物化實驗

第十二組

實驗：薄層層析與管柱層析

組員：

C110146101 梁祐禎、C110146102 黃榛苡

C110146119 張君驊、C110146120 林宥姍

C110146125 陳美蓁、C110146134 張玉婷

目錄
實驗原理
實驗步驟..................................................................................................4
結果與討論..............................................................................................6
1.1 數據紀錄......................................................................................6
問題討論..................................................................................................7
結論..........................................................................................................7
參考資料..................................................................................................7
 實驗原理
層析法是利用化合物在靜相與移動相之間的吸附性(或分配差異)以分離混合物的方法。
薄層層析是吸附性色層分析的一種，將吸附劑如矽膠或礬土均勻塗佈在鋁片上形成薄
層，此為層析的靜相，再將試樣點於此薄層靜相上，以展開劑作為移動相，因毛細作
用展開劑帶試樣由下往上移動。試樣中不同的化合物與靜相、展開相吸附力的差異，
上升的速率不同而在薄層上分開，達分離目的。管柱層析是利用化合物在靜相與移動
相之間的吸附力與分配率差異，以分離混合物的方法。在直立的玻璃管柱中，裝填矽
膠或礬土作為靜相，將要分離的混合物由管柱頂端填入，以液體沖提劑作為移動相，
因各成分在靜相吸附力不同及與沖提劑間溶解度的有差異，各成分物被沖提的速率不
同，而達到區帶分離的目的。
 實驗步驟
1. 準備 TLC 片
(1) 剪裁適當的 TLC 片，鋁片四周應修剪平整(向助教索取)
(2) 展開槽加注入適量的展開液，適當搖盪使展開槽內充滿展開液的飽和蒸氣。
(3) 準備 2 支小量筒及 2 支滴管做為調配乙酸乙酯(EA)與正己烷(HA)
(4) 另取 50 mL 錐形瓶裝約一半乙酸乙酯，作為毛細管清潔液。
2. 於 TLC 片距下方 0.5 ~ 1.0 cm 處以鉛筆輕畫一條線為起始線，鉛筆在線上點出需要
的試樣點 4 點(本實驗共有三種化合物及三種的混合物)，點與邊緣或點與點間距 0.3
cm 以上，點的下方標示記號或編號。
3. 用毛細管將化合物點在試樣點上，盡量使點不擴散，點越小越好；以 EA 清洗毛細
管數次，再點上其他化合物於另外的試樣點。化合物溶液的濃度較稀者，可於同點上
多點數次。
4. 配製(EA:HA，1:2，1:4 及 1:6)三種展開液，添加適當的量於展開槽中進行展開，更
換不同展開液時展開槽需清潔。
5. 用鑷子夾 TLC 片，將畫有起始線一端向下放入展開槽內，要求
快速穩定的斜靠在槽壁上，槽內展開液高度低於試樣點 0.3 ~ 0.5 cm，合上槽蓋。
6. 展開液因毛細作用沿 TLC 片向上爬升，展開液前上升接近 TLC 片的頂端時，以鑷
子取出 TLC 片，立即以鉛筆在展開液前畫出終點線。當 TLC 片上的展開液揮發後，
以鉛筆勾畫試樣的色點位置。更換展開液，重複 2-6 步驟。
7. 樣品本身帶有顏色，可以直接觀察試樣色點的位置。
8. 各試樣色點的中心位置，計算各點的 Rf 值，記錄所使用的展開液條件
二、管柱層析步驟
1.以燒杯稱取適量的矽膠作為靜相填充物，取適量的沖提溶劑於另一燒杯中，將矽膠
慢慢攪拌加入於溶劑中，持續攪拌至成稀泥狀。
2.將玻璃管柱垂直固定放於鐵架上，管柱下方放置一個燒杯以盛接沖提劑。
3.以少量棉花塞於玻璃管柱底端，使用漏斗加入適量的沖提劑於玻璃管柱中，以玻璃
棒將底部棉花中的空氣壓擠，加上薄薄一層無水 MgSO4 於棉花上，用沖提劑沿管壁將
殘留的無水 MgSO4 刷下至底部。
4.關上管柱底端旋鈕，以漏斗將稀泥狀的矽膠，邊攪拌邊倒入玻璃管柱中，倒完後，
以滴管吸取沖提溶劑沖洗管壁四周殘留矽膠泥。適當的輕敲管壁，趕走氣泡及讓矽膠
泥緊實，務必使矽膠泥頂端的平面平整。
5.打開管柱底端旋鈕，讓沖提溶劑由管柱下方緩慢流出，當沖提溶劑液面下降至矽膠
泥頂端等高時，關上旋鈕，加入少許無水 MgSO4 做為緩衝層，層厚度約為 0.5 公分。
沖洗管壁四周殘留硫酸鎂。
6. 打開管柱底端旋鈕，當液面下降至矽膠泥頂端等高時，用長滴管吸取分離試樣(固體
試樣先以少量沖提液溶解)，儘量靠近填充 MgSO4 層的表面，沿著管柱壁以環形慢慢
加入，極少量沖提溶劑沿著管柱壁小心將殘留於管柱壁上的試樣。打開旋鈕，讓試樣
很慢的吸入矽膠泥中，至試樣剛好沒入 MgSO4 緩衝層即可。
7.添加沖提溶劑至玻璃管柱的最頂端。準備 40 支試管，置於試管架。試管標示編號，
依照試管先後次序收集沖提液，每支試管收集約 1mL 沖提液即換另一支試管收集。
8.隨時補充沖提液，液面不能低於矽膠泥頂端面；由管柱上的色環變化，收集有顏色
的沖提液，當所有色環均消失即停止收集。(若無顏色試樣，則須對試管中的試樣做
TLC 分析，判別是否停止收集)
9.以 TLC 分析試管內溶液，鑑定其分離的效果。
10.依照指示處理玻璃管柱的填充矽膠。
 結果與討論
1.1 數據紀錄
室溫= 24 ℃ 氣壓= 755 mmHg

A、 TLC(做 3 種不同配比的展開液)
表 1. 薄層層析分離距離紀錄
溶劑 A=EA、B=HA
配比 A:B 1:2 1:4 1:6
基線與終點線距離(cm) 4.20 4.90 3.60
純鄰位硝基苯胺(cm) 1.90 Rf = 0.452 1.40 Rf = 0.286 0.50 Rf = 0.139

純間位硝基苯胺(cm) 2.50 Rf = 0.595 2.30 Rf = 0.469 0.90 Rf = 0.250

純對位硝基苯胺(cm) 3.20 Rf = 0.762 3.40 Rf = 0.694 1.50 Rf = 0.417

混合液(cm) 鄰位 間位 對位 鄰位 間位 對位 鄰位 間位 對位

薄片層析圖

B、管柱層析
1. 沖提液及用量(配比及總用量) :配比: 1:4、總用量:400 Ml
2. 管柱長度及管徑： 23.00 cm / 2.5 mm
3. 紀錄管柱分析三種化合物收集到的試管編號及體積
(1)共收集試管支數：35 支 每支試管收集體積(c.c)：1 c.c
(2)第 1 點顏色試管編號： 5 ~ 16
(3)第 2 點顏色試管編號： 18 ~ 27
(4)第 3 點顏色試管編號： 27 ~ 34
 問題討論
1. 在管柱層析中，為何必須小心地填充分離管柱？
答: 填充分離管柱時需謹慎，一方面是避免矽膠粉末撒出，一方面為盡量不要在填
充管柱過程中留下空氣，因為空氣會影響後續管柱層析樣品的分離效果，嚴重時
可能導致樣品累積在空氣處又與上面流下物質重新變回混合物，造成分離效果不
佳。
2. 在管柱層析中，為何先用極性較低的沖提液而不用高極性的沖提液？
答: 由於現今常使用的靜相材料是矽膠以及礬土，兩者皆為極性高的材料，沖提劑
極性越高，化合物在管柱上的滯留時間越短；反之沖提劑的極性越低，化合物在
管柱上的滯留時間越長，適當調整沖提劑的極性可以讓混合物以適當速度流出。
3. 若試樣點在 TLC 上的點半徑過大時，會有何種現象發生?
答: 若半徑點過大可能造成物質在分離時又碰在一起，無法達到分離效果。
4. 為何在進行薄層層析時，須將展開槽蓋蓋上?
答: 由於展開槽中溶劑之蒸氣若沒有充滿整個展開槽，溶劑很難由下向上帶動樣品
分離，因此需蓋上槽蓋使溶劑蒸氣充滿整個槽內。
5. 在薄層層析中，將 TLC 片放入展開槽中時，展開液為何不可超過試樣點？
答: 避免試樣點落入展開液中，導致試樣點在被展開液向上帶分離前即溶於展開槽
的溶劑中。

結論
在薄層層析及管柱層析實驗中，起初我們在進行薄層層析實驗時，一直無法有效於
TLC 片上看出色層分析，我們試了幾次後在 1:4 的溶劑比例成功分離混合物，拿取第
四樣品做管柱層析後，由於有前幾組的經驗分享，告訴我們不要將管柱填充太長，以
免層析時間過長，無法完成實驗，因此我們大約填充了 1/3 根試管的矽膠粉末，在將
樣品填入管柱時，由於上面還有未下降至矽膠部分的沖提液，因此使溶劑與樣品混合，
我們推測這是我們在管柱層析實驗中無法在管柱中看出分離效果的原因，若下次有機
會再做到管柱層析實驗，我們認為只要掌握這點可改善實驗的精確性，但後來再以薄
層層析觀察收集後的試管液，我們發現薄層層析即為縮小版的管柱層析，且分離順序
與管柱層析恰好相反，即薄層層析最先被分離出的物質在管柱層析中最後才會被分離
出來。

參考資料
1. 層析法介紹
2. 薄層層析
3. 管柱層析