffein/heroin 1698, 1656 1550, 1230, 764, 745

3321 (-NH)
1561, 1505, 1433,
paracetamol 1609 (-NH) 1650
1258, 1224
3108 (-OH)
1140, 1114, 1070,
lactose 3260 (-OH)
1018, 987, 875

17
 Phổ IR của vài alkaloid
O Me
HO CH3 C O N Me

O O Me

N Me N Me
CH3 C O Me N
HO
O Me

1 2 3

morphin (1) heroin (2) conessin (3)

-OH 3367 không không

>C=O không 1738, 1759 không

>C-O 1086, 1117, 1241 1211, 1230 không

18
Các băng / IR (cm-1) của caffein và các sản phẩm có caffein

 của caffein Trà đen Trà xanh Cà phê

C=H 2860 2855 2853 2853

C–H 3100 3105 3105 3108

C=C 1645 1648 1652 1651

C=O 1690 1692 1696 1696

C–N 1240 1238 1237 1238

C=N 1590 1597 1595 1596

19
 Phổ IR (KBr) của conessin (không có oxy)

80

Me

N Me
60

Me

1329 889 799

Me
N 997
40
Me 1175
1456 1377
1433
1040

20

2760

2939

4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
20
• λmax thay đổi theo pH môi trường (alk. muối / alk. base)

• được ứng dụng trong định tính, định lượng.

• đa số alkaloid : λmax 250 – 310 nm.

• một số alkaloid có λmax trong vùng khả kiến:

λmax UV của một số alkaloid base
- berberin : 263 nm 345 nm.
- colchicin : 350 nm
- morphin : 285 ± 2 (pH 4); 298 ± 2 nm (pH 11)
- quinin : 281 ± 2 và 331 ± 2 nm
21
 λmax trong phổ UV của các PBA chlorid / EtOH
(Pavelka et Smékal, 1976; Chia et als., 1998)

coptisin 229 241 268 354 363 467

corysamin 230 240 268 344 352 455
palmatin 228 240 268 276 343 350 433
jatrorrhizin 228 241 267 352 440
berberin 230 267 344 352 432
berberubin 234 275 353 455
ψ-coptisin 220 231 266 289 317 346 380
ψ-palmatin 242 265 288 310 342 380
ψ-epiberberin 220 240 264 290 310 341 380
columbamin 206 225 265 345 (MeOH)
fissiain 206 230 282 337
22
4.5
HO MeO

4.0
morphin
pH 11

3.5

codein Phổ UV của

pH 4
3.0 - codein (pH 4)
- morphin (pH 4)
morphin
pH 4
2.5
- morphin (pH 11)
(bathochromic !!!)

2.0

200 220 240 260 280 300 320 340 nm 23

8.1. Tính kiềm của alkaloid
• pKa của alkaloid
8.2. Phản ứng với các thuốc thử chung
• tạo tủa vô định hình
• tạo tủa tinh thể
8.3. Phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu
• Một số phản ứng thông dụng

24
 COOH COOH

N (*) N (**)
Me H

kiềm mạnh kiềm yếu kiềm rất yếu acid yếu

nicotin; 2 N theobromin, theophyllin arecaidin*

alk. N-oxyd ĐA SỐ cafein, colchicin, codein, guvacin**

alk. N+ IV ricinin, piperin, isoguvacin

alkaloid + acid  muối tương ứng

alkaloid + muối kim loại nặng  muối phức 
alkaloid + “thuốc thử chung”  tủa hay màu
25
• Kiềm yếu  trung tính Colchicin, Caffein
• Kiềm mạnh (pKa lớn) Atropin, Quinin
• Lưỡng tính
- phenolic Morphin
- carboxylic Narcein

Tính kiềm của alkaloid

• R2-NH > R-NH2 > R3-N
• vòng no > vòng thơm.

26
alk có tính… khả năng tạo muối với acid HX

…kiềm mạnh Rất dễ tạo muối bền [AlkH+ X−]

Alk muối kém bền, dễ trở lại dạng base:

…kiềm rất yếu
Alk + HX  [AlkH+ X−]   Alk

alk càng kiềm mạnh  alk.muối càng bền

27
• Alkaloid base có tính kiềm yếu hơn các kiềm vô cơ.

[alk muối] sẽ  [alk base] bởi kiềm vô cơ

(Na2CO3, amoniac, M(OH)n

[alk.H]+.X– + OH– [alk] + (X–/H2O)

• Nếu alkaloid có 2 Nitơ (2 chức base) :

- cả 2 N đều có tính kiềm: có thể tạo 2 loại muối.
Ví dụ : Quinin  Q.HCl và Q.2HCl
- Chỉ 1 N có tính kiềm: chỉ có thể tạo 1 loại muối.
Ví dụ : Strychnin  (Str)2 H2SO4
28
 Phương trình Henderson – Hasselbalch:
Ka
[alk. muối]+ + H2O [alk. base] + H3O+

[base]
pH = pKa + log
[acid]

[alk. base]
pH = pKa + log
[alk. muối]

ở pH = pKa + 3 : > 99.9% ở dạng alkaloid base

ở pH = pKa + 2 : > 99% ở dạng alkaloid base

ở pH = pKa – 3 : > 99.9% ở dạng alkaloid muối

ở pH = pKa – 2 : > 99% ở dạng alkaloid muối
29
alkaloid % 99% 99%
100%  
 ~90%
~75%


50% pH

 1%
1%
~25%
~10%
0%   pH

(pKa – 2) pKa (pKa + 2)

~ 99% là 50% là alk. muối ~ 99% là

alk. muối 50% là alk. base alk. base

30
 nếu SKLM 1 alkaloid ở pH # pKa thì :
# 50% mẫu ở dạng alk. base (kém phân cực; Rf cao)
# 50% mẫu ở dạng alk. muối (phân cực hơn; Rf thấp)

vết bị kéo dài, có thể tách thành 2 nhóm vết

cần thêm kiềm đến pH ≈ (pKa + 2)

để 99% alk ở dạng base (kém phân cực; Rf cao)

31
 SKLM alkaloid / Si-gel NP
với pha động có pH ≈ pKa

alk.base, kém phân cực hơn, bị kéo vệt.

alk.muối, phân cực hơn, vết gọn hơn.

Ngoài “độ phân cực” của pha động,

cần chú ý đến pH khi SKLM alkaloid !
32
 pH 3 4 5 6 pH 7

papaverin HCl 5

codein phosphat 5.5

eserin sulfat 6
4
eserin salicylat 6.5

ephedrin HCl
5
caffein base 7

quinin sulfat
5.5
quinin HCl
33
 tủa vô định hình tủa tinh thể
• Valse-Mayer • Dragendorff
- AuCl3, PtCl3
• Bouchardat • acid tannic
• Bertrand (silico-tungstic) • acid picric (Hager)

• th’. thử Marmé

Reineckat (CdI2-KI)

Scheibler (ac. phospho-tungstic) - acid picrolinic

Sonnenschein (ac. phospho-molybdic) - acid styphnic

th.thử Bouchardat = th.thử Wagner (Iod / KI)

34
 thuốc thử thành phần tạo tủa vô định hình màu

Bouchardat KI + I2 nâu, nâu đỏ

Dragendorff KI + BiI3 đỏ cam (SKG, SKLM...)

Marmé KI + CdI2 trắng  vàng (tinh thể)

Valse-Mayer KI + HgI2 bông trắng  vàng ngà

Bertrand acid silicotungstic trắng  trắng ngà

Tannin acid tannic trắng (tan / cồn, AcOH, NH3)

35
(+) (++) (+++)
36
 thuốc thử thành phần tủa vô định hình màu

• hồng, tan / aceton 50%

ammoni tetrasulfocyanid (định lượng đo màu)

Reineckat
diamin chromat III • đôi khi kết tinh ở dạng khá
đặc trưng, mp rõ (định danh)

Scheibler acid phospho-tungstic trắng

Sonnenchein acid phospho-molybdic trắng

Cobalt thiocyanat Co(SCN)2 xanh

37
• Độ nhạy thay đổi tùy loại thuốc thử, tùy loại alkaloid

• Th. thử kém bền / kiềm (ddịch thử: tr.tính  acid nhẹ)

• Tủa có thể tan lại trong

- thuốc thử thừa, trong MeOH, EtOH : Marmé

- thuốc thử thừa, trong MeOH, EtOH, AcOH : Mayer

- MeOH, EtOH, AcOH, NH4OH : acid tannic

• Khi tủa có thành phần ổn định

( định lượng bằng ph.pháp cân gián tiếp) : Bertrand

38
 TÀI LIỆU VỀ DRAGENDORFF

Journal of Chromatography Library, Vol 23A, 1983

39
 TÀI LIỆU VỀ DRAGENDORFF

Farnsworth: the minimum structural features for non-alks to

give a (+) Dragendorff reaction are conjugated carbonyl
(ketone or aldehyde) or lactone functions.

The minimum structural requirement for a (+) Dragendorff

reaction is a hydroxyl group and an isolated double bond.

Anderson: the sensitivity for such compounds increased if the

plate was sprayed with H2SO4 or NaNO2 after spraying with
Dragendorff reagent.

Journal of Chromatography Library, Vol 23A, 1983

40
 TÀI LIỆU VỀ DRAGENDORFF

(Farnsworth):
Cấu trúc tối thiểu để 1 non-alkaloid (+) với Dragendorff:
- hoặc có nhóm chức –OH + 1 nối đôi riêng biệt
- hoặc có nhóm chức carbonyl (aldehyd, ceton, lacton)

Anderson, 1977, Planta Medica 32(6), 125-129:

Để tăng độ nhạy của thuốc thử Dragendorff:

Phun chồng thêm H2SO4 hay NaNO2

Journal of Chromatography Library, Vol 23A, 1983

41
tách thành 3 slide kế

42
 CÁC NON-ALKALOID (+) VỚI DRAGENDORFF (1)

nhóm hợp chất

kawain, dihydrokawain,
α-pyron methysticin, dihydromethysticin,
yangonin, desmethoxyyangonin,

coumarin, bishydro-coumarin, scopoletin, psoralen, khellin,

coumarin bergapten, xanthotoxin, imperatorin, isopimpinellin,
ethyl-bis-(4-hydroxycoumarinyl) acetat,

γ-pyron maltol, acid kojic, kojic acid methyl ether

chalcon chalcon, β-methoxychalcon

Journal of Chromatography Library, Vol 23A, 1983

43
 CÁC NON-ALKALOID (+) VỚI DRAGENDORFF (2)

nhóm Hợp chất

Cardenolid digitoxin, ouabain

Steroid cholesterol, sitosterol, stigmasterol

β-amyrin, acid oleanolic, lupeol, acid quillaic,

Triterpenoid acid glycyrrhetinic. Friedelanol và cholestan (+)
sau khi phun thêm dung dịch NaNO2.

PEGs các Polyethylen glycol.

(+): mức phát hiện < 10 µg

44
 CÁC NON-ALKALOID (+) VỚI DRAGENDORFF (3)

• Cinnamaldehyd, amyl-cinnamaldehyd, cinnamyl alcohol, menadiol,

• Benzyl acetat, camphor, eucalyptol, eugenol, hydroxy citronellal,

Salicylic acid, salicylat (methyl, menthyl, phenyl), acrolein.

• Cholin, phosphatidylcholin, ninhydrin, piperonal, 2-phenyl ethanol.

• Geraniol, resorcinol, orcinol, anethol và thymol sẽ (+) sau khi

phun thêm dung dịch NaNO2.

• Acid acetylsalicylic, acid cinnamic, guaiacol, quinon, hydroquinon,

phloroglucinol, terpineol, và vanillin sẽ (+) sau 24 giờ

Journal of Chromatography Library, Vol 23A, 1983

45
• Amphetamin
• Benzocain
• Cafein
• Ergometrin
• Reserpin

46
47
48
 thuốc thử thành phần tạo tủa tinh thể

Vàng clorid AuCl3. HCl

• có màu thay đổi
tùy loại alkaloid
Platin clorid PtCl4. 2HCl

acid picric 2,4,6-trinitrophenol

• có màu vàng  đỏ cam
acid styphnic 2,4,6-trinitroresorcin • có hình dạng đặc trưng
• có điểm chảy xác định
acid picrolonic Δ’ của p-nitrobenzen

49
 NO 2 NO 2 O
NO 2
NO 2 OH NO 2 OH NO 2 N
N Me
NO 2 HO NO 2

acid picric acid styphnic acid picrolonic

+ alkaloid

- màu vàng  đỏ cam

- hình dạng đặc trưng định danh
tinh thể có
alkaloid
- điểm chảy xác định
50
alkaloid Valse-Mayer Bouchardat Dragendorff

quinin 8 ppm 10 ppm

morphin 400 ppm

caffein 100 ppm 1700 ppm

51
 Thuốc thử độ nhạy (quinin)

• Scheibler (Phosphotungstic) 10 ppm

• Valse-Mayer (HI – HgI2) 10 ppm

• Bouchardat (KI – I2) 12.5 ppm

Zn ammonium sulfocyanid 20 ppm

Hager (acid picric) 25 ppm

Sonnenchein (Phosphomolybdic) 30 ppm

Thalleioquin 50 ppm

52
 Thuốc thử Morphin (μg) Heroin (μg) Codein (μg)

Valse-Mayer 0.05 0.025

Marmé 0.01 0.01
Bouchardat 0.10 0.05
Dragendorff 0.01 0.005
HgCl2 0.10 0.10 0.25
PtCl2 0.25
Kali chromat 0.50 0.10

Micro-identification of the Opium Alkaloids

E. G. C. Clarke (UNODC, 1955) 53
 Alkaloid Dragendorff Zaffaroni *

Morphin 50 μg 10 μg

Apomorphin 20 μg 10 μg

Papaverin, Thebain
10 μg 10 μg
Codein, Heroin, Dionin

Narcotin 10 μg 20 μg

Narcein (kém nhạy) 50 μg 50 μg

*(thuốc thử Zaffaroni = KI.PtI2 = KIP)

54
 thường kết hợp với SKLM // alkaloid chuẩn

thuốc thử thành phần Alkaloid sẽ cho màu

Erdmann acid sulfo-nitric Conessin vàng  xanh  lục

Frohde acid sulfo-molybdic Morphin tím

Mandelin acid sulfo-vanadic Strychnin tím xanh  đỏ

Merke acid sulfo-selenic Codein xanh ngọc

Marquis sulfo-formol Morphin tím đỏ

Wasicky sulfo-PDAB Indol xanh tím đến đỏ

cacothelin acid nitric đđ. Brucin đỏ máu

55
• Tác nhân: các chất có tính oxy-hóa mạnh

(acid sulfuric đđ., acid nitric đđ., sulfochromic...)

• Môi trường thực hiện : thường là khan.

• Cho màu khá chuyên biệt, giúp định danh alkaloid

• Màu thường kém bền (quan sát nhanh)

• Màu thay đổi tùy các điều kiện phản ứng

(tO, pH và nhất là độ tinh khiết của mẫu alkaloid).

56
57
9.1. Nguyên tắc chung

Alkaloid là các base yếu, trong cây có thể ở dạng

- alk. muối với acid hữu cơ, vô cơ (dễ chuyển dạng)
- alk. phức hợp bền với tannin (khó chuyển dạng)

• Nếu muốn chiết dưới dạng alk. muối :

Chiết trực tiếp [Alk.H]+.X– với dung môi thích hợp (ROH)

• Nếu muốn chiết dưới dạng alk. base :

cần dùng kiềm thích hợp để tạo phản ứng :

[alk.H]+.X– + OH– [alk] + (X–/H2O)

58
59
1B 1A 2

60
9.2. Các phương pháp chiết alkaloid

1A. Chiết dạng alk. muối nguyên thủy trong cây

- làm ẩm bột dược liệu với vừa đủ dung môi chiết
- chiết bằng dung môi (cồn / cồn nước)
- cô thu hồi bớt cồn. Tủa tạp bằng acid loãng.
- kiềm hóa dịch acid, lắc với dmhcơ kém phân cực

áp dụng cho sản xuất quy mô trung bình  lớn.

Khi chiết bằng [cồn + nước]; thường dùng MeOH, EtOH.

61
62
1B. Chiết dạng alkaloid muối mới sinh
- làm ẩm bột dược liệu với vừa đủ dung môi chiết
- chiết bằng dung môi (cồn acid / nước acid)
- Trung tính hoá, cô bớt cồn.
- tinh chế (loại tạp + chuyển dạng); kết tinh

áp dụng cho sản xuất quy mô trung bình  lớn.

Khi chiết bằng [cồn + acid]:

thường dùng acid H2SO4, HCl, tartric, AcOH.
(tạo alkaloid sulfat, hydrochlorid, tartrat, acetat)
63
1B
 Ban đầu :

• cồn - acid tartric

• loại tạp (tủa) bằng nước

• loại tạp (tan) bằng Et2O

• kiềm là dd. Na2CO3

• dmhc là Et2O, CHCl3

65
• Nếu dùng dư acid có thể tạo muối kém tan hơn.
Ví dụ : Khi chiết berberin sulfat từ bột Vàng đắng:
- nếu dùng H2SO4 rất loãng (vài ‰; pH 5,5 - 6,0)
sẽ tạo berberin sulfat, độ tan trong nước 33‰
- nếu dùng H2SO4 đậm đặc hơn (vài %; pH  3)
sẽ tạo berberin bisulfat độ tan trong nước 10‰.

• Với phức hợp alk.-tanin, phải dùng acid vô cơ nóng

(H2SO4, HCl nóng) mới có thể tạo alk. sulfat, alk.HCl
66
2. Chiết dạng alkaloid base

- làm ẩm bột dược liệu vừa đủ với kiềm thích hợp *

- chiết bằng dmôi hcơ kém ph.cực (DCM, Cf, Bz…)
- thu hồi dung môi; tinh chế (loại tạp); kết tinh

• Khi làm ẩm, tránh để dược liệu “ướt nhẹp”

• tránh đun nóng (cô …) dịch alk. base (không bền).
• thích hợp khi thao tác nhanh (kiểm nghiệm).
• tránh sử dụng để chiết ngấm kiệt lâu / kiềm.

67
68
Ph.pháp chiết bằng dung môi hữu cơ / kiềm có

• Ưu điểm
- áp dụng phổ biến với hầu hết alkaloid.
- có tính chọn lọc, alk. base thu được khá sạch.
- thường ít khi tạo nhũ (như khi chiết = ROH)
- rất thích hợp cho kiểm nghiệm

• Nhược điểm
- tốn nhiều dung môi, dung môi độc hại.
- khó áp dụng ở quy mô lớn (thiết bị, thời gian).
- bã sau khi chiết có thể gây ô nhiễm môi trường.
- không thích hợp khi dược liệu có nhiều chất béo
69
2a. Chiết alkaloid base nói chung.

Chọn dung môi chiết:

- quy mô lớn dùng xăng công nghiệp, dầu hôi, Cf, DCM, CO2

- quy mô nhỏ (labo) dùng Cf, DCM, Bz, Et2O, EP, EtOAc…

Dụng cụ: Bình ngấm kiệt, bộ đun hồi lưu, Soxhlet, bộ SFE.

Lấy riêng lớp d.môi hữu cơ, cô  alk. base + tạp kpc.

có thể tinh chế tiếp bằng cách  alk. muối rồi lại

 alk. base Σ sạch hơn.

70
2b. Chiết dạng alk. base bay hơi (nicotin...)

- làm ẩm bột dược liệu vừa đủ với kiềm thích hợp

- chiết bằng phương pháp cất kéo theo hơi nước

- thường dùng cho định tính, định lượng ngay.

- Sản phẩm khá tinh khiết; có khi là 1 chất duy nhất.

- Ph. pháp này dễ thực hiện, rẻ tiền, sản phẩm sạch;

- có tính chọn lọc cao nhưng không phổ biến.

71
 cất kéo alkaloid base theo hơi nước

nhiệt kế và
bộ tiếp nước

hơi nước sôi Alk base

ngưng tụ

H+
loãng
dược liệu + kiềm

72
2c. Chiết các alkaloid base thăng hoa

- làm ẩm dược liệu vừa đủ với kiềm thích hợp

- làm khô dược liệu, đun bằng nhiệt khô
- thu tinh thể alk. base vừa thăng hoa, tinh chế, kết tinh
- Phương pháp này dễ thực hiện, rẻ tiền, sản phẩm khá
tinh khiết và có tính chọn lọc cao nhưng không phổ biến.

Ví dụ : Chiết Cafein từ bột Trà cám, trà vụn.

73
thăng hoa alkaloid base (cafein, ephedrin...)

ống ly tâm
chứa nước đá

thăng hoa

74
• Chú ý (1)
- các alk base mạnh (N IV; pyridin; 2 Nitơ)
- các phức bền (alkaloid + tannin)
Cần dùng kiềm mạnh (NaOH, CaO...)
mới có thể giải phóng ra alk. base.

• Chú ý (2)
- các alk. base quá yếu (cafein, reserpin…)
có thể tan / dmhc kpc (bình thường)
/ ROH (bất thường)
Lưu ý tránh loại bỏ nhầm dịch ROH có chứa alk. base.
75
• Chú ý (3)
- morphin (& alkaloid có OH-phenol) phản ứng với kiềm
tạo morphin base dạng phenolat (tan / nước)
Morphin.meconat + Ca(OH)2  Ca.morphinat tan / nước

- Nếu cho NH4X vào, môi trường sẽ có tính kiềm, và

Ca.morphinat + NH4X  morphin  + NH4OH + CaX2
(morphin base tủa trong môi trường kiềm)

76
• Chú ý (4)

Khi alk. toàn phần trong cây gồm nhiều alk. có độ kiềm

khác nhau (kiềm rất yếu, yếu, trung bình, mạnh)

Nếu dùng [dmhc kém phân cực] + [kiềm mạnh dần]

có thể chiết riêng từng nhóm alk. có tính kiềm tăng dần.

Tránh dùng kiềm mạnh ngay từ đầu vì có thể làm

biến đổi cấu trúc của những alk. có tính kiềm yếu.

77
• Chú ý (5)
Khi alk. toàn phần trong cây gồm nhiều alk. có độ phân cực
khác nhau (phân cực kém, trung bình, mạnh)

Nếu dùng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần, có thể
chiết riêng từng nhóm alkaloid có độ phân cực tăng dần.

• Chú ý (6)

Nếu có chất béo: nên loại bỏ chất béo sớm (vì chất béo +
kiềm mạnh  savon; ảnh hưởng đến độ tan của alk. base).

78
• Chú ý (7): về dung môi chiết xuất

* Dung môi có thể phá hủy / biến đổi alk. base

- do tạp (peroxyd, aldehyd…) lẫn / d.môi hữu cơ
- do bản thân dung môi hữu cơ tinh khiết.

* Dung môi [kiềm mạnh + thời gian dài] có thể :

- phá vỡ dị vòng N, phá vỡ cấu trúc của alk.
- thủy phân các ester alk., các glyco-alkaloid.
- racemat hóa 1 số alk (hyoscyamin, scopolamin).
Các quá trình này được gia tốc bởi nhiệt độ.
79
dung môi Khả năng tạo tạp

- berberin, palmatin  berb-, palmatin-cloroform.

CHCl3 - reserpin  3,4,(5,6)-di(tetra)hydro-reserpin.
- strychnin  ψ-strychnin; N-oxyd-strychnin.

CH2Cl2 - strychnin  dichloromethyl strychnin (N+ IV)

aceton  artefact; với NH3/SKC  sản phẩm trùng hợp

tạp / Et2O - peroxyd, aldehyd sẽ oxy-hóa ephedrin (tạo tạp)

- ergotamin  epimer hóa

EtOH
- ψ-strychnin  methyl ψ-strychnin;
80
Thêm nước lạnh vào dịch chiết cồn.
Tiếp tục để lạnh qua đêm.
Các tạp kiểu chlorophyll sẽ tủa và được tách riêng.

Thêm (≈ 5%) Celite (Kieselguhr) vào dịch chiết cồn-nước.

Khuấy đều, để lắng rồi lọc.
Các tạp phân cực sẽ bám vào Celite và được tách riêng.
81
Thêm C* (n‰) vào dịch chiết cồn-nước nguội.
Khuấy đều, đun nóng rồi lọc nóng.
Các tạp kiểu chlorophyll bám vào C* và được tách riêng.

Cần thăm dò tỷ lệ C* cần dùng để loại bỏ tối đa tạp và

mất tối thiểu alkaloid (kiểm tra bằng SKLM).

82
• Thêm Chì acetat kiềm hoặc trung tính (C ≈ 10-30%)
vào dịch chiết cồn-nước (độ cồn < 25%).
• Khuấy đều, để lắng, gạn rồi lọc thu dịch lọc.
• Kết tủa chì thừa trong dịch lọc bằng Na2SO4 15%
• Lọc bỏ tủa PbSO4
• Các tạp polyphenol tạo tủa phức với chì, được tách riêng

• Cần chú ý: Chì là kim loại rất độc.

Có thể mất 1 phần alkaloid

83
• Acid hóa dịch chiết về pH < (pKa – 2)
Lắc và loại bỏ phần tan trong d.môi hữu cơ kém ph.cực.
• Kiềm hóa dịch chiết về pH > (pKa + 2)
Chiết lấy alk. base bằng dung môi hữu cơ kém phân cực.
Cô thu hồi dmhcơ và thu cắn alk base.

Lưu ý: có thể mất một số alk có tính kiềm yếu, rất yếu.

84
(Supercritical Fluid Extraction)

Dung môi:
CO2 siêu tới hạn
(t > 31oC; P > 73 atm)

85
Mục đích phân lập (isolation)
- thu được từng alkaloid riêng biệt, tinh khiết
- không phải artefact

Mở đầu
- hỗn hợp alk. Σ thường gồm rất nhiều chất cấu trúc #.
- vài trường hợp dễ phân lập, không cần đến sắc ký
(% lớn, thăng hoa, cất kéo, kết tủa, kết tinh ph.đoạn)
- đa số trường hợp phải qua sắc ký.

vì [alk. base] kém phân cực hơn [alk. muối]

 thường phân lập alk. base / SKC hấp phụ.
86
11.1. Dựa vào độ tan, sự kết tinh
11.2. Dựa vào pKa (tính base, độ kiềm)
11.3. Dựa vào độ phân cực (của alkaloid base)
11.4. Phân lập bằng phản ứng tạo dẫn chất
11.5. Phân lập bằng cách tạo tủa phức với thuốc thử
11.6. Phân lập bằng sắc ký cột
11.7. Phân lập bằng SKG & SKLM chế hóa
11.8. Phân lập bằng HPLC, MPLC chế hóa
11.9. Phân lập bằng kỹ thuật khác (CE, DCCC, HSCCC...)
87
 - áp dụng chủ yếu để tách các nhóm alkaloid
- đôi khi có thể tách được từng alkaloid riêng biệt.

Ví dụ 1: Tách riêng strychnin và brucin

- chiết alk. toàn phần từ hạt Mã tiền bằng H2SO4 loãng.
- kiềm hóa bằng Ca(OH)2 lọc lấy tủa, phơi khô
- được hỗn hợp alk. base Σ. [strychnin + brucin] # 90%
- chiết hỗn hợp alkaloid base Σ này với cồn 20%
phần tan / cồn 20%: # brucin base
phần không tan / cồn 20%: # strychnin base.
88
 Ví dụ 2: Phân lập conessin

- Chiết alkaloid Σ từ vỏ thân Mức hoa trắng = H2SO4 loãng

- Kiềm hóa, lọc, làm khô tủa alk. base Σ [conessin + khác]
- Hòa hỗn hợp alk. base Σ trong dung dịch acid oxalic.
- các alkaloid khác* tạo muối oxalat tan trong dung dịch
- conessin oxalat không tan, được lọc rồi tinh chế riêng.

89
Ví dụ 3: Phân lập Atropin & Hyoscyamin

90
 berberin + alk. khác
+ –
Bột Vàng đắng tinh thể B Cl

H2SO4 0.2% để nguội, để lạnh

33‰ dung dịch AlknSO4 dịch B+Cl– tkh / EtOH

Ca(OH)2 pH 11, lọc C* / EtOH Δ lọc nóng

+ NaCl
+ – + –
50‰ dịch “tạp” + B OH tủa B Cl thô < 2‰
HCl pH 3
alk. khác: tan / acid loãng

91
 Lưu ý: ... kết tinh phân đoạn ...

• áp dụng với các hỗn hợp alkaloid không quá phức tạp
(vài alk, trong đó có 1 alk chính, hàm lượng cao)
• có thể “thử và sai” để chọn d.môi kết tinh phù hợp,
nhưng thường thì có thể sơ bộ định hướng:
a. với các alk. kém phân cực: nên chọn MeOH, EtOAc,
CHCl3, DCM, n-hexan hoặc tổ hợp 2/các dung môi này.
b. với các alkaloid phân cực:
nên chọn MeOH, MeCN hoặc tổ hợp 2 dung môi này.
92
Cách tiến hành kết tinh phân đoạn:

- hòa tan mẫu vào dung môi đã chọn (đun nóng nếu cần)

- có thể loại tạp bằng n‰ than hoạt, đun, lọc nóng,

- để nguội rồi để lạnh dịch lọc cho d.môi bay hơi dần

- alkaloid kết tinh sẽ được lọc và rửa bằng dung môi lạnh

- kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM (với vài hệ dung môi,

vài thuốc thử phát hiện khác nhau), trên HPLC…

93
• Với dược liệu chứa nhiều alk. có tính kiềm khác nhau
 có thể tách riêng chúng dựa vào pH của dung dịch.

• Lưu ý: trong môi trường acid, các alkaloid kiềm yếu

vẫn có thể tan được trong d.môi hữu cơ kém phân cực

• Các alk. N+ (bậc 4): dạng base lại dễ tan trong nước!
vài dạng muối lại khó tan / nước!

94
Kết tủa alk base ở các pH kiềm khác nhau.
• hòa alk. base Σ vào acid loãng, lọc lấy dịch alk. muối.

• kiềm hóa từ từ đến ở pH hơi kiềm (ví dụ pH 7 – 7.5),

lọc lấy tủa 1 (alkaloid có tính kiềm yếu nhất).
• kiềm hóa tiếp đến pH trung bình (ví dụ pH 8 – 9),
lọc lấy tủa 2 (alkaloid có tính kiềm trung bình).
• kiềm hóa tối đa (ví dụ pH 12 – 13) đến khi hết tủa
lọc lấy tủa 3 (alkaloid có tính kiềm mạnh nhất).

95
96
Lưu ý:

Thay vì lọc lấy tủa (alk. base vừa được giải phóng),
có thể chiết alk. base này bằng 1 dung môi hữu cơ.

Các alkaloid nào còn ở dạng muối (do pKa quá lớn)
sẽ không tan theo dung môi hữu cơ này.

97
98
Ví dụ:
Hòa cắn alk. base ∑ của rễ Ba gạc / HCl loãng.

- chỉnh về pH 6-7, dd. sẽ hơi đục, chiết (lần 1) = CHCl3

 yohimbin, rererpin, rescinamin (alk kiềm yếu nhất).

- chỉnh về pH 8-9, dd. nước lại đục, chiết (lần 2) = CHCl3

 ajmalin, ajmalicin (alkaloid kiềm mạnh hơn).

- chỉnh về pH 12-13, dd. nước lại đục, chiết (lần 3) = CHCl3

 serpentin, alstonin (alk. NIV, alkaloid kiềm mạnh 1’)

99
 Acid hóa các alk. base bằng các acid mạnh dần

• hỗn hợp alk. base / d. môi hữu cơ được lắc phân bố

tuần tự với các dd. acid có pH giảm dần.
• tách và thu riêng biệt các lớp acid (1, 2, 3...)
• kiềm hóa riêng biệt từng ph. đoạn này (đến pH 10-11)
• lắc riêng biệt từng ph. đoạn này với d. môi hữu cơ
 thu từng alkaloid base riêng biệt.
• Alk. có tính base yếu nhất (pKa bé 1’) sẽ ra sau cùng

100
101
• chiết và chuyển alk. muối trong dược liệu  alk. base.
• hòa / [MeOH – nước] ở tỷ lệ thích hợp, cô bớt dung môi
• lắc tuần tự với n6, Bz, Cf, EtOAc thu 4 ph.đoạn khác nhau
• bốc hơi 4 phân đoạn trên, thu 4 loại cắn alk. base
• phân lập tiếp bằng phương pháp khác; thường dùng

- sắc ký cột  từng alk. base tinh khiết.

- kết tinh ph.đoạn  từng alk. muối tinh khiết.

102
 103

độ phân cực tăng dần

 + HCl alk. bậc II, III (tan)
alk. bậc II, III, IV
alk. bậc IV (tủa)

OH–

alk. bậc IV (tan) alk. bậc II,III (tủa)

acetyl-hóa

alk. bậc III (―) alk. bậc II–Ac (+)

+ HCl loãng + HCl loãng

alk.bậc III.HCl (tan) alk. bậc II–Ac (tủa)

đun nóng (deacetyl)

alk. bậc II
104
105
Các kỹ thuật thực hiện
A. Cột cổ điển (CC)
a. hấp phụ (si-gel NP, oxyt nhôm)
b. phân bố (cellulose, polyamid, si-gel RP, Diaion HP-20)
c. rây phân tử (Sephadex LH-20)
d. trao đổi ion
B. Cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC)
C. Cột SPE (Solid Phase Extraction, chiết phase rắn)

106
 A. Phân lập bằng SKC cổ điển

a. Dùng sắc ký cột hấp phụ

Thường dùng cột Si-gel hoặc Nhôm oxyd để phân lập
1 hỗn hợp alkaloid base toàn phần thành các
- phân đoạn đơn giản hơn (VLC)
- alk. base tinh khiết riêng biệt (SKC).
Silica gel: có thể phải giảm hoạt (thêm nước) ***
hoặc tẩm đệm (phosphat…) ***
Nhôm oxyd: nên sử dụng Nhôm oxyd-base.
(đừng hoạt hóa cao độ)

107
 A. Phân lập bằng SKC cổ điển

b. Dùng sắc ký cột phân bố

- Trước đây: dùng cột Cellulose vi tinh thể; cột Polyamid.

- Hiện nay: thường dùng Si-gel RP-18; Diaion HP-20.

- Si-gel RP-18 chủ yếu dùng cho HPLC và MPLC.

- Diaion HP-20 chủ yếu dùng để tách 1 hỗn hợp

đa thành phần  các phân đoạn đơn giản hơn

(mục đích # VLC; tham khảo chương trình DL-3)

108
 A. Phân lập bằng SKC cổ điển

c. Dùng sắc ký cột rây phân tử

- Thường dùng cột Sephadex G-25 hoặc Sephadex LH-20

- Mẫu thử là alkaloid muối toàn phần / nước hay MeOH.
V mẫu khoảng 5% - 10% V của cột gel Sephadex.
- Dung môi: thường là nước (cho cột Sephadex G)
hoặc MeOH – CHCl3 (cho Sephadex LH-20)
- Các alkaloid có MW lớn sẽ ra trước, MW nhỏ sẽ ra sau
- Thường tiến hành phối hợp với SKC hấp phụ

109
 A. Phân lập bằng SKC cổ điển

d. Dùng sắc ký cột trao đổi ion

• Thường dùng cột cationit (nhựa Re – H+).

• Mẫu thử là alkaloid muối toàn phần
• Dung môi : thường dùng
- [cồn – kiềm] (vd EtOH chứa 5% amoniac).
- dãy dung môi có pH tăng dần (gradient pH)
để phân lập các alkaloid có tính kiềm khác nhau.

110
Phân lập alkaloid bằng SKC trao đổi ion gradient pH

Thực hiện trên cột cationit, trình tự như sau

- tạo alkaloid muối (lấy alk. base + acid loãng, lọc)

- cho dịch alk. muối qua cột cationit (Re–H+) đến bão hòa.

- khai triển cột bằng [cồn + NH4OH] có pH tăng dần

các alk. có tính kiềm ≠ sẽ tuần tự ra khỏi cột.

111
B. Phân lập bằng cột VLC (Vacuum Liquid Chromato)

Tham khảo Phương pháp nghiên cứu dược liệu (DL-3)

112
C. Phân lập bằng cột SPE (Solid Phase Extraction)
Thường dùng với mục đích
- tinh chế lượng mẫu nhỏ (< 100 mg) chứa ít tạp.
- chuẩn bị mẫu cho HPLC, MPLC, GC.
- kiểm nghiệm
Với SPE: thường dùng các cartridge (# ống bơm tiêm)
chứa sẵn 100(0), 200(0), 500(0) mg silica gel (NP / RP).
Có thể khai triển cột SPE theo 2 cách
• loại tạp ra trước, mẫu ra sau
• giữ tạp trên cột, mẫu ra trước (tham khảo DL. 3)

113
 vùng không phun thuốc thử

vùng phun vùng phun

thuốc thử thuốc thử
(A)

(B)

(C)

cạo (A), (B), (C) (vùng không có th’.thử) để lấy alkaloid

114
 Để phân lập các hợp chất tự nhiên nói chung và alkaloid
nói riêng trên HPLC, MPLC có thể sử dụng các thiết bị
- bán điều chế (semi-pHPLC/MPLC)
- điều chế (pHPLC, pMPLC).

Quy mô nhỏ (10n mg), thường dùng để xác định cấu trúc
bằng MS, NMR...

115
• Kỹ thuật phân bố ngược dòng (DCCC, HSCCC...)
Droplet / High Speed (Counter-Current Chromatography)

• Kỹ thuật điện di mao quản (CE, Capillary Electrophoresis)

116
12.1. Trên vi phẫu (phản ứng hóa mô)

vi rửa bằng rồi + thuốc thử

Kết luận
phẫu cồn tartric BOUCHARDAT

 có protein / alkaloid.
1 không rửa có tủa nâu
(thử tiếp vi phẫu 2 và 3)

 có protein
2 có rửa vẫn có tủa nâu
( alkaloid ??? )

3 có rửa không còn tủa nâu  có alkaloid.

- alk. và protein đều cho tủa với th’ thử Bouchardat

- alk. tan / cồn tartric; protein không tan / cồn tartric.
117
12.2. Bằng phương pháp sắc ký

Mục đích
- có alkaloid ???
- có dược liệu A, B, C ???
- có alkaloid x, y, z ???
- hàm lượng x%, y%, z% ???

Các kỹ thuật thông dụng

- SKLM (TLC; HP-TLC; p-TLC)
- HPLC (LC-UV; LC-MS …)
118
12.2.1. Bằng SKLM
• Bản mỏng : Si-gel F254, RP-18 (Merck …)
• mẫu chấm : alk base ∑ (ít tạp) / CHCl3 (chấm vạch)
• dung môi : thường thêm kiềm (hữu cơ, vô cơ) yếu *
• phát hiện : UV 254 nm / Dragendorff / th’ thử khác

* Thêm kiềm đến pH # (pKa + 2)

 làm gọn vết alkaloid (tránh kéo vệt).
* Kỹ thuật thêm kiềm
- tẩm vào giấy bão hòa bình sắc ký.
- tẩm vào pha tĩnh.
- thêm vào pha động.
119
Hệ dung môi (2 – 3 thành phần)

phân cực kém phân cực tr.bình phân cực mạnh

EP, n-6, n-7 EtOAc n-BuOH
Tol, Bz, Et2O Me2CO i-PrOH
Cf, DCM AcCN EtOH, MeOH

Nguyên tắc chung: Dung môi // Mẫu thử (alkaloid base)

Hệ dung môi thường thêm kiềm yếu (pH modifiers)

- NH4OH (‰  %), dimethyl formamid (DMF)
- diethylamin, triethylamin (DEA, TEA)
120
Mẫu thử
- thường là alkaloid base (toàn phần, phân đoạn)
- mẫu được hòa trong Bz, Cf, DCM.
- nên chấm thành vạch (1 mm × 5-10 mm)
- mẫu cao hơn mức dung môi ~ 5-10 mm
- khai triển 1 lần, n lần; chiều khai triển: 

Phát hiện vết

- soi UV 254 (tắt quang) / 365 nm (phát quang)
- hơ hơi Iod (các alk. có Δ / cấu trúc)
- phun / nhúng thuốc thử Dragendorff **
- phun / nhúng thuốc thử đặc hiệu (ít sử dụng).
121
phát hiện hiện tượng

- tắt huỳnh quang rõ rệt với hầu hết alkaloid

UV 254 nm
- tắt huỳnh quang không rõ rệt với alk. tropan

- alk Ba gạc, Canhkina, Ipeca: x.dương, lục, tím

UV 365 nm
- Berberin, Colchicin, Sangunarin: h.quang vàng

- Với alk. purin & ephedrin: cần phun thêm

Dragendorff
d.dịch NaNO2 10% hay H2SO4 10% / cồn

Marquis - khá chuyên biệt với alk. / Opium

Van Urk - khá chuyên biệt với alk. / Ergot

122
phát hiện bằng hiện tượng; ghi chú

alk. tạo các vệt nâu, trắng, xanh dương

Kali Iodo-Platinat
trên nền xám xanh

(KI + I2 ) / HCl Thích hợp với alk. nhóm Purin (Cafein)

Iod / CHCl3 Thích hợp với Emetin, Cephaelin

Ninhydrin Thích hợp với alk./ Ephedra (& acid amin)

H2SO4 10%/ EtOH Thích hợp với alk./ Cinchona

123
 Si-gel NP Dung môi phân cực

+ +

Ph
ĩn h

ađ
at

ộn
Ph

g
Si-gel RP – – D.môi
kém ph. cực

– +

Alk. base Mẫu thử Alk. muối

124
 Si-gel NP Dung môi phân cực

+ +

Ph
h
t ĩn

ađ
a

ộn
Ph

g
Si-gel RP – – D.môi
kém ph. cực

– +

Alk. base Mẫu thử Alk. muối

125
Chú ý các hiện tượng
- chậm hiện màu; đổi màu (biến chất …)
- dương tính giả (chất khác alkaloid)
- âm tính giả (dưới giới hạn phát hiện, chiết sai, tạp …)
- các tạp (–) với Dragendorff
(Drag.) (VS)

để kết luận tinh khiết : vài thuốc thử

Pure ??? No !!!

126
 CHCl3 - Me2CO (10:3) CHCl3 - MeOH (12:1)

Sắc kí đồ các alkaloid phân lập từ rễ cây TNHC (2012)

(1) cao alkaloid toàn phần, (2) cao n-hexan, (12) Cao lá SFE.
(3) AR1, (4) AL4, (5) AL5, (6) AL6, (7) AR8, (8) AL10, (9) AL11,
(10) crinamidin, (11) 6-OH-crinamidin.

127
 Các hệ dung môi thông dụng trong SKLM alkaloid
1. Tham khảo 20 hệ dung môi trong tài liệu
H. Wagner, Plant Drug Analysis - A TLC Atlas (1996), p.3-51.

có 10 hệ d.môi chứa kiềm (NH3 / DEA)

04 hệ d.môi trung tính
06 hệ d.môi chứa acid (ForOH / AcOH)

Đáng chú ý : Toluen – EtOAc – DEA (7 : 2 : 1)

128
2. Tham khảo bộ dung môi SKLM alkaloid của D. Waldi
(Waldi D., A systematic analysis of alkaloids by TLC,
J. Chromatography A, Vol. 6 (1961), pp. 61-73; Deutsch).

hệ d.môi c-hexan benzen CHCl3 EtOAc aceton DEA

S1 9 1

S2 5 4 1

S3 7 2 1

S4 9 1

S5 5 4 1

129
12.2.2. Bằng SKG

Đã từng thông dụng vào thập niên 1960’s

D. Waldi (1959) sắc ký giấy các alkaloid / Opium.
[Archiv. der Pharmazie, 292, p. 206]
• tẩm 4 tờ Whatman I với [formamid + aceton], phơi khô.
• chấm alk. chuẩn và alkaloid toàn phần của mẫu Opium
nghiên cứu lên 4 tờ W-1 này.
• sắc ký 4 tờ W-1 với 4 hệ dung môi [c-hexan – CHCl3]
có (x : y) thay đổi; có thêm kiềm [formamid + DEA].
• So sánh các giá trị Rfs  định danh các alk./ opium
130
12.2.3. Bằng HPLC
• Cột
- cột phân bố (RP-18; RP-8), cột trao đổi ion
- cột hấp phụ (Si-amino, -cyano, -diol)
• Pha động
- H2O, MeOH, AcCN, THF (+ đệm hữu cơ, vô cơ)

• Mẫu thử : alkaloid base / MeOH

• Detector : UV, RI, ELSD, MS, NMR,

• Kết quả : Sắc ký đồ (Rt); phổ.

Hiện rất th.dụng, cần thiết / đ.tính, đ.lượng, t.chuẩn hóa.

131
12.3. Bằng phản ứng hóa học
Lưu ý : khi làm các phản ứng tạo tủa, tạo màu
nên dùng các dung dịch alkaloid muối.

Đánh giá Quan sát thấy dung dịch…

(̶) vẫn trong

(+) đục lờ, không lắng

(++) đục nhiều, tủa xuất hiện sau vài phút

(+++) tủa rõ, lắng nhanh; thêm 1 giọt TT  tủa tiếp

(++++) tủa nhiều, lắng ngay; thêm 1 giọt TT  tủa tiếp

132
133
134
135
 Một số phản ứng màu đặc hiệu thông dụng

alkaloid phản ứng màu alkaloid phản ứng màu

Tropan Vitali-Morin Berberin Oxyberberin

Strychnin Sulfo-chromic Quinin Thaleoquinin

Brucin Cacothelin Quinin Erythroquinin

Cafein Murexid Quinin Huỳnh quang

136
 Phản ứng Vitali-Morin (acid tropic / alk. tropan)

alk. base khan

+ HNO3 đ.đặc, cô khô

alkaloid muối

a. rửa bỏ HNO3 dư bằng aceton

b. + aceton; + (KOH 10% /cồn)

màu tím bền

(atropin / scopolamin / hyoscyamin) : có acid tropic  dương tính

(strychnin, apomorphin, veratrin  tím không bền)

137
 Phản ứng của quinin

alk. Canh ki na

H2SO4 loãng
test huỳnh quang
+X
huỳnh quang xanh mất huỳnh quang
+ Br2

NH3 thừa mất huỳnh quang NH3 + Kali ferocyanid

màu xanh ngọc màu đỏ (tan / CHCl3)

phản ứng Thaleoquinin phản ứng Erythroquinin

138
Phản ứng của Brucin Phản ứng của Strychnin

cắn alk. base khan cắn alk. base khan

HNO3 đđặc H2SO4 đđặc

màu đỏ máu cắn alkaloid sulfat

(phản ứng cacothelin) K2Cr2O7 t.thể. Kéo lê

tím  cam  vàng

139
 Phản ứng Murexid Phản ứng Oxy-berberin

cắn alk. base khan berberin sulfat loãng

HCl đđ.+ H2O2 Cô khô Javel (mới)

cắn alk. muối khan oxy-berberin (đỏ)

NH4OH đđ. Javel thừa

màu tím sim mất màu đỏ

(caffein) (berberin)
140
 Nguyên tắc chung

alk. muối / dược liệu

A B

alk. muối / d.môi alk. base / d.môi

thay đổi pH

tạp tạp
cắn alk. base sạch

1. p.pháp cân 3. đo quang

2. acid – base 4. pp. sắc ký
141
13.1. Phương pháp cân : Áp dụng khi

- không đ.lượng = acid-base được (alk. kiềm quá yếu)

- alkaloid chưa rõ về cấu trúc hóa học
P bé (khó cân)
- hỗn hợp phức tạp của nhiều alkaloid
- muốn đánh giá sơ bộ về ∑ alkaloid

Mức độ tin cậy

- kém chính xác (alk% quá ít; tạp thừa)
- khắc phục = ph. pháp cân gián tiếp

P lớn (dễ cân)

142
13.1. Phương pháp cân

chiết dạng alk. acid hoặc base

cafein, nicotin
loại tạp (chất béo, tannin …)
Bertrand

đổi pH nhiều lần (chuyển dạng) Bertrand.(alk)4

alkaloid base
Palk

cân trực tiếp, gián tiếp

(cân gián tiếp)
143
13.2. Phương pháp thể tích

alk. base

acid thừa
(HCl, H2SO4 loãng)
kiềm

với các chỉ thị màu vùng pH acid :

- methyl đỏ (4.2 đỏ  6.3 vàng)
- methyl cam (3.0 đỏ  4.4 vàng)
(có thể + methylen xanh)
144
* Ph.pháp thể tích (môi trường khan)

- nền: AcOH băng

- acid percloric thừa

- chỉ thị màu: Tím tinh thể

- áp dụng: kể cả alk. kiềm quá yếu (cafein, colchicin…)

- chính xác > ph.pháp cân

tím tinh thể : vàng lục (acid)  xanh lục (tr.tính)  tím (kiềm)

145
13.3. Phương pháp đo màu

- màu tự nhiên (berberin, palmatin)

- màu do + th’ thử tạo màu (Dragendorff, oxy-hóa)
- màu huỳnh quang (quinin sulfat, berberin sulfat)

• Thực hiện

- đo trực tiếp màu dung dịch

(thường tính theo 1 alk. đại diện)
- đo bằng cách quét vết màu (scanner / SKLM)
(thường chấm // alk. chuẩn)

146
13.4. Phương pháp SKLM

SKLM

tạo màu

diện tích vết

đo vết cạo vết
cường độ màu
scanner
[alkaloid %]

13.5. Phương pháp HPLC

Thường kết hợp với nhiều cách ch.bị mẫu (SPE, SPME)
với nhiều detector khác nhau (UV, IR, RI, MS, ELSD...)
147
• Là những chất chuyển hóa thứ cấp, chất bài tiết hoặc là
sản phẩm cuối trong quá trình chuyển hóa của thực vật.
• Là những chất dự trữ Nitơ, tham gia vào chu trình Nitơ
trong thực vật.
• Đôi khi là những chất tích lũy dần từ thức ăn (Kiến lấy
alk. từ lá cây; Ếch, Cóc ăn kiến  Ếch, Cóc có alk.)
• Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật.
• Là vũ khí hóa học trong tự vệ, cần trong quá trình
sinh tồn nhất là ở động vật (Cá, Cóc, Kỳ nhông ...)
148
Alk. thường có hoạt tính sinh học mạnh đến rất mạnh
• khá nhiều chất được sử dụng trong y học.
• một số chất dùng làm chất độc dùng trong săn bắn
(tubocurarin / Curaré)
• một số chất quá độc, không dùng trong y học
(Gelsemin trong Lá ngón).
• nhiều chất có thêm tác động nguy hại đến xã hội
(gây nghiện, ma túy, ảo giác)

If Nature had any sense, She wouldn’t make alkaloids !

(John Comforth)
149
Khi thực vật có nhóm alkaloid, thì tác dụng của dược liệu
thường do nhóm alk. (trong đó thường do 1 alk. chủ yếu).
• Trên hệ thần kinh
- kích thích TKTW : cafein, strychnin
- ức chế TKTW : morphin, codein
- kích thích trực giao cảm : ephedrin
- liệt trực giao cảm : yohimbin
- kích thích đối giao cảm : pilocarpin
- liệt đối giao cảm : atropin

150
 • Trên các cơ quan khác
- Gây tê : Cocain - Giảm đau : Morphin

- Giảm ho : Codein - Giảm co thắt : Papaverin

- Trị sốt rét : Quinin - Diệt giun sán : Arecolin

- Diệt khuẩn : Berberin, Emetin - Hạ huyết áp : Reserpin

- Trị ung thư : Taxol, Taxotère

Vincristin, Vinblastin, Vincamin

Tham khảo thêm: G.A. Cordell et als., (2001).

Phytotherapy Research, 15, pp. 183-205.
151
• Paclitaxel (Taxol*), Docetaxel (Taxotère*)

• Vinblastin (VLB), Vincristin (VCT)

• Atropin, Berberin, Ephedrin

• Quinidin, Quinin.

• Cocain , Morphin


tetrahydrocannabinol (THC; hoạt chất chính)

và các Δ’ trong cây Cần sa (Cannabis sativa)
thì không thuộc nhóm alkaloid.
152
 alkaloid nguồn gốc tác dụng

từ 1 loài Ếch giảm đau (ít co cơ)

Epibatidin
(Ecuador) không gây nghiện

cai nghiện ma túy,

Ibogain Tabernanthe iboga
cocain, heroin, rượu

Huperzia serrata
Huperzin A Alzheimer’s
(Lycopodium serratum)

Camptotheca antitumour
Camptothecin
acuminata Irinotecan*, Topotecan*

153
Caffein Neonatal apnoea
Nicotin Ulcerative colitis, Tourette’s syndrome
Capsaicin Post-herpetic neuralgia
Colchicin Fimilial Mediterranean Fever
Eserin Alzheimer’s
Galanthamin Alzheimer’s
Pilocarpin Xerostomia
Quinin Noctural Leg Cramps
Scopolamin Nausea, Vomiting
Theophyllin Anti-inflamatory (De Smet, 1997)
154