1.

Nguyên tắc của phương pháp và phạm vi áp dụng

- Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử folin. Cường độ
màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Biết được mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo
đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng
protein của mẫu nghiên cứu.
- Đây là phương pháp rất nhạy và chính xác, được dùng phổ biến trong việc xác định
protein. Phương pháp dùng đối với protein hòa tan (tan trong kiềm)
- Bao gồm 2 giai đoạn:
 Phản ứng biure: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-). Trong
môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với
CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi
tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.
 Phản ứng với thuốc thử folin: Thuốc thử folin có chứa axit phosphomolipdic và
axit phos-phovolframic. Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, một
mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các axitamin này tham gia
trong quá trình tạo phức chất có màu xanh da trời, hấp thụ cực đại bước sóng ở 750 nm.

2. Tiến hành
Hoá chất:
- Thuốc thử folin:
Hòa tan 1000 gam natri wonframat ( Na 2WO4.H2O) và 25 gam natri molybdat
(Na2MoO4.2H2O) vào 800 ml nước cất. Thêm 50 ml axit photphoric 80% ( H 3PO4) và 100ml axit
clohydric đậm đặc. đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2000ml với ống sinh hàn
ngược trong vòng 10 giờ. Có thể đun ngắt quãng, không cần phải đun liên tục, nhưng phải đun
sôi đủ 10 giờ. Sau khi đun sôi xong, thêm vào hỗn hợp 105 gam litium sunfat, 50ml nước cất và
5 giọt nước brom. Đun sôi 15 phút không có ống sinh hàn ngược để loại trừ lượng brom dư.
Dung dịch thuốc thử phảm có màu vàng, không được có màu xanh. Nếu thuốc thử có màu xanh
phải xử lý brom lần thứ hai. Sau khi làm nguội dung dịch, thêm nước cất cho đến vạch mực
trong bình định mức dung tích 1 lít. Lọc qua ống Allin có chứa bông thủy tinh.
Xác định nồng độ thuốc thử bằng cách chuẩn độ dung dịch folin pha loãng 10 lần với
dung dịch NaOH 0,1 N với chất chỉ thị phenolphtalein ( dung dịch gốc thường có nồng độ 1N).
Bảo quản thuốc thử trong bình thủy tinh màu, nơi lạnh. Sau 2-3 tháng dung dịch ngả
màu xanh thì thêm vài vọt brom và lại đun sôi 15 phút, dung dịch có màu vàng trở lại. Trước khi
dùng, pha loãng thuốc thử bằng nước cất sao cho nồng độ thuốc thử bằng 0,5N.
☞ Tại sao lại cho brom vào rồi lại khử Brom?
Do folin là chất oxi hóa, cho Brom vào để khử để luôn giữ folin ở trạng thái oxi hóa, tuy
nhiên brom dư phải bị khử đi để folin tránh pha loãng, tránh bị lẫn với các thành phần khác và
tránh sai số với phản ứng.
- Dung dịch A: dung dịch Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1N
- Dung dịch B: dung dịch CuSO4.5H2O ( 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat 1% hoặc pha trong
dung dịch kali-natri tartrat 1% ). Dung dịch pha trong natri xitrat sẽ bền hơn pha trong kali-natri
tartrat)
- Dung dịch C: hỗn hợp của hai dung dịch A và B pha theo tỷ lệ 50:1 trước khi dùng.

2.1. Xây dựng đường chuẩn albumine bằng phương pháp Lowry
Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò ( BSA-Bovine Serum Albumin):
0,5mg/ml ( PTN pha sẵn).
☞Tại sao lại dùng Albumin huyết thanh bò?
Phương pháp chọn cần làm với protein tinh khiết ( 99,999%) vì nếu không tinh khiết có thể
trong đó còn có những chất có thể phản ứng được với Cu 2+ hay phản ứng với những chất có trong
phương pháp, do vậy có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Mà albumin lại nằm ở vị trí giữa
trong nhóm protein sẽ dễ xác định và nhận thấy hơn.
Chuẩn bị 2 dãy ống ống nghiệm sạch gồm 6 ống rồi thực hiện các bước dưới đây:

2.1.1. Pha dãy dung dịch BSA với các nồng độ Ci cho đường chuẩn (dãy ống 1):
Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo dãy ống có nồng độ BSA
(Ci)

Ống falcon15ml/ống 1 2 3 4 5 6
nghiệm ngắn
Dung dịch BSA gốc 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
(ml)
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Nồng độ BSA Ci 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
(mg/ml)
Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci
2.1.2. Thực hiện phản ứng:
Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau vào dãy ống 1 ở trên tạo
dãy ống có cường độ màu khác nhau tùy thuộc nồng độ BSA Ci khác nhau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 5
Trộn đều để yên 10 phút
Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Trộn đều bằng vortex, để yên 20 -30 phút

2.1.3. Đo độ hấp thu ánh sáng tại bước sóng 750nm (OD750 nm) với mẫu đối sánh (mẫu kiểm
chứng) là mẫu trong ống nghiệm số 7.

OD750 nm 0 0,078 0,126 0,177 0,225 0,265

Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa Nồng độ BSA Ci (mg/ml) và OD750nm,
trục tung là mật độ quang (OD750nm), trục hoành là nồng độ protein. Tìm phương trình biểu
diễn đường chuẩn dạng y= ax +b với y = OD750nm, x= [Protein] (mg/ml) và hệ số tương quan
R2 nhờ phần mềm Excel.
 Đường chuẩn Albumine
0.3

f(x) = 0.259571428571429 x + 0.0153809523809524

0.25 R² = 0.988789982384515

0.2
OD 750nm

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Nồng độ protein (mg/ml)

2.2. Phân tích mẫu

Mẫu thí nghiệm: Mẫu thực phẩm (đậu phụ) chứa protein được PTN chuẩn bị
2.2.1 Chuẩn bị dịch protein phân tích
- Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml
- Cân chính xác 0,3g mẫu; chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc
vào để làm ẩm
☞ Tại sao lại dùng NaOH?
Lượng NaOH dùng đổ vào mẫu sút để phá vỡ cấu trúc màng tế bào để protein chui ra bên
ngoài. Do tế bào có màng lipit sẽ tác dụng với NaOH ( phản ứng xà phòng hóa), do
NaOH là dung dịch kiềm nhẹ nên làm protein phân ly tốt hơn, khả năng hòa tan, khả năng
đẩy tốt hơn.
- Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml.
- Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại
- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút
 ☞Tại sao lại đun cách thủy?
Đun cách thủy để nhiệt độ dung dịch không quá yêu cầu ( 70-80°C). Nếu nhiệt độ
cao sẽ làm giảm hiệu suất của phản ứng màu, hoặc gây biến tính.
- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm
dịch lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn).
☞Tại sao lại dùng giấy chỉ thị pH mà không dùng phenolphtalein?
Dùng giây pH mà không dùng phenolphtalein ( màu hồng) vì phản ứng sau sẽ có màu
xanh làm ảnh hưởng đến việc xác định màu ở thí nghiệm. Nên phải dùng chất chỉ thị mà
không làm ảnh hưởng đến màu của dung dịch.
- Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn đều.
- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.
2.2.2. Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ
 Mẫu thí nghiệm:
Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):
0,3 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)
3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng micropipet)
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)
Để phản ứng 20 phút.
 Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm ):
Lấy vào ống nghiệm(khô,sạch):
0,3 ml H2O (dùng micropipet)
3 ml dung dịch C (dùng micropipet)
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)
Để phản ứng 20 phút.
Đo độ hấp thụ ánh sáng
Đọc kỹ Hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN, SV đề nghị Kỹ thuật viên của PTN
hướng dẫn sử dụng máy.
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750 nm, với dung
dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.
Sử dụng đường chuẩn protein để tính hàm lượng protein của dung dịch nghiên cứu.

3. Xử lý số liệu
Lượng mẫu thực phẩm (đậu phụ) lấy được: 0,3g
Kết quả đo OD: (0,145+0.140)/2 = 0,1425
Theo đường chuẩn albumin: y = 0,2596x +0,0154 mà y = 0,1425 => x = 0,4896 (mg/ml)
  Trong 100ml dung dịch thì có 48,96mg albumine
 Hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm là:
48 , 96
%protein = × 100% = 16,32%
300
4. Chú ý:
- Cẩn thận với hoá chất
- Định mức đúng với cách tiến hành
- Dùng micropipet đúng cách không nghiêng ngả
- Đưa pH của dung dịch protein phân tích về đúng 7 nhất có thể
- Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng máy đo quang