1

• Định nghĩa, phân loại các saponin

• Các tính chất (lý, hóa) chính của saponin

• Các phương pháp chiết xuất, phân lập saponin

• Các phương pháp định tính, định lượng saponin

• Tác dụng & Công dụng chính của các saponin

• Các dược liệu* chứa saponin đáng chú ý

2
3
1. Khái niệm - Định nghĩa 6. Chiết xuất

2. Cấu trúc - Phân loại 7. Phân lập - Tinh chế

3. Lý tính 8. Định tính

4. Hóa tính 9. Định lượng

5. Phân bố / tự nhiên 0. Tác dụng - Công dụng

4
• Từ xưa, con người đã biết sử dụng một số thực vật để tắm gội,
giặt giũ… do chúng có tính tạo bọt, tẩy rửa.
• Nhiều loài cây đã được sử dụng cùng mục đích giặt tẩy:

- soapbark: Quillaja saponaria họ Quillajaceae.

- soapwort: Saponaria officinalis họ Caryophyllaceae.
- soapberry: Sapindus saponaria họ Sapindaceae.
- soapnut: Sapindus mukurossi họ Sapindaceae.
- soaproot: Chlorogalum pomeridianum Asparagaceae.

Saponin xuất phát từ “sapo” = soap, savon vừa nói lên tính chất,
vừa nói lên xuất xứ thực vật của nhóm hợp chất tự nhiên này.
(ban đầu, được chiết từ chi Saponaria hay từ loài Q. saponaria).
5
• Khi dùng các cây nói trên để tắm giặt, người ta nhận thấy chúng
có thể làm chết cá, ốc, đỉa… và 1 số động vật thân mềm khác
(nên chúng còn được dùng để thuốc cá *; khác Derris elliptica!).

• Hiện nay, nhiều tài liệu vẫn công nhận Gmelin (1819) là người
khai sinh ra thuật ngữ “saponin” hiện đang được sử dụng.

• Vài tài liệu khác lại cho rằng thuật ngữ “saponin” được sử dụng
đầu tiên bởi: P.A. Bucholz, từ 1811 (theo Bernard, 1949) hoặc
bởi Grothus, từ 1815 (theo Kichter, 1939).

Tham khảo Ludwig Kofler (1927), Die Saponine, p. 4 (slide sau)

6
• Ludwig Kofler (1927): Xuất bản cuốn “Die Saponine” tổng quan
hệ thống về lịch sử nghiên cứu, về tính chất lý hóa, sinh học…
cùng sự phân bố, xuất xứ của nhiều saponin thực vật.

• Rosenthaler (1939): Saponin là các chất có tính tạo bọt bền

trong dung dịch nước, có cấu tạo glucosid (hay Δ’ glucuronid)
của polyterpen hay của cholan (tức sterol).

• Bernard (1949): Saponin là các heterosid, có bản chất keo

(colloidal), tan được và có tính tạo bọt trong nước.
Chúng có mùi hăng nồng, vị đắng, gây hắt hơi, gây phá huyết.

7
• Ph.ứng màu: (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889).
• Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol: (Windaus, 1909).
• Phân loại saponin theo tính acid-kiềm: (Robert, 1917).
• Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước: (M.E. Wall, 1952).

Từ 1975 – nay:
Rất nhiều tiến bộ về sản xuất dược liệu, chiết xuất, phân lập,
kiểm nghiệm, nghiên cứu cấu trúc, tác dụng sinh học…
của các saponin từ thực vật và cả hải sinh vật
Đối tượng được nghiên cứu đặc biệt: Panax spp. Araliaceae

8
9
10
1.1. Quan niệm truyền thống: Saponin là các glycosid tự nhiên
(gặp chủ yếu trong thực vật, một số từ động vật) có tính:

• Làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch.

• Tạo bọt nhiều, bền khi lắc với nước.
• Làm vỡ hồng cầu (phá huyết) ở nồng độ rất thấp.
• Độc đối với cá & các loài thân mềm (giun, sán, ốc…)
• Kích ứng niêm mạc (gây hắt hơi, đỏ mắt…)
• Tạo phức với cholesterol & các Δ’ 3β-OH-steroid.

11
Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (/ Đậu nành, Cam thảo,
Nhân sâm, Tam thất…) lại ko thể hiện đầy đủ các tính chất này;
nhất là tính phá huyết & tính tạo phức với cholesterol…

1.2. Quan niệm hiện nay: Saponin là các glycosid có MW lớn

của triterpenoid hay steroid. (Kurt Hostettmann, 1995).

Lưu ý:
• Như vậy, các glycosid trợ tim cũng thuộc nhóm saponin.
• Các sapogenin, tuy không là glycosid, mặc nhiên vẫn được
xếp vào “nhóm saponin”
12
Robert, 1917: Phân loại saponin → saponin acid, trung tính, kiềm.
Hiện nay: phân loại theo khung của aglycon = sapogenin = genin.

13
- Đại đa số: O-glycosid (thường gặp ở 3β-OH → ose).
Ít gặp hơn: ψ-glycosid (thường gặp ở 28β-COOH → ose).
- Sap steroid: thường chỉ là mono-desmosid (1 mạch đường).
Saponin triterpenoid: có thể có 1, 2 hoặc 3 mạch đường.
- Mạch đường (desmos) có thể thẳng hoặc phân nhánh.
Mỗi mạch đường có thể 1-5; đôi khi: hàng chục đường đơn.
- Các hexose, pentose hay gặp trong cấu tạo saponosid:
* hexose: βD-Glc (và Δ’ GlcA) βD-Fuc (6-desoxy)
βD-Gal (và Δ’ GalA) αL-Rha (6-desoxy)
* pentose: βD-Xyl (f, p) αL-Ara (fura/pyranose)

14
βD-glucose glucuronic acid βD-galactose

αL-rhamnose βD-fucose

βD-xylose αL-arabinose (f) αL-arabinose (p) 15

• βD-Glc: Mọi nhóm thế đều định hướng equatorial (eq).
• βD-Gal: Chỉ nhóm 4-OH là định hướng axial (ax).
• Khi CH2OH → COOH: ose → các acid glycuronic (GlcA…).

• Fucose (Fuc) và Rhamnose (Rha) đều là 6-deoxy ose.

• Xylose (Xyl) và Arabinose (Ara) đều là các pentose.

• βD-Fuc # βD-Gal (nhưng mất Oxy ở C-6: CH2OH → CH3).

• αL-Ara(p) # βD-Gal (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch).
• βD-Xyl(p) # βD-Glc (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch).

16
Tần suất gặp các Ose / Sap. Oleanan ở 25 bộ thực vật
đã gặp (theo Vincken 2007, Phytochemistry 68)

17
2.1.1. Saponin triterpenoid 5 vòng (only C/D: cis)

a. Phân nhóm Oleanan ** d. Phân nhóm Hopan

b. Phân nhóm Ursan * e. Ph. nhóm taraxasteran
c. Phân nhóm Lupan f. Phân nhóm khác

2.1.2. Saponin triterpenoid 4 vòng (all: trans)

a. Phân nhóm Dammaran * (Me: 10β + 8β)

b. Phân nhóm Lanostan (Me: 10β + 13β)
c. Phân nhóm Cucurbitan (Me: 9β + 13β)
d. Phân nhóm Tirucallan (Me: 10β + 13α)

18
Gồm các (6) đơn vị isopren; nối chủ yếu theo kiểu “đầu → đuôi”

★ ★
đầu

2 đuôi
đuôi
★ ★ ★

đuôi
★

đầu
★ ★

5 vòng: only C/D: cis

4 vòng: all 3 trans
19
 2.1.1. Saponin triterpenoid 5 vòng

β α
E E

Khung Oleanan Khung Ursan Khung Taraxasteran

Khung Lupan Khung Hopan All = 8 nhóm methyl

E E

20
 ★

Oleanan → β-amyrin → acid oleanolic hederagenin

Ursan → α-amyrin → acid ursolic acid quinovic

21
 ← Khung Lupan ★
R = H: Lupeol →
R = CH2OH: Betulin →
R = COOH: acid Betulinic →

All = 8 nhóm methyl

←Khung Hopan
★
Diplopten →

22
23
• Trong 5 vòng A, B, C, D, E: vòng E có thể là 6 cạnh hay 5 cạnh.
• 4 vòng A-D: có 6 nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl ở vòng A).
• E 6 cạnh: thêm 2 nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan).
• E 5 cạnh: thêm 2 nhóm Me / isopropyl (↑: Lupan; ↓: Hopan).
• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; ≠ sap. steroid).

Oleanan Ursan Lupan Hopan

( 2 singlet x 3H) (2 doublet x 3H) (1 doublet 6H) (1 doublet 6H)

24
 2.1.2. Saponin triterpenoid 4 vòng

8C

(17 + 5) C

dammaran (10β + 8β) cucurbitan (9β + 13β)

lanostan (10β + 13β) tirucallan (10β + 13α)

All = 8 nhóm methyl 25

 2.1.2a. Khung dammaran

protopanaxadiol (genuin) protopanaxatriol (genuin)

panaxadiol (artefact) panaxatriol (artefact)

các ginsenosid các ginsenosid

Rb1, Rb2, Rc, Rd… Rg1, Rg2, Re, Rf…

Các mạch đường sẽ nối O-glycosid vớ1 nhóm OH ở C-3, 6, 20

26
2.1.2b. Khung Lanostan (10-Me) các Holothurin (R = H hay OH)

All = 8 nhóm methyl

oses

2.1.2c. Khung Cucurbitan (9-Me) Cucurbitacin B (in Cucurbitaceae)

27
• Trong 4 vòng A, B, C, D: chỉ vòng D là 5 cạnh (Σ → 17 C).
• Khung có sẵn 5 nhóm Me; có gem-dimethyl / vòng A (→ 22 C).
• Vòng D thêm nhánh 8 C; trong đó có 3 nhóm Me nữa (→ 30 C).
• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; khác hẳn sap. steroid).
• Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me:

28
 2.2.1. Phân nhóm Spirostan (chủ yếu, phổ biến)
2.2.2. Phân nhóm Furostan (dễ biến thành Spirostan)

Nhận xét về khung của saponin steroid:

• Vòng (A): không có gem-dimethyl ở C-4 (≠ sap. triterpenoid).

- các khung sap. steroid chỉ có # 4 nhóm methyl.

- còn khung sap. triterpenoid có tới # 8 nhóm methyl.
13
Rất dễ phân biệt bằng các phổ C-NMR (CPD, DEPT).
• Saponin steroid đa số chỉ có 1 mạch đường (monodesmosid);

còn sap. triterpenoid có thể đến 3 mạch đường (tridesmosid).

29
 2.2.1. Phân nhóm spirostan

8C

(17 + 2) C

Diosgenin (All = 4 nhóm Me) Hecogenin

Là nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid.
Hai genin đáng chú ý: diosgenin / Dioscorea & hecogenin / Agave.

Khi chiết xuất, nhóm Me-27α dễ chuyển thành Me-27β

(và hecogenin, tigogenin, gitogenin → neohecogenin...)

(phổ IR sẽ hơi khác)

30
 2.2.2. Phân nhóm Furostan

Ít gặp hơn Spirostan. Furostan dễ đóng vòng thành Spirostan

All = 4 nhóm methyl
δc ~110 ppm

★ ★ δc ~100 ppm

★ ★

Khung Furostan Khung Spirostan

13
Tín hiệu trên phổ C-CPD của C-22 / rất đặc biệt:
Furostan: δC ~ 110 ppm; Spirostan: δC ~ 100 ppm
31
2.3.1. Phân nhóm Spirosolan:
Tương tự Spirostan, vòng (F): O → NH.
2.3.2. Phân nhóm Solanidan
2.3.3. Phân nhóm amino-furostan:
Tương tự Furostan, 3-OH → 3-NH2

2.3.4. Phân nhóm Polypodo-saponin

2.3.5. Phân nhóm Osladin
2.3.6. Phân nhóm α-Spinasteroid

32
 2.3.1. Phân nhóm Spirosolan (MW lẻ!)
★

Solasonin Tomatin

All = 4 nhóm methyl

2.3.2. Phân nhóm Solanidan (MW lẻ!)

Solanin 33
 2.3.3. Phân nhóm Amino-Furostan

2.3.4. Các phân nhóm Alkaloid-Steroid khác

34
 Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) của mẫu.
Aglycon thường có vĩ ngữ “genin”: diosgenin... (= EU, USA).
Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid... (EU, USA: oside).
Tên thông thường:

Theo EU, USA Theo DĐVN IV

• saponin: không có e cuối. • saponin: không có e cuối
• alkaloid: có e cuối*. • alkaloid: không có e cuối

Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin…

Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid
Senegin, Mollugocin, Glycyrrhizin, Cucurbitacin…
35
 protopanaxadiol protopanaxatriol
Ginsenosid
(Σ các đường đơn) (Σ các đường đơn)
Ra1, Ra2, Ra3 5
Rb1, Rb2, Rb3, Rc 4
Rs1, Rs2 4
Rd 3
Rg3 2
Rh2 1
Re 3
Rf, Rg1, Rg2 2
Rh1 1
Ro Khung Oleanan với 3 ose ở 2 mạch

Ginsenosid của Rễ củ (Radix) và Lá (Folium) = R và F

36
 3.1. Cảm quan
• Nói chung, saponosid thường ở trạng thái bột vô định hình,
không màu, mùi hăng, đ số: vị đắng nhẫn đến đắng (*).
• Các sapogenin có thể ở dạng tinh thể (thường là hình kim).
Một số “glycosid trợ tim” (cũng là saponin!) dễ ở dạng tinh thể.

3.2. Độ phân cực và tính tan

• Saponosid thì phân cực hơn sapogenin tương ứng.
Độ phân cực tăng theo độ dài & số lượng mạch đường.
• Càng kém phân cực (như sapogenin): càng dễ tan / dung môi
phân cực kém → phân cực trung bình (CHCl3, DCM, EtOAc…).
• Các saponosid: thường kém tan / d. môi (rất) kém phân cực
(Et2O, petrol ether PE, n-hexan, CHCl3, DCM, aceton…)

37
 Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV
(rất kém phân cực) (kém phân cực) (phân cực tr. bình) (rất phân cực)
n-heptan, n-hexan CHCl3, CH2Cl2 EtOAc n-BuOH

Petrol Ether (PE) Et2O i-ProOH

CCl4 Aceton EtOH, MeOH

Benzen, Toluen AcCN H2 O

các acid...

• PE là hỗn hợp gồm a% n-pentan (C5H12, đs. 36oC)

và b% n-hexan (C6H14, đs. 69oC).
• Có 2 loại chính: PE nhẹ (đs. 35oC – 45oC) chứa > 70% pentan.
PE nặng (đs. 45oC – 60oC) chứa 30-70% pentan.
• Ở 20oC, PE có thể lẫn ~ 0,01% nước (10–4). Cháy! Nổ!
38
3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước)
Do có tính lưỡng cực, làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch,
các saponin có tính tạo bọt nhiều và bền khi được lắc mạnh.
Mạch ose càng nhiều & dài, tính tạo bọt càng rõ rệt.
Tính chất này được ứng dụng trong tẩy rửa, làm thuốc long đàm.

3.4. Tính phá huyết (ngay cả khi ở nồng độ rất thấp)

Nhiều saponin có tính phá huyết rất mạnh (làm vỡ hồng cầu →
không được đưa saponin vào mạch máu, nguy cơ gây tan máu).
Tuy nhiên, 1 số saponin lại thể hiện tính chất này không rõ.

3.5. Tính kích ứng niêm mạc

Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc
(làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt hơi mạnh; vd. bột Bồ kết…)
39
 Ghi chú: Có nhiều ghi nhận về tính phá huyết (TPH) của saponin

• Tốc độ và TPH của sap. steroid > sap. triterpenoid.

• TPH của monodesmosid > bidesmosid hay tridesmosid.
• Trong monodesmosid thì:
- TPH sẽ giảm khi aglycon có nhiều nhóm phân cực.
- TPH sẽ tăng khi mạch ose dài đến 4-6 đường đơn.
- TPH của 3-O-Glc > 3-O-GlcA (glycyrrhin có TPH rất kém).

• Chưa thấy sự liên hệ giữa TPH // tính tạo phức với cholesterol.
• Riêng về tỉ lệ khối lượng giữa [aglycon / ose]:
nhiều báo cáo lại có ghi nhận ngược nhau về sự tăng / giảm TPH.

(Ref: SM. Hassan, 2008, Ph.D. Thesis, pp. 30-32).

40
 3.6a. Phổ UV của saponin

• Các saponosid & genin thường không cho phổ hấp thu UV-Vis
Cực đại hấp thu của chúng thường << 250 nm.
HPLC-UV, HPLC-PDA thường không thích hợp với saponin.
Detector hữu hiệu thường phải ~ 205 nm.
Thay vào đó, cần dùng các detector khác (RI, ELSD, MS…)

• Genin triterpenoid + H2SO4 đđ → sản phẩm có λmax 310 nm

Các genin steroid không có tính chất này *.
Ref: VD. Ponomarev, ET. Oganesyan, VF. Semenchenko (1971).

Phổ UV-Vis của các saponin thực tế không có nhiều ứng dụng
như trường hợp của Flavonoid.
41
 Phổ UV của 1 số saponin triterpenoid 5 vòng + H2SO4 đđ.
VD. Ponomarev, ET. Oganesyan, VF. Semenchenko (1971).
Khimiya Prirodynykh Soedinenii, No 2, pp. 147-150.

310 nm 310 nm 310 nm

α-amyrin β-amyrin Lupan

1. acid ursolic 1. acid 18α-glycyrrhetic 1. betulinol
2. acid ursonic 2. acid echinatic 2. lupeol
3. uvaol 3. acid macedonic … … 3. acid betulinic
7. hederagenin 4. lupenon
42
 3.6b. Phổ IR của saponin
• Trên phổ IR, sẽ cho các băng hấp thu đặc trưng của các nhóm
OH: ~3300; -O-C: ~1100 và O=C<: ~1700 cm-1.

• Có thể phân biệt các đồng phân 25R vs 25S nhờ quan sát cường độ
của bộ tứ tín hiệu tại band 1*, 2*, 3* và 4 như sau:

cường
band ν (cm–1) cấu hình
độ
850-857 25S: 1* < 860
1* [1]
860-866 25R: 1* > 860
2* 894-905 [2] 25S: [2] < [3]
3* 915-923 [3] 25R: [2] > [3]
4* 980-987 [4]

• 25S khi 1* < 860 và [2] < [3]

• 25R khi 1* > 860 và [2] > [3] 43
Phổ IR (KBr) của Diosgenin (25R, theo SDBS)

44
Phổ IR (KBr) của Hecogenin (25R, theo SDBS)

Hecogenin

45
Phổ IR (KBr) của neohecogenin (25S, thực đo, 2005)

46
Phổ IR của neohecogenin (thực đo)

band ν (cm–1) [cường độ]

[1] 850 42% [1] < 860
[2] 895 35%
[2] < [3]
[3] 922 70%
[4] 982 63%

25R 25S

∙ ∙

hecogenin neohecogenin
47
 Tham khảo (Học phần Dược liệu 3, năm V)
A. Phân tích bộ 5 tín hiệu của C-23 → C-27 (thuộc vòng F) trên phổ 13C-NMR,
có thể phân biệt được 2 đồng phân hecogenin (25 R) & neohecogenin (25 S).

C-23 C-24 C-25 C-26 C-27

(25 R) hecogenin 31.5 γ 28.8 30.2 (R) 66.9 17.1 (eq)

neohecogenin 26.0 γ 25.8 27.0 (S) 65.1 16.0 (ax)

B. Phân tích tín hiệu phổ 1H-NMR của 26-CH2 (Jaa >> Jae, Jea > Jee)
• hecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-25ax] → Jaa (lớn) và Jea (nhỏ).
• neohecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-26eq] → Jae (nhỏ) và Jee (nhỏ).

∙ ∙

hecogenin: 25R (H-25 axial) neohecogenin: 25S (H-25 equatorial)

48
3.7. Khối phổ (MS)

Đặc biệt quan trọng khi khảo sát cấu trúc các saponosid
có nhiều mạch đường. Trên phổ MS, khi có sự phân mảnh:
• Δm/z 162: → có hexose (vd. glucose, galactose; M = 180)
• Δm/z 146: → có desoxy hexose (rhamnose, fucose; M = 164)
• Δm/z 132: → có pentose (xylose, arabinose; M = 150)

Trước đây, các ose thường được xác định bằng ph. pháp SKLM.
(so sánh với các ose chuẩn; thực hiện sau phản ứng thủy phân).

Hiện nay, các ose được xác định nhờ các kỹ thuật phổ MS, NMR.
(định danh + α/β + fura/pyranose + cách ghép trong mạch…)

49
 Một ví dụ về sự phân mảnh của glycosid có MW 1240

MS của saponin là 1 lĩnh vực rất rộng. Các công bố riêng về từng kiểu
khung genin cũng đã rất đồ sộ. Ví dụ tham khảo: MS và sự phân mảnh
hay LC-MS, LC-HRMS... của các ginsenosid trong chi Panax (internet).
50
3.8. Phổ NMR của saponin

• Các saponin cho nhiều tín hiệu methylen nên phổ 1H-NMR
tương đối khó phân tích (vì nhiều tín hiệu bị xen phủ).
• Dung môi đo phổ NMR có thể là:
- với sapogenin: CDCl3, MeOD, DMDO-d6.
- với saponosid: Pyridin-d5, MeOD, DMDO-d6.
13
• Để so sánh dữ liệu, thường khai thác phổ C hơn là
1
H-NMR.
13
Lưu ý: Trên phổ C-NMR (CPD, DEPT), khung của
• saponin triterpenoid → nhiều (~ 8) tín hiệu methyl
• saponin steroid → ít (~ 4) tín hiệu methyl
(xem lại các slide 20-30 ở mục 2. Cấu trúc & Phân loại)
51
Có thể phân biệt loại và kiểu khung saponin nhờ phổ 1 chiều:

13
A. Sap. triterpenoid vs steroid: Trên phổ C-CPD, DEPT có sự
khác biệt rất rõ về số lượng nhóm methyl ở vùng δC < 30 ppm.
(Triterpenoid > 5 tín hiệu Me; còn Steroid < 5 tín hiệu Me).

B. Khung β-amyrin vs α-amyrin (cùng là triterpenoid 5 vòng):

• Phổ 13C: như nhau về số lượng nhóm Me ở vùng δC < 30 ppm.
• Phổ 1H: α-amyrin có 2 nhóm >CH-Me → cho 2 tín hiệu doublet
(β-amyrin không có các tín hiệu doublet này)

C. Glycosid vs genin:
Trên phổ 13C-CPD có sự khác biệt rất rõ tại vùng 60 – 80 ppm
- Glycosid: có nhiều (≥ 5) tín hiệu của ose.
- Genin: không có các tín hiệu này của ose.
52
 Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re
Vùng 1,00 – 2,50 ppm (CH3, CH2) bị xen phủ (overlapped), khó phân tích.

53
Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re

(ngay cả khi dãn rộng, cũng khó phân tích)

54
 13
(trích) Phổ C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) của 1 saponosid / Glinus

dấu hiệu của Me

dấu hiệu của ose

55
Các tín hiệu CH3 (*) ở vùng trường cao (< 30 ppm)
của 2 saponin có khung hopan (triterpenoid 5 vòng)

56
 13
Phổ C-CPD của 1 saponin triterpenoid & 1 saponin steroid

8 tín hiệu CH3 / một ginsenosid 4 tín hiệu CH3 / một sap. steroid
(neotigogenin)

Khi gắn thêm (n x rhamnose): sẽ có thêm n tín hiệu CH3 nữa.

57
3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin
Ref:
1. M.W. Hajnos, J. Sherma, T. Kowalska (2008),
TLC in Phytochemistry. p. 519.
2. H. Wagner et als., (2011, 2015),
Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines, Vol. 1, 2, 3.
3. H. Wagner, S. Bladt (1998), Plant Drug Analysis, A TLC Atlas.

58
 3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin

Saponin (genin + glycosid) là nhóm hợp chất rất lớn & đa dạng.
SKLM saponin là 1 nghệ thuật. Cần chú ý các điểm sau:

• Bản mỏng: thông dụng nhất là silica gel F 254 pha thuận (NP).
• Mẫu thử: càng sạch càng tốt; hòa trong [CHCl3 – MeOH; x : y].
nên chấm thành vạch dài # 10 mm (phân giải tốt hơn điểm).
• Dung môi: cùng “tính chất” với đối tượng nghiên cứu
- sapogenin dùng dung môi kém phân cực hơn saponosid.
- mẫu có tính acid: dung môi nên có acid (AcOH, TFA, ForOH)
• Phát hiện vết: UV 254 và/hay thuốc thử AS, VS, VP, H2SO4 10%.
• Để có sắc đồ đẹp: tham khảo tài liệu với keywords tương ứng
(Ginsenosid, Gypenosid, Cardenolid, Madecassoid, Glinus, …)
• Kỹ thuật cụ thể: Tham khảo và ghi chú trong phần thực tập.

59
3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin

Chú ý kỹ thuật thực hiện Ghi chú, mục đích

1. Chấm mẫu thành băng # 10 mm Tăng khả năng phân giải của bản mỏng

2. Để thật khô dung môi hòa mẫu Tránh làm Rf bị thay đổi do dm còn sót

3. Khi khai triển bản mỏng Tránh di chuyển khi đang khai triển

4. Để thật khô dung môi sắc ký Tránh thuốc thử loang lổ không đều

5. Nhúng thuốc thử (VS, AS…) Nhúng nhanh, tránh làm loang vết

6. Để thật khô dung môi của thuốc thử Tránh làm rộp bản mỏng khi sấy nóng

7. Sấy nhẹ kỹ, rồi mới sấy nóng vừa đủ Tránh làm sậm màu nền bản mỏng

T
60
Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm.

Mẫu thử: Cao EtOAc (đã loại bớt tạp) của hạt Móc mèo
Bản Si gel F 254 (Merck). Hiện màu vết = thuốc thử VS.
61
 Một ví dụ về TLC & HPTLC các ginsenosid trong Panax spp.

• Bản mỏng Silica gel F254 (Art No 1.05554, Merck).

• Mẫu thử: Ginsenosid Σ của các loài Panax (đã loại tạp),
chấm vạch dài 8-10 mm, dày 1 mm, cách nhau 6-8 mm.
• Khai triển 1 lần với các hệ dung môi (tham khảo n nguồn):
- S1 = CHCl3 - MeOH - H2O (65:35:10±; lớp dưới)
- S2 = CHCl3 - MeOH - H2O (CMW) (70:30:4±)
- S3 = n-BuOH - EtOAc - H2O (4:1:1±)
- S4 = CHCl3 - EtOAc - MeOH - H2O (15:40:22:10; lớp dưới)
• Phát hiện vết bằng cách phun / nhúng các thuốc thử sau:
AS, VS, VP, H2SO4 10% hay (NH4HSO4 / H2SO4 15%)...

(xem hình sắc ký đồ ở slide sau)

62
 TLC các ginsenosid / Panax spp.

Rg1

Re

Rb1

Sâm Korea Sâm USA Standards Tam thất

Dung môi CMW (70:30:4). Nhúng thuốc thử Vanillin Phosphoric, sấy.
Ref: H. Wagner et als. (2011), Chromatographic Fingerprint… p. 884.
63
 HP-TLC các ginsenosid / Panax spp.

CHCl3–EtOAc–MeOH–H2O (15:40:22:10; lớp dưới)

F11
Rf
Rg1 Rg1

Re Re

Rb1 Rb1

các Bạch Hồng Sâm Tam

chuẩn sâm sâm Mỹ thất
Ref: P. Xie (2006), J. Chromatog. A, 1112, p. 174.
64
 3.10. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, UPLC, LC-detector)

Tài liệu & các công bố về HPLC của saponin cực kỳ phong phú.
Ví dụ, các ginsenosid có thể được phân tích trong các điều kiện:
• Cột sắc ký: RP-18 hay RP-8 (cỡ hạt 5 μm, dài 15 - 25 cm)
• Pha động: [MeOH – H2O] hay [MeOH – AcCN] (x : y) hay
[A: 10 ml 0.1% H3PO4 / 1 L H2O] + [B: AcCN].
• Tốc độ dòng & chương trình dung môi: rất thay đổi.
• Detector: Khúc xạ (LC-RI), tán xạ bay hơi (LC-ELSD),
Khối phổ (LC-MS), LC-PDA/UV ở < 210 nm.

Tham khảo trên internet với keywords HPLC, saponin…

65
 Ref: B.S. Sun et als. (2009),
J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50, pp. 15-22.

HPLC–ELSD chromatograms of ginsenosides (2 slide kế)

(A) Mixed standards (C) Red ginseng
(B) White ginseng (D) Black ginseng

1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rb1; 5, Rc; 6, Rb2; 7, Rd; 8, Rg6;

9, F4; 10, Rk3; 11, Rh4; 12, 20(S)-Rg3; 13, 20(R)-Rg3;
14, 20(S)-Rs3; 15, 20(R)-Rs3; 16, Rk1; 17, Rg5; 18, Rs5; 19, Rs4.

66
Các ginsenosid chuẩn
(g1 – e – d – b1 – c – b2)

Dịch chiết từ Bạch sâm

67
 Rb1

Rc
Red Ginseng
(g1 – e – d – b1 – c – b2)
Rg1
Rb2

Re
Rd

Black Ginseng

68
 S.N. Kim et als. (2007)

14 ginsenosid chuẩn

1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rh1; 5, Rg2; 6, Rb1; 7, Rc; 8, Rb2; 9, Rb3;

10, Rd; 11, Rg3; 12, Rk1; 13, Rg5; 14, Rh2; IS, internal standard (digoxin).

S.N. Kim et al. (2007), J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
69
 S.N. Kim et als. (2007)

Bạch sâm

S.N. Kim et al. (2007), J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
70
 S.N. Kim et als. (2007)

Hồng sâm cô đặc

S.N. Kim et al. (2007), J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
71
 Ref: Wagner et als (2011), p.888

Panax ginseng
PPD
Rb1
PPT

Rg1 Re

4: polyacetylen
Panax notoginseng 5: stigmasterol

Rg1 Rb1
PPT

PPD

Re

72
4.1. Tính tạo tủa với dd. chì acetat

4.2. Các phản ứng màu của saponin

• Salkowski (1872).
• Liebermann-Burchard (1889) ***
• Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905).
• Với thuốc thử AS, VS, VP, acid sulfuric…

4.3. Tính tạo phức với cholesterol

4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid

73
4.1. Tính tạo tủa phức với d. dịch chì acetat
Saponin có thể tạo tủa với 3 loại d.dịch chì acetat (acid, kiềm và
trung tính). Vì vậy, Robert (1917) đã chia saponin thành 3 loại:
• saponin kiềm: tủa với dd. chì acetat kiềm.
• saponin trung tính: tủa với dd. chì acetat trung tính.
• saponin acid: tủa với dd. chì acetat acid.

Có thể áp dụng tính chất này để làm giàu, tinh chế saponin
trong quá trình chiết xuất – phân lập saponin.

4.2. Các phản ứng màu

Từng saponin riêng biệt có thể cho một số phản ứng màu khá
chuyên biệt. Tuy nhiên, phản ứng màu chung cho nhóm saponin
(để định tính, phát hiện) thì khá ít và lại không thực sự đặc hiệu.
74
 4.2.1. Phản ứng Salkowski (1872).
Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ. dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d. dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3).
• mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím – tím than).
• lớp d. dịch phía trên có màu tím, nâu, nâu đỏ (không thật rõ).

4.2.2. Phản ứng Liebermann-Burchard (L-B, 1889).

Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ. dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d. dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3 + Ac2O).
• mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím hồng – tím than).
• lớp d. dịch phía trên có màu xanh lá (~ có khung steroid)
hoặc màu nâu đỏ (~ có triterpenoid).

Ph. ứng này chỉ nên dùng để phát hiện saponin (q. sát vòng nhẫn).
Việc phân biệt (q. sát màu d. dịch bên trên) thì ko thực sự chắc chắn.
75
 (saponin) H2SO4 đđ. • vòng nhẫn (màu sậm)
(Ac2O + CHCl3) d = 1,84 • lớp trên có màu (xanh, đỏ, tím…)

76
• Toàn bộ hệ thống (mẫu, tube, pipet…) phải thật khô.
Nếu không: Khi cho acid vào sẽ sôi mạnh, tỏa nhiệt nhiều.
• Nếu vòng nhẫn quá dày hoặc/và lớp trên có màu quá sậm:
Cần phải pha loãng mẫu thử (với Ac2O hay với CHCl3)
• Phản ứng dương tính (có saponin; steroid hay triterpenoid) khi:
- Có vòng nhẫn màu sậm (hồng tím, tím, tím than, nâu sậm…)
- Lớp trên màu xanh rêu, xanh lá đậm nhạt; nâu đỏ… đều được.

• Phản ứng nguy hiểm:

☠ ∙ ∙

- Không thực hiện trên tay (phải để nghiêng / giá, becher…)

- Khi rửa tube: tuyệt đối không rót nước vào tube còn nhiều acid.

77
4.2.3. Các phản ứng màu khác
Một số tài liệu còn đề cập tới vài phản ứng màu của saponin:
• Ph.ứng Rosenthaler (Vanillin + HCl, Δ) → màu tím hoa cà.
• Ph.ứng Carr-Price (SbCl3 / CHCl3) → h. quang vàng, xanh.

Các phản ứng này đều ít có ứng dụng thực tế.

4.2.4. Phản ứng với các thuốc thử (hiện màu / SKLM)
Thường dùng thuốc thử có [aldehyd thơm] + [Oxy acid mạnh]:
• Anisaldehyd Sulfuric (AS)
• Vanillin Sulfuric (VS). Sau khi sấy bản mỏng:
• Vanillin Phosphoric (VP). vết saponin thường cho
• H2SO4 10% / cồn tuyệt đối các màu tím khác nhau.
• NH4HSO4 / H2SO4 15%...
78
Đọc thêm
Phản ứng Salkowski, Liebermann vs Liebermann-Burchard

Ban đầu, cả 3 phản ứng màu này đều áp dụng riêng cho cholesterol.
Có thể tóm tắt như sau (mẫu = vài mg cholesterol / 1 ml dung môi).

Phản ứng dung môi + 1-2 γ H2SO4, lắc + 1 ml H2SO4 dọc thành ống ngo

Salkowshi • lớp trên: đỏ nâu, vàng nâu

1 ml CHCl3 màu đỏ, đỏ nâu
(1872) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)

Liebermann • lớp trên: xanh lá sậm, tối

1 ml Ac2O đỏ rồi →→ xanh lá
(1885) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)

L-Burchard 1 ml h.hợp • lớp trên: xanh lá sáng, lan lên

xanh lá (hơi chậm)
*(1889)* CHCl3 Ac2O • nhẫn: tím hồng, tím, tím sậm

hay EtOAc, n-BuOH, AcOH

79
• Trước 1960s, nhiều tác giả dùng phản ứng L – B để phân biệt 2 nhóm
- triterpenoid: lớp d.dịch bên trên có màu nâu vàng, nâu đỏ, nâu sậm.
- steroid: lớp d.dịch bên trên có các màu xanh rêu, xanh lá, xanh tím.

• Đến 1960s, người ta nhận thấy saponin/quả Bồ kết tuy là triterpenoid,

nhưng lớp dung dịch bên trên lại có màu xanh rêu đến xanh lá.

• Hiện nay, không thấy báo cáo phân biệt steroid vs triterpenoid
bằng cách quan sát màu lớp dung dịch bên trên nữa.
Chỉ còn quan sát vòng nhẫn: (+) → saponin (triterpenoid or steroid).

• Tuy vậy, nếu lớp d. dịch phía trên có màu xanh rêu, xanh lá thì vẫn
có thể sơ bộ kết luận rằng: có khung steroid trong mẫu thử
(áp dụng trong định tính khung steroid / glycosid steroid trợ tim).

• Phổ NMR hiện là công cụ hữu hiệu để phân biệt steroid vs triterpenoid.
80
 4.3. Tính tạo phức với Δ’ 3β-OH-steroid
Từ 1910, Windaus đã nhận thấy rằng, tính phá huyết của saponin
sẽ giảm rất mạnh khi có mặt của cholesterol (và Δ’ 3β-OH-steroid).

Đó là do saponin kết hợp với các steroid này để tạo 1 tủa phức.
Phản ứng này sẽ xảy ra dễ dàng với saponin có mạch ose dài.
Sự kết hợp giữa Digitonin (1 saponin có 1 mạch gồm 5 ose) với
Cholesterol xảy ra gần như hoàn toàn (ph. ứng ko loại bỏ H2O):

Digitonin + Cholesterol → → Tủa Cholesterol-Digitonid

(1229 = 76,1%) (386 = 23,9%) (1615 = 100%)

Có thể dùng phản ứng này để định lượng digitonin bằng cholesterol
(và ngược lại). Khi định lượng 1 saponin khác digitonin, có thể dùng
phản ứng này với sự quy đổi theo MW của saponin thực tế dùng.
81
 Hoặc không cần quy đổi, có thể thực hiện theo cách sau:

• Dung dịch saponin / nước + bột cholesterol (chính xác, thừa).

• Khuấy kỹ 1 – vài giờ. Để lắng, lọc & rửa tủa vài lần với nước.
• Thu lấy kết tủa và sấy nhẹ (# 40oC) đến khi tủa thật khô.
• Hòa tan tủa hoàn toàn vào V ml pyridin lạnh, khan (phá phức).
• Thêm # 10 V ml ether ethylic lạnh vào:
Cholesterol (mới sinh + còn dư) sẽ tan hết trong Et2O.
Saponin ko tan / Et2O được lọc & rửa kỹ bằng Et2O lạnh.
• Sấy tủa saponin sản phẩm đến khối lượng không đổi.
• Tính hiệu suất %...

82
 Minh họa sự tạo phức của Saponin với Cholesterol

(gốc: Windaus, 1910; thực hiện theo Schoenheimer & Dam, 1933;
hay cải tiến khác bởi Christiani & Pailer, 1937; Bergmann, 1940…)

83
 Một áp dụng của phản ứng này trong kỹ thuật làm giảm
hàm lượng “chất béo” & cholesterol trong sữa:
• Trộn Pg bột Celite với 3P g hỗn hợp saponin từ cây Quillaija
saponaria (cả 2 đều đạt tiêu chuẩn thực phẩm).
• Cho 4P g matrix trên vào 100P g sữa cần loại bớt cholesterol.
Bột Celite sẽ giúp phức [sap – cholesterol] mau lắng xuống
và được tách riêng.
• Sữa thu được sẽ có cholesterol% giảm đáng kể.

84
4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid

Tùy cấu trúc, độ dài của mạch đường, tùy độ bền của phần genin,
tùy mục đích… có thể thủy phân bằng các đ. kiện rất khác nhau.

A. Để xét cấu trúc, trình tự của mạch đường dài, có thể sử dụng
ph. pháp thủy phân từng phần (pp. bậc thang) ở to thường:
(Saponosid / MeOH) + (HCl 5%, khuấy 6-12 h) → → các ose

Các ose (thu được tuần tự sau 1, 2, n giờ) sẽ được phân tích
(SKLM, SKG…) so sánh với các chuẩn (Gal, Glc, GlcA, Rha…)
để cung cấp các thông tin về mạch đường của saponosid.

Hiện nay, pp. phổ NMR cũng đã giải quyết tốt mục tiêu này rồi.
(phân tích trình tự mạch ose mà không cần thủy phân nữa!)

85
B. Nếu genin dễ biến tính bởi nhiệt độ cao:

Có thể thủy phân bằng các điều kiện nhẹ nhàng, ví dụ:
• các enzym (β-glucosidase từ hạt Hạnh nhân, β-glucuronidase lấy
từ nhớt con Sên Helix pomatia, hay hesperidinase, diastase…)
• AcOH 50% ở 70oC × 6 giờ (pp. Shibata).

Sản phẩm thủy phân là các sapogenin + hỗn hợp các ose.

86
 C. Nếu các sapogenin bền nhiệt

Có thể thủy phân lâu bằng các acid vô cơ mạnh + nh. độ cao:
• HCl 5%, 10%, 15%, đun nóng 100oC x vài giờ.
• H2SO4 10% / nước hay cồn; đun hồi lưu sôi trong vài giờ.

Sản phẩm thủy phân sẽ gồm (các) sapogenin + các loại ose.
Trong nhiều trường hợp, nếu mạch ose có phần glycuroric
(như GlcA, GalA…), nhóm ω-COOR / ose vẫn ko bị thủy phân.

Để theo dõi quá trình thủy phân, có thể kiểm tra liên tục các
sản phẩm (sapogenin) sau 1, 2, 3, n giờ bằng ph. pháp SKLM.
Các genin (kém phân cực hơn saponosid) sẽ cho vết có Rf cao
hơn hẳn saponosid trên sắc ký đồ. Khi diện tích của vết genin
không thay đổi nữa, ta nói phản ứng thủy phân đã hoàn toàn.
87
 Phân bố rộng rãi trong giới thực vật, đặc biệt là ở Ngành Hạt kín.
(thực tế, không gặp saponin trong Ngành Hạt trần).
Một số hải sinh vật (Sao biển, Hải quỳ…) cũng chứa saponin

• Sap. triterpenoid (75% Σ) gặp chủ yếu trong Lớp Hai lá mầm.
• Sap. steroid gặp chủ yếu trong Lớp Một lá mầm (như Liliaceae,
Dioscoraceae, Agavaceae, Smilacaceae…); ít gặp trong Lớp Hai lá
mầm (Fabaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae)
• Sap. steroid alkaloid hay gặp trong chi Solanum (Solanaceae)

• Saponin có trong nhiều bộ phận thực vật khác nhau, ở cả phần

dưới mặt đất cũng như trên mặt đất.
• Hàm lượng saponin trong cây thường cao, một số có thể > 10%
(Cam thảo, Quillaja, Bồ kết, Bồ hòn, Yucca…)
88
 Note: Hiện nay đã có > 1050 saponin từ 29 bộ, 100+ họ thực vật;
trong đó khoảng 3/4 là saponin triterpenoid (BGDL I, p. 212).
• Saponin triterpenoid
Đã gặp 750 sap. triterpenoid với 360 aglycon (J.M. Berger, 2001).
Sap. triterpenoid (chủ yếu là phân nhóm oleanan) có trong > 500
loài / 100 họ thực vật. Phân nhóm Lanostan hay gặp trong hải sinh
vật (Sao biển, Hải sâm…)
• Saponin steroid
Đã gặp trong > 85 loài thuộc 59 chi thực vật (SM. Hassan, 2008).
Các chi hay gặp saponin steroid là Agave, Dioscorea, Yucca.
• Sap steroid alkaloid: thường gặp / chi Solanum (họ Solanaceae).

Hai nhóm saponin được khai thác thương mại nhiều nhất là từ cây
Yucca schidigera và Quillaja saponaria (đều thuộc Châu Mỹ).
89
Tính đến 2013, đã phân lập được > 20.000 triterpenoid
dưới dạng sapogenin hoặc saponin (Q. Michaudel, 2013)

90
 Hàm lượng saponin (%) trong một số thực vật (cần bổ sung):

Rễ Cam thảo (bắc) 12 – 32% Rễ Ngưu tất (bắc) 3 – 7%

Quả Bồ hòn 16% Cây Rau má 1 – 6%
Yucca (Asparagaceae) 6 – 10% Hạt Đậu nành 0,2 – 0,5%
Vỏ thân Quillaja 10% Cây Rau đắng biển
Lá Củ cải đường 5,8% Rễ củ Thiên môn đông
Quả Bồ kết > 10%
Rễ củ Mạch môn đông
Rễ củ Nhân sâm 3-4%
Thân rễ Thổ phục linh
Rễ củ Tam thất 8%
Dứa Mỹ, Thùa (Agave) < 1%
Vỏ Ngũ gia bì
Thân rễ Tỳ giải
Rễ củ Đinh lăng
Cát cánh Viễn chí

Một TLTK cần thiết về phân bố saponin trong thực vật:

J-P. Vincken, L. Heng, A. de Groot, H. Gruppen (2007), Saponins: Classification

and Occurrence in the Plant Kingdom. Phytochemistry, 68, pp. 275–297.
91
92
• Các saponin có hàm lượng cao (Bồ hòn, Bồ kết, Cam thảo…)
→ Kết tủa trong n6, EP, Et2O, Cf, DCM, aceton
• Các saponin có tính acid (Glycyrrhizin, Glycuronid…)
→ Kết tủa trong dung dịch acid loãng (HCl…)
• Các saponin có ít ose (1-2 mạch x 1-2 ose; như ginsenosid)
→ Lắc với “n-BuOH b. hòa nước” hay “i-ProOH b. hòa nước”
• Các saponin có MW khác nhau rõ rệt (và MW < 4000).
→ Dùng SKC rây phân tử (Sephadex G hay LH-20.)
• Các sapogenin & saponosid có độ phân cực khác nhau
→ SKC phân bố với Si gel RP-8 hay RP-18.
→ SKC phân bố với Diaion HP-20 (Mitsubishi).

93
1

94
2

95
3

Mẫu / H2O được lắc với “n-BuOH bão hòa nước”.

(ko phải n-BuOH nguyên chất, neat)

(1-2 mạch) x (1-2 ose)

• các saponin “ít” ose
Lớp n-BuOH
• các glycosid “ít” ose

• các saponin “nhiều” ose

• các glycosid “nhiều” ose
Lớp nước
• các polysaccharid, tannin
• đường tự do, muối…

Đôi khi thay “n-BuOH bão hòa nước” bằng “isopropanol bão hòa nước”
96
97
4

Mẫu / H2O được nạp lên cột chứa Diaion HP-20.

Khai triển bằng (H2O – MeOH) với MeOH % tăng dần:

Các saponosid
98
99
 A. Nguyên tắc chung

• Phân lập (isolation) là kỹ thuật tách riêng từng hợp chất tinh khiết
ra khỏi 1 hỗn hợp phức tạp bằng nhiều cách khác nhau.
• Độ tinh khiết của các sản phẩm này phải cao (ví dụ, có thể đem đo
phổ NMR để xác định cấu trúc được).
Muốn vậy, cần phải trả lời được các vấn đề sau
• Tên chính xác (khoa học) của mẫu nghiên cứu.
• Thành phần hóa học (sơ bộ) của mẫu nghiên cứu.
• Đối tượng nghiên cứu cụ thể: cấu trúc chung, độ bền, tính tan…
- Glycosid: số & độ dài mạch ose. Glycosid hay glycuronid
- Aglycon: độ phân cực tương đối.

100
 B. Trình tự tiến hành (đề nghị)

B1. Chiết xuất (→ cao chứa hầu hết các thành phần chính)

• Chọn quy cách dược liệu (cỡ bột thô, vừa, mịn…)
• Chọn dung môi chiết
- cho glycosid: MeOH-nước hay EtOH-nước (25; 50; 70%...)
- cho genin: cồn cao độ
- cho các cấu trúc có tính acid: dùng [cồn + kiềm]…
• Chọn kỹ thuật chiết (ngấm kiệt ngược dòng, đun hồi lưu…)
• Chọn nhiệt độ chiết (thường, nóng)
• Cách kiểm tra việc chiết được, hoặc chiết đã xong.
• Cách cô dịch chiết (thường, cách thủy, giảm áp…)

101
 B2. Loại tạp, làm giàu dịch chiết (→ cao Σ chứa ít tạp hơn)

Xác định nhóm tạp (tinh bột, diệp lục, chất béo, polyphenol…)
• Chọn cách loại bỏ tạp
- tinh bột: chọn d. môi chiết chứa ít nước; để lắng lạnh.
- diệp lục, sắc tố: nước lạnh, than hoạt, chì acetat.
- chất béo & kém ph.cực: lắc phân bố với các dmhc kém ph.cực.
- polyphenol (tannin…): chì acetat*, Celite, cột Silica gel, …
• Chọn dung môi chiết “chuyên biệt” (lắc phân bố với dd. nước)
- với ginsenosid (et als): chiết với “n-BuOH bão hòa nước”
- với sapogenin: chiết với CHCl3, EtOAc, “EtOAc bão hòa nước”
• Kiểm tra hiệu quả loại tạp (SKLM cao trước & sau khi loại tạp).

102
B3. Phân lập

Chọn cách phân lập sơ bộ (→ các phân đoạn đơn giản hơn)
- VLC với Silica gel NP, SKC với Diaion HP-20…
- Cách theo dõi thành phần các ph. đoạn (hệ SKLM & th’ thử…)
• Chọn cách phân lập chính
- qui mô nhỏ (< hàng chục mg): p-TLC, p-HPLC
- qui mô lớn hơn: SKC (h’. phụ, ph. bố, rây ph. tử…), p-HPLC…
- cách theo dõi quá trình phân lập (hệ SKLM với th’ thử…)
• Chọn cách tinh chế sản phẩm
- Kết tinh phân đoạn, kết tinh lại hay tinh chế qua SPE, cột mini…
- Tinh chế bằng các kỹ thuật khác
• Kiểm tinh khiết: SKLM, HPLC, so sánh dữ liệu phổ UV, IR…

103
1

104
 neo-tigogenin
Benzen – EtOAc (1 : 1)

neo-hecogenin

★
Σ nT nH nG Σ
neogitogenin

105
2

106
3

107
4

108
7b1. Dùng Chì acetat (loại bỏ tủa phức chì - polyphenol)

( + H2S → PbS↓ )

109
7b2. Dùng Chì acetat (Lấy tủa phức chì - saponin)

110
7b3. Dùng bột Cholesterol (theo Walter, 1954)

111
 7b4. Dùng bột hấp phụ

Khi các saponin bị lẫn nhiều tạp phân cực (nhất là tannin)
thì có thể tinh chế saponin theo cách sau

• Hòa tan mẫu [sap + tannin] vào 1 lượng tối thiểu* nước nóng.

• Tẩm dịch nước đậm đặc này vào 1 lượng vừa đủ* bột hấp phụ
(bột Kieselguhr = Celite; bột polyamid hay bột Mg oxyt).

• Chiết saponin ra khỏi matrix này bằng EtOH 70-80% nóng.

Lọc dịch chiết rồi cô thu hồi cồn thu cắn saponin (sạch hơn).

• Do phân cực hơn saponin nên tannin không bị giải hấp ra khỏi
matrix này.

112
7b5. Phương pháp thẩm tích (qua màng bán thấm, MBT)

Dòng nước chảy liên tục

MBT

Saponin lẫn tạp

có phân tử nhỏ

tạp có phân tử nhỏ

bị rửa trôi

113
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

A. Dùng cột hấp phụ (ví dụ VLC qua Si-gel NP)

Thường dùng cột VLC* (d lớn, h < 20 cm)
Pha tĩnh: Si-gel NP (cỡ hạt vừa = 40-63 hoặc thô = 63-200 μm)
Mẫu thử: Dạng bột khô / Si-gel, P mẫu # 1/10 P Si-gel.
Hệ dung môi sử dụng: có độ phân cực tăng dần ***.
Thể tích mỗi phân đoạn: nhiều [V (ml) # P Si-gel (gam)]
Các phân đoạn đầu sẽ chứa các tạp kém phân cực (bỏ).
Các phân đoạn giữa sẽ chứa các sapogenin rồi saponosid (thu).
Các phân đoạn cuối (hoặc phần bị giữ lại trong cột) sẽ chứa các
tạp rất phân cực (tannin, polysaccharid, muối, đường tự do…).
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 và th’ thử AS, VS hay H2SO4 10%.

114
 7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

B. Dùng cột rây phân tử (Sephadex LH-20* hoặc G-25).

Dùng để loại bỏ các tạp chất có MW khác xa* MW của sap.
Thường dùng cột có d hẹp (< 5 cm); h dài (~ 100 cm)
Pha tĩnh: Sephadex LH-20* (dạng hỗn dịch / MeOH).
Mẫu thử được hòa trong MeOH (V mẫu # 1/20 V Sephadex).
Khai triển với MeOH* (thông dụng nhất) hay (H2O + MeOH).
Các hợp chất có MW lớn hơn sẽ ra trước, MW nhỏ hơn sẽ ra sau.
Kiểm tra vết bằng SKLM / UV 254 và th’ thử VS, AS, H2SO4 10%

Sephadex LH-20 rất đắt tiền (> 30 triệu VNĐ / 100 gam)
115
 7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

C. Dùng cột phân bố đảo (Diaion HP-20*)

Mục đích: Chọn phân đoạn (hỗn hợp) có độ ph. cực thích hợp.
Thường dùng cột có d khá lớn (~ 5 cm), h tr. bình (50-60 cm).
Pha tĩnh: Diaion HP-20* (Mitsubishi), hỗn dịch / nước or MeOH.
Mẫu thử: hòa tan (hay hỗn dịch) / nước hoặc MeOH-nước.
Khai triển bằng [H2O – MeOH] (với MeOH% tăng dần).
• Các hợp chất rất phân cực (ose, muối, PS, tannin) sẽ ra trước.
• Các glycosid phân cực → glycosid ít ph. cực → genin sẽ ra sau.
• Các hợp chất kém phân cực sẽ ra sau nữa (hoặc bị giữ lại cột).
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 hay thuốc thử AS, VS, H2SO4 10%.

116
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

D. Dùng SKLM chế hóa (SK lớp dày / Silica gel NP)

Lớp Si-gel có diện tích lớn; bề dày 1 – vài mm;

Mẫu (chỉ vài chục mg) hòa / MeOH, chấm thành băng liên tục

Khai triển với hệ dung môi thích hợp*

Phát hiện vết: UV 254*, đôi khi bằng thuốc thử (chú ý kỹ thuật).

Cạo các vết trên bản si-gel, chiết lại bằng MeOH (hay MeOH-Cf)

Lọc loại bỏ phần Si-gel (không tan), thu dịch lọc hòa tan vết.

Bay hơi dung môi, thu cắn/tủa…

117
8.1. Định tính tạo bọt (trong ống nghiệm)
Xác định chỉ số bọt (CSB)
8.2. Định tính phá huyết (lam, thạch máu, ống nghiệm)
Xác định chỉ số phá huyết.
8.3. Định tính tạo phức với cholesterol.
8.4. Định tính bằng các phản ứng màu
trong ống nghiệm (Salkowski, Liebermann-Burchard)
trên bản mỏng (thuốc thử AS, VS, VP hay H2SO4...)
8.5. Định tính bằng SKLM.

118
A. Nguyên tắc chung
• Vì protein, polysaccharid cũng có thể tạo bọt như saponin →
chiết bằng cồn 70% (ko chiết = nước, tránh dương tính giả).
• Vì cồn có thể phá bọt → cần loại bỏ cồn trong dịch thử nghiệm
(tránh âm tính giả).

B. Thực hiện (thống nhất theo 1 quy định chung, xem thực tập)

• 0,5 g mẫu + 10 ml cồn 70%, đun cách thủy trong 5 phút.

• Lọc nóng qua bông, cô đến hết cồn (thu dịch nước).
• Cho 0,5 ml dịch cô này vào 1 tube (size 16) có sẵn 10 ml nước.
• Nút tube, lắc mạnh dọc tube (đúng 30 lần / đúng 60 giây).
• Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++).
119
120
Chỉ số bọt (CSB) là số ml nước để hòa tan saponin có trong 1 gam
nguyên liệu (= độ pha loãng*), cho cột bọt cao 1 cm sau khi lắc *.
Tiến hành thực nghiệm trong các điều kiện quy định.

• cỡ bột nguyên liệu: 0,5 mm. • 10 tube (1.6 x 16) cm.

• + 100 ml nước sôi * • chứa 1 → 10 ml dịch A.
• đun sôi nhẹ 1 lần = 30 phút. • thêm nước vừa đủ 10 ml.
• Lọc nóng (giấy, bông), để nguội. • Lắc dọc 15 sec = 30 lần *.
• + nước vừa đủ 100 ml (dịch A). • Đo h (cm) cột bọt sau 15’.

121
 n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml
(độ pha loãng = 1/C = 1000/n)

1‰ 2‰ 3‰ 4‰ 5‰ 6‰ 7‰ 8‰ 9‰ 10‰

1000 500 333 250 200 167 143 125 111 100
122
 cột bọt ở ống số 4 = 0,8 cm
cột bọt ở ống số 4,4 = 1,0 cm
cột bọt ở ống số 5 = 1,3 cm

Trên lý thuyết: Thực hiện lại 10 ống từ 4.1 đến 5.0. Thực tế: Nội suy.

123
 A. Nguyên tắc chung
• Khi mẫu thử không có tính phá huyết hoàn toàn thì trong d. dịch
đẳng trương, vẫn còn (một số) hồng cầu ở nguyên trạng,
và sẽ lắng xuống (cặn màu đỏ) sau 1 thời gian nhất định.

• Khi mẫu thử có tính phá huyết hoàn toàn, tất cả hồng cầu bị phá
hủy màng, hemoglobin thoát ra và nhuộm hồng dung dịch đẳng
trương (không có hồng cầu lắng xuống đáy tube).
124
 A. Nguyên tắc chung (tt)
• Để tránh nhầm lẫn khi nhận định kết quả (do fibrin lắng
xuống đáy tube), máu thử nghiệm cần phải loại bỏ hết fibrin.
Môi trường thử nghiệm cũng phải là môi trường đẳng trương
(thường dùng dung dịch muối sinh lý trong suốt thử nghiệm).

• Máu thử nghiệm được quy định tùy tài liệu, nhưng nên chọn
máu động vật mà màng hồng cầu dễ bị phá hủy (nhạy).
Thường chọn máu cừu, đôi khi của thỏ, bò & động vật có sừng.

• Sau khi loại fibrin, pha máu thành dịch treo 2%, bảo quản mát.
(có thể thêm chất chống đông…)
125
B. Các kỹ thuật chung

Có thể thử nghiệm tính phá huyết bằng cách quan sát

- Quá trình phá huyết trên lame (qua kính hiển vi).
- Sự khuếch tán hemoglobin + hồng cầu lắng đọng (tube)
- Vòng phá huyết trên dĩa thạch máu (pétri).

Căn cứ vào đường kính vòng phá huyết (dĩa thạch máu); hoặc
nồng độ tối thiểu của dịch thử gây nên sự phá huyết hoàn toàn*
(/ tube) → khái niệm định lượng về tính phá huyết của (saponin
trong) dịch thử nghiệm.

* ống phá huyết “đầu tiên và hoàn toàn” 126

 C. Tiến hành (xem phần thực hành, lưu ý sự khác biệt)
• Chỉ số bọt (CSB)
Là độ pha loãng cần thiết của 1 gam dược liệu để tạo được một
lớp bọt cao 1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong
điều kiện quy định.

• Chỉ số phá huyết (CSPH)

Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có
trong 1 gam dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn
đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định.

CSB: dịch thử + dung môi.

CSPH: dịch thử + dung môi + dịch máu
127
 không phá huyết hoàn toàn phá huyết hoàn toàn
khác “phá huyết không hoàn toàn” dung dịch trong veo!
128
(thực hiện trong dãy ống nghiệm nhỏ)

[C] thấp nhất / các ống phá huyết

129
• Phản ứng Salkowski (1872)

• Phản ứng Liebermann-Burchard (1889) ***

• Phản ứng Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905)

• Với các thuốc thử (trên SKLM) *

130
 Mẫu/CHCl3 + vài giọt H2SO4 đđ. nâu đỏ, tím, tím sậm

Ban đầu, phản ứng này chỉ dùng để định tính cholesterol.
Với saponin nói chung, màu của sản phẩm phản ứng thì không
thực sự rõ ràng (ngay cả khi thực hiện với kỹ thuật dùng nhiều
acid, nhỏ dọc thành tube… và ngay cả khi thực hiện trên mẫu
là cholesterol tinh khiết).

Hiện nay, phản ứng Liebermann-Burchard (L-B) thì thông dụng

và hữu hiệu hơn (xem phần sau).

131
 Ban đầu, cũng chỉ dùng để định tính cholesterol (Є steroid)
• Phản ứng Liebermann (1885, chưa dùng CHCl3):
(Steroid / Ac2O) + H2SO4 đđ → màu xanh / đỏ.

• Phản ứng L-B (1889; dùng CHCl3 + Ac2O):

(Steroid / CHCl3.Ac2O) + H2SO4 đđ → dd. màu xanh.

Ac2O dùng để làm khan môi trường và để pha loãng H2SO4.

Có thể thay Ac2O bằng AcOH glacial, EtOAc, hay BuOH (khan).
Cơ chế phản ứng: có nhiều đề nghị, nhưng chưa rõ ràng (2007).
Kỹ thuật thực hiện: dùng ít/nhiều H2SO4; xem slides phía sau.
132
• Hệ thống phải thật khô. Khi thực hiện: cấm cầm trên tay.
• Cho dư Ac2O + Lắc kỹ. Nhỏ acid trôi xuôi theo thành tube.
• Rất chú ý khi rửa ống nghiệm này (Coi chừng phỏng mắt)!
133
 Một nhận định tham khảo

Các phản ứng Salkowski và L-B được nghiên cứu khá nhiều.
Theo Schoenheimer & Sperry (1934); Brieskorn & Capuano (1953):
Cơ chế của các phản ứng này thì như nhau.
Màu của sản phẩm sẽ thay đổi theo tỉ lệ k = [H2SO4 / Ac2O]
• Khi k lớn (ít Ac2O) → a red-purple color (ph. ứng Salkowski).
• Khi k bé (nhiều Ac2O) → a green color (phản ứng L-B).
Ac2O có vai trò làm khan môi trường, pha loãng H2SO4 và có thể
thay thế bằng các dung môi khan khác như AcOH, EtOAc, n-BuOH.

134
8.3c. Phản ứng Carr – Price

8.3d. Phản ứng Rosenthaler

135
• Khi các ph. pháp phổ (NMR…) còn sơ khai, thì các ph. ứng màu

của saponin (và HCTN) còn có nhiều ứng dụng trong định tính,

định danh tuy tính chuyên biệt không thực sự thuyết phục.

• Hiện nay, các phản ứng màu của saponin (& HCTN) chỉ có vai trò

khiêm tốn trong việc nhận định & phân biệt sơ bộ mà thôi.

• Để định tính, định danh mẫu; hiện nay, các ph. pháp phân tích

dụng cụ (HPLC-RI, LC-ELSD, LC-MS…) cùng các ph. pháp phổ học

(MS, NMR) được ứng dụng nhiều với sự chính xác rất cao.

136
8.4a. SKLM (TLC) và SKLM hiệu năng cao (HP-TLC)

Rất thường được sử dụng nhằm nhiều mục đích

• So sánh các mẫu đa thành phần (dược liệu thử // dl chuẩn…).
• So sánh các hợp chất tinh khiết riêng biệt (đồng nhất Y/N)
• Xác định sự có mặt Y/N của 1 chất trong 1 hỗn hợp.
• Theo dõi quá trình phản ứng (tổng hợp, thủy phân,…)
• Theo dõi quá trình khai triển SKC
• Sơ bộ kiểm tinh khiết. Có thể bán định lượng.
• Định danh nhóm của từng vết (nhở th’ thử chuyên biệt…)
• Thử nghiệm sinh học (sàng lọc ngay trên vết của sắc ký đồ)
137
8.4b. HPLC, UPLC (ghép với các detector khác nhau; **LC-det.)

Là các công cụ hữu hiệu, đa năng, đáng tin cậy và phổ biến.
Khi ghép nối với các detector khác nhau, tính năng của chúng
sẽ càng thêm phong phú. Các ứng dụng chủ yếu:
Kiểm nghiệm (định tính, định lượng, định danh…) mẫu.
Các chi tiết sẽ được tham khảo trong học phần riêng biệt.

Riêng với saponin, cần chú ý các detector ghép với hệ thống
(**LC-det.) phải phù hợp với các cấu trúc không có chromophore.
Thường dùng các detector RI, ELSD, PDA (vùng cận 205 nm), MS.
Trong số này, MS là 1 detector cực kỳ hữu hiệu (LC-MS)…
138
9.1. Phương pháp cân

9.2. Phương pháp acid – base

9.3. Phương pháp so màu

9.4. Phương pháp phổ UV-Vis

9.5. Phương pháp SKLM (TLC & HP-TLC)

9.6. Phương pháp HPLC-detector

(LC-RI, LC-UV, LC-PDA, LC-ELSD, LC-MS…)

139
140
141
 Phương pháp cân chỉ thực sự đúng khi hòa tan được (chiết được)
hoặc kết tủa, kết tinh được hoàn toàn & riêng biệt đối tượng thử.

Rất khó thực hiện được các yêu cầu này.

Sai số do vậy thường khá lớn đến rất lớn.
Ví dụ:
• Không thể kết tủa hoàn toàn glycyrrhizin (từ Cam thảo) / mt acid
(mọi pH); nhưng lại kết tủa một số chất không phải là glycyrrhizin.

• Không thể chiết hoàn toàn ginsenosid (từ dịch nước Nhân sâm)
bằng “n-BuOH bhòa nước” nhưng lại chiết được một số chất khác,
không phải ginsenosid (sai số dư ? thiếu ?).

Định lượng bằng pp. cân chỉ nên áp dụng trong 1 số trường hợp *.
142
Ví dụ: Định lượng [tri, di, mono ammonium] glycyrrhizat:

Chuyển các ammonium glycyrrhizat → acid glycyrrhizic bằng HCHO.

Chuẩn độ acid glycyrrhizic mới tạo thành bằng d. dịch NaOH 0,1 N.

(CH2)6N4

acid glycyrrhizic
(C42H62O16 = 822)

1 ml NaOH 0,1 N # 27,4 mg acid glycyrrhizic (= glycyrrhizin)

Kết quả định lượng được quy về # glycyrrhizin
143
Chỉ áp dụng với các mẫu có tính acid (hoặc base) rõ rệt.
Tính acid / base mạnh sẽ là một thuận lợi.
Nếu tính base yếu quá (pKa quá nhỏ, ví dụ < 2): môi trường khan!

Sai số sẽ cao khi có nhiều tạp chất acid (hoặc base) khác.

Dung dịch định lượng thường đã có màu khá sậm, khó quan sát
điểm tương đương nhờ chỉ thị màu.

144
Áp dụng định luật Lambert-Beer, so sánh độ hấp thu của dd. thử
với các dd. đối chiếu đã biết nồng độ (trong vùng tuyến tính).

145
Một ví dụ: Định lượng các genin triterpenoid 5 vòng bằng ph. pháp
quang phổ UV (đo ở 310 nm) sản phẩm của chúng với H 2SO4 đđ.

Căn cứ vào độ hấp thu (Abs), so sánh với các dd. chuẩn thích hợp,
có thể suy ra hàm lượng của các sapogenin trong mẫu thử.

146
 So sánh vết định lượng với 1/các vết chuẩn (đã biết lượng chấm)
• về diện tích vết / UV (không có hoặc có thuốc thử)
• về cường độ màu (sau khi + thuốc thử hiện màu)

Có thể sử dụng bản mỏng thường hay hiệu năng cao (HP-TLC).
Thường kết hợp HP-TLC với các máy & phần mềm chuyên dụng.
(ví dụ máy Camag TLC Scanner 3; S/w winCATS hoặc tương tự).

Kết quả thực tế còn sai số khá lớn (chỉ được chấp nhận như là
một giải pháp bán định lượng, định lượng sơ bộ mà thôi).

147
 Nhắc lại
Sự tắt quang (quenching) của các vết trên bản mỏng F254
(Khi quan sát dưới đèn UV 254 nm)

4 vết này che khuất nền sáng

(tạo nên sự tắt quang)

silica gel + chất phát huỳnh quang F

(sáng rực dưới UV 254 nm)

148
 SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC)

Xử lý thuốc thử, soi Vis Không xử lý thuốc thử, soi UV 365 nm

149
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC)

150
151
QuantiScan

152
JustTLC Analysis

153
winCATS / TLC Scanner 3 (CAMAG)

154
155
156
hỗn hợp các chất chuẩn

mẫu dược liệu thử nghiệm

157
HPLC-ELSD (7 ref. ginsenosides vs a Panax Product)

hỗn hợp 7 chất chuẩn / Panax

mẫu thử nghiệm (có đủ 7 chuẩn)

158
159
UPLC-ELSD (11 Std ginsenosides vs Panax notoginseng)

Rb1

Rg1

noto-R1 Rd
Re Rg2

160
Saponin & các dược liệu chứa saponin có rất nhiều công dụng

10.1. Tác dụng long đờm, trị ho

Thiên môn, Mạch môn, Cam thảo, Viễn chí, Cát cánh

10.2. Tác dụng bổ dưỡng, tăng lực

Điển hình là các ginsenosid & các dược liệu họ Araliaceae

10.3. Tác dụng làm tăng tính thấm

Digitonin / Digitalis. Nhiều saponin được dùng làm tá dược trong
kỹ thuật điều chế vaccin

10.4. Tác dụng kháng viêm

Glycyrrhizin / Cam thảo; acid oleanolic / Ngưu tất
161
10.5. Tác dụng lên mô sẹo
Asiaticosid / Rau má

10.6. Tác dụng diệt các loài nhuyễn thể

Dùng để diệt nhiều loài ốc (ký chủ trung gian của Sán máng)

10.7. Tác dụng bảo vệ thành mạch (# vit P, Flavonoid)

Ruscogenin / Ruscus aculeatus (Proctolog®)

10.8. Tác dụng kiểu hormon sinh dục, Σ steroid

Diosgenin, Dioscin, Hecogenin & saponin / Bạch tật lê, Mía dò…

10.9. Tác dụng bảo vệ gan

Acid oleanolic, acid ursolic…

Tham khảo BGDL I, (2011), pp. 213-214.

162
163
Lịch sử nghiên cứu saponin 5 Tạo phức với cholesterol 81
1. Khái niệm về saponin ….. 11 Thủy phân các saponosid 85
2. Cấu trúc & Phân loại ….. 13 5. Sự phân bố saponin ….. 89
Saponin triterpenoid 18 6. Chiết xuất saponin ….. 93
Saponin steroid 27 7. Phân lập saponin ….. 101
Danh pháp các saponin 36 7b. Tinh chế saponin ….. 110
3. Lý tính các saponin ….. 37 8. Định tính saponin ….. 119
Phổ UV, IR, MS, NMR 41 CSB, CSPH 120
SKLM 58 Các phản ứng màu 131
HPLC 65 Các pp. sắc ký 138
4. Hóa tính các saponin ….. 73 9. Định lượng saponin ….. 140
Tác dụng với chì acetat 71 10. Tác dụng & Công dụng ….. 161
Các phản ứng màu 77 Trang mục lục của Phần I 164

164
STORE

165
Ref: G.S. Whitby, (1922). Các phản ứng mới của Sterol, p. 11

166
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

Refs Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4

167
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

Refs Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4

168
4

Dung môi (H2O - MeOH)

(tăng dần MeOH %)

mẫu / H2O (Sap + tạp)

Diaion HP-20 (Mitsubishi)

các chất phân cực mạnh các chất phân cực giảm dần

169
3.4.1 Determination of C-25 Absolute Configuration in Spirostan and Furostan Saponins

In spirostanols, the absolute configuration of C-25 can be determined via examination of the
proton vicinal coupling constants for positions 24–26 as well as comparison of F ring 1H and
13C NMR chemical shifts with literature values [99,100].

While stereochemistry is easily assigned within the rigid steroid ring system of spirostanols, it
is more challenging in structures possessing a flexible side chain such as furostanols and
open-chain glycosides.

A reliable but time-consuming method for the determination of C-25 stereochemistry in

furostanol saponins is their conversion to the corresponding spirostanol, either through acid
catalyzed hydrolysis or specific, enzymatic cleavage of the C-26 glucose residue to effect ring
closure of the side chain [101].

The absolute config. of C-25 in furostanols may also be more conveniently assigned by
1H-NMR spectroscopy. The geminal proton resonances of H2-26 (δa and δb, Δab = δb - δa) are
dependent on the configuration of C-25, being more resolved (greater Δab) in 25S than 25R
furostanols [102, 103].

170
3 Analytical Method (mục 108, 4285 pages)
3.1 UV–Vis Spectrophotometry
With unsaturated bond or 3-hydroxy and 3-carbonyl group, triterpenoid saponins
can easily react with strong acids, such as glacial AcOH, sulfuric, perchloric acid,
and form carbonium ion with visible color under anhydrous condition.
Carbonium ion can form stable visible color with vanillin by the nucleophilic addition
reaction, so 5% of vanillin-glacial AcOH and perchloric acid are usually used as
color-developing agents for the determination of triterpenoid saponin by UV–vis
spectrophotometry [9, 11, 27].
The detection wavelength is set at 500-600 nm.
In order to create the anhydrous reaction condition, the extract solution was
evaporated to dryness and the residues were redissolved in anhydrous solvents.
UV–Vis spectrophotometry can only be used to determine the total amount of
triterpenoid saponins due to the lack of resolution and specificity.
The total amount of triterpenoid saponins is calculated with the standard curves of
reference compound.
In order to improve the specificity and reduce the interference, the multiple-steps
sample preparation is commonly performed to concentrate and separate target
triterpenoid saponins. 171
4 Conclusion
This chapter describes the different types of analytical methods in use for the
analysis of triterpenoid saponins.
HPLC-MS shows more merit than other analytical methods on selectivity, sensitivity,
and resolution. The HPLC-MS technique provides rich mass information to
determine the type and sequence of monosaccharide in saccharide chain and
structural type of some triterpenoid sapogenins.
This technique is also of interest to develop the reliable and sensitive analytical
method for minor triterpenoid saponins in complex matrix.
However, due to the lack of standards, there are not many analytical methods for
triterpenoid saponins in biological samples.
Development of MS–based method for triterpenoid saponins in biological samples is
necessary to understand the effect and mechanism of triterpenoid saponins.

172
 These USA (3), pp 30-32

Hemolytic Activity (HA)

HA has been used by researchers to follow the isolation of saponins.

It is the simplest and the fastest bioassay employed to detect and quantify some
saponins in plant material.
Alfalfa, soybean, quillaja, and synthetic triterpenoid or steroid saponins have HA.

Several factors determine the HA of saponins such as

• aglycone type,
• glycone (type, position, n-desmoside)
• [aglycone:sugar] ratio,

Not all saponins have HA.

For example, ginsenosides hemagglutinate human, rabbit and sheep erythrocytes,
but are not hemolytic (Gogelein, 1984; McManus, 1993; Takechi & Tanaka, 1995).

173
Where saponins tend to have low HA on human erythrocytes; they have high HA on
sheep cells (Schmidt-Thome and Prediger, 1950).

HA of saponin from peas < soybeans (Birk and Peri, 1980)

Alfalfa root extracts are HA > alfalfa leaves (Shany et al., 1970).

HA of saponins is attributed to the affinity of their aglycone moiety to sterols within

membranes, particularly cholesterol.

Other research reports that HA decreases by removing the glycone moiety of the
saponin (Santos et al., 1997).

But still other researchers report that a high aglycone:sugar ratio increases HA
(Shany etal., 1970; Gestetner et al., 1971).

174
Bi & tridesmoside saponins show less HA than monodesmoside saponins
(Fukuda et al., 1985; Mahato et al., 1988; Woldemichael and Wink, 2001).
Takechi and Tanaka (1995b) noted that the hemolytic rates of steroid saponins are
greater than the hemolytic rates of triterpenoid saponins.
Santos (1997) also report that steroid saponins have higher HA than triterpenoid
saponins.
Monodesmoside saponins with C-3-Glc shows higher HA than monodesmoside
saponins with GlcA at the same position (Oleszek, 1996).
As the number of monosaccharide units attached to the 3-OH on the aglycone
increases up to 4-6 sugar units (Anisimov, 1980; Kuznetzova, 1982) HA increases.
The stereochemistry of the saponin as related to side chain composition and length
appear to be very important in conferring activity on the saponin molecule (Gee et
al., 1998).
HA of saponins increases with decreasing numbers of polar groups on the aglycone
moiety (Namba et al., 1973).
Saponins with the highest Rf on silica gel showed the strongest HA.
The active groups on the aglycone and the acylation of saponins affect HA.
The neutral and acidic triterpenoids along with the acyl saponins are less hemolytic
than the ester saponins
(Gee et al., 1998; Attele et al., 1999; Oda et al., 2000).

175
Laurence (2005) noted that the acylated triterpenoid saponins isolated from
Harpullia austro-caledonica showed 100% HA of a 10% suspension of sheep
erythrocytes; while, deacylated Quillaja saponins, which differ only in the absence
of one glucose residue, decreased HA (Pillion, 1996).

No close and direct relationships between HA and other biological activities of

saponin were reported.
For example, avenacoside oat saponins showed HA, but did not affect the cell
membrane permeability and the active transport of glucose. This is a very unusual
observation given hemolysis is the result of a ruptured red blood cell membrane
which allows hemoglobin to escape the cell.

A trisdesmoside zahnic acid saponin was only weakly hemolytic and neither
inhibited fungal growth nor formed insoluble complexes with cholesterol (Gee et al.,
1996).

However, it was the most active compound affecting cell membrane permeability
and active transport of glucose, giving further evidence of the complexity of the
interactions between saponins and membranes (Gee et al., 1996).

Synthetic steroid saponins show both antifungal and HA, but in many cases
hemolytic triterpenoid saponins show little antifungal activity (Takechi et al., 1999).
176
 Toxicity of Saponin (USA-3, p. 38…)

Many saps exhibit toxic effects at high doses over long periods of time causing
problems such as excessive salivation, vomiting, diarrhea, loss of appetite and
manifestations of paralysis.
Oral toxicity of saponins to warm-blooded animals is relatively low and LD 50 values
are in the range 50-1000 mg/kg. However, they are highly toxic when given IV.
The toxic effects of many saponins are neutralized by saliva of animals such as
sheep, intestinal bacteria, and rumen bacteria.
Cooking or heat processing can also detoxify saponins.
For example, cooking decreases saponin content by 7-17% in chick peas, 40% in
faba bean seeds and 72% in quinoa.
Not all saponins are degraded at the same conditions and temperature.
For example, oat saponins are not affected until heated to 140 oC for 3h.
Degradation increases as the pH decreases from 7 to 4 in avenacoside A.
Saponin degradation sometimes induces activity of enzymes such as β-glycosidase
that occur naturally in oat leaves.
Removing the C-26-bound glucose moiety results in forming a monodesmosidic
saponin with the highest antifungal activity.
Also, avenacosides saponin A and B in oats are activated by the plant’s enzymes in
response to tissue damage or pathogen attack by fungi.
Saponins can also be hydrolyzed to yield oses and aglycones 177
 Effect of Saponin on Cell Membrane Permeability
Saponins differ in their effects on cell membrane permeability.
Many reports suggest negative effects on cell membrane permeability by blocking
membrane ion channels & irritating membranes of the mouth and digestive tract.
Other research reports that saponins increase cell membrane permeability by
insertion of the aglycone into the lipid bilayer, forming pores of 40 to 50A° in
diameter in human erythrocyte membranes
Saponins also have stimulated Na-Ca exchange activity as in canine cardiac
sarco-lemmal vesicles and induce an isotropic action through membrane calcium
channels.
Saponins change the function of proteins or glycoproteins in plasma membranes,
and form a saponin–cholesterol complexes thereby altering the organization of
membrane phospholipids, form phospholipid breakdown products such as
phosphatidic acid. ATPases enzyme activity of membranes also is altered thereby
affecting ion transport.
In general, saponin action on cell permeability is dependent on concentration [C]
and the number of sugar side chains on the aglycone.
High [C] of saponin may literally poke holes in cell membranes while lower [C]
may interact with membranes in other ways without actually rupturing them.
The permeability activity of avenacin A-1 is completely abolished after 1, 2, or all 3
sugar side chains are hydrolyzed to yield monodeglucosyl, bisdeglucosyl and
aglycone derivatives, respectively. 178
179
180