4a divisién celular origina dos ¢élulas a partir de una. En las bacterias con orma bacilaresie proceso suele ocurri mediante fisi6u binaria, que con c en el alargamiento gradual de una célula y su posterior separacion en dos células, La division celular requiere proteinas especifieas, como la prate- fnatsZ que se muestra aqui mediante tincidn de las células, Pata inisiar el pro- cesa de divisién se depositan copias de FtsZ formando un anillo que identifies e| Jpuntomedio dela célula. Una vez.que ha ocurrido esto, se activawoteas proteinas sspecificas dela divisién celular ye pone en marcha una serie dé elapas que cal sinan en e! proceso real de divi eC DA Ly MICROBIANO 138 6.4 Crecimiento celular y fisién binaria 198 62 — Sintesis del peptidoglicano y division celular 140 6.3 Crecimiento de poblaciones 142 6.4 Curvade crecimiento 144 6.5 — Medidas directas del crecimiento microbiano: recuento de células totales y viables 145 8.6 Medidas indisectas del crecimiento microbiang: turbidez 148 6.7 Cultivo continuo: el quimiostato ua Uae eae Cee ILO cE 8.8 Efecto de la temperatura sobre el crecimiento 151 6.9 Crecimiento microbiano a bajas lemperaturas 153 6.10 Crecimiento microbiana a altas temperaturas 155 6.11 Crecimiento microbiano a pH alto y a pH bajo. 158 6.12 Efectos osmOticos sobre el crecimiento microbiano 158 643 Oxigeno y crecimiento microbiano 161 eo138 = Capitulo 6 = CRECIMIENTO MICROBIANO. Ackd6filo sn omganismo que crece mejor a pit bajo Aerobio 1m onganismo que puede usar el; ‘en la respiraciOn; algunos requieren O, para el erecimiento. Aleat6file un organismo que crece mejor a pH alo Anaerobio ws oxzanismo que no puede usr ‘e1;en la respiracion y euyo crecimiento. puede ser inhibide parel O;, Anaerobio aerotolerante i microorya- ‘sme Incapazderespiar con axsgenomo- fecular(O;) per que noes aectad por la presencia dé O; Autolieis isis lular espontines, eormal- mento debjda a la actividad de proteinas Iiicas aemadax atolisinas Crecimionte increments ex ol imers de eflulas Erecimiento exponencial crecimiento de ‘un microorganism cuyo mtimeno de cély Jas se duplica en un period constants de tiempo Cultivo monotésice 0 en batch cultivo ‘micrebiano que funciona como un sistema cerrado de volumen constanie Divisoma complejo proteico implicady en process de divisin celular en procariotas. Extremotio un organismo que crece de ‘modo Optimo en uns o mas condiciones fi- sieaso quimicas extremas, como por eem- plo aatta obap temperatura o pH Facultative con especto al Oy un organis- ‘mo que puce creer enstausencia gens presencia Fase estacionaria ol poriade que sigue 31 ‘recimiento exponencial cuando ts veloei- dad de crecimiento dela poblacié escero Fase tag esi anterior ala tase de ervci- ‘miento exponencial cuando las eélulas [pueden tener un metabolismo active pero Fisién binaria division celulac que sigue al aumentar una célula dos veces si tama (FtsZ una proteina clave en ta divisidn celu- Jacque forma un arilloa to large del plano de division para iniciar la longacign ce- lular Hat6ttto extrema un icroonganisino que rune para creer rons caries sal (NaC), porl,general ssperires al 10% Ya voces pénina a la saacin Haléito un microonganismo quo requiew sal (NaC) para cwoer Halotolerante un oyanismo dene sal (NaCl) para erecer pero que Puede crecer en su presencia, en algunos casos, a niveles slinos elevaddos Hiperterméfile microonsanismo que tiene ‘una temperatura Gptima de 80°C 0 supe ‘Meséfile un organismo que crese mejor a temperatura enire 20°C y 45°C Micreaeréfilo organisma acrébicn que puede crecer slo cuando la presin par- ‘ial del oxigero es menor que la del aire PH valor negativo del logaritmo de la cor: ‘centracion de ioneshidrogeno (Hen ura soiucion Psleréiito onganiamo con wns temperatura Sptima de crecimiente de 15°C o nena y una temperatura mixima de crecimiento inferiora 20°C Psicrotolerante oryanismo capuz.decrcer a bapss temperaturas pero cuya temper ‘ura 6ptima de crecimiento esti por encima de 20°C Quimiostate aparato que permite el cltivo ‘continu de microorganisms en el que se pueden controlar independientemente la velocidad de crecimiento y ef nimero de cétulas Soluto compatible una molécula que se acumula en el sitoplasma paca ajstar la actividad de agua y que ro iahibeos pro ‘cos bioguimicus ‘Temperatures cardinales las tenpersiis ‘minima éptima y mdxime que permitene crceimiento de un ogganisans determinade Terméifilo onganisino cuya temperatirs p- tima decrecimiento ea entre 45°C y MPC Tlempo dle ganerackén tiempo neces lo para que una poblacidn de: élalos i crobianas duplique su ruimero Traspeptidacién formaciin de pueriespey- tidicos entre ls unikdades de Acido nace ‘marémico durante la sintesis de peprido- siicano Xeréfile organismo que es capaz de vivigo ‘que vive mejer,en ambientes muy seco 1 TEORIA Y PRACTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO H asia ahora hemos tratado de la estructura de las mactomoléculas celulares (vase Capitulo 3), de la relacion entre estructura y funcién (oéase Capitulo 4), y de los principios generales de la nutricién microbiana y del metabolismo (o¥ase Capitulo 5). Antes de comenzar el estudio de la biosintesis de macromoléculas y de la gené- tica molecular de los microonganismos (ofase Capitulo 7), vamos a considerar algunos aspectos del crecimiento mi crobi 2. En microbiologia, la palabra crecimiento se define como un incremento en el nuimera de células. Fl crecimiento es win ‘componente esencial de la funcién microbiana, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo dle vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la poblacién. Ademas de la comprensién de los aspectos basicos del crecimiento microbiano, muchas situaciones practicas hacen necesario el control del creci= ‘miento microbiano, El conocimiento de cémo las poblacic- rnesbacterianas se amplifican ripidamente es muy «til para €\ disefio de métodos de control del crecimiento microbia~ no; estudiaremos estos métodos en el Capitulo 20, La célula bacteriana es una maquina sintética capaz de du- plicarse a si misma. Los procesos bioquimicos del creci- miento celular bacteriano suponen no menos de 200) reacciones de una gran variedad de tipos. Algunas de ex tas reacciones son transformaciones de Ja energia. Otras iponen la biosintesis de pequenas moléculas, las unida: des bésicas de las macromoléculas, asi como los diversos cofactores y coenzimas necesarias para las reacciones en-ziméticas. Sin embargo, las principales reacciones celula- res sintéticas consisten en reacciones de polimerizacién, por las que los polimeros (macromoléculas) se forman a partir delos monsmeros. Una vez que se fabrican los polimeros, ‘sta dispuesto el escenario para los procesos finales del ‘crecimiento: el ensamblaje de las macromoléculas y la for- macidn de las estructuras eelulares come pared cebular, membrana citoplasmatica, flagelos, ribosomas, cuerpos de inclusidn, complejos enzimaticos, etc Fisién binaria Enla mayoria de los procariotas, el crecimiento de una ee lule individual contindia hasta que se divide en des células nuevas, un proceso que se denomina bimaria (bin ria expresa el hecho de que se forman dos células a partir de una). En un cultivo en crecimiento de un bacilo como, por ejemplo Escherichia coli, se observa que las células se ‘largan hasta aproximadamente el doble de la longitud de Ibcelula mas pequena y luego forma un tabique que acaba por separar la célula en dos células hijas (Figura 6.1). Este labique se conoce como septo y es el resultado del creci- miento hacia dentro de la membrana citoplasmatica y la pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos {élulashijas se separan (Figura 6.1). Durante el ciclo de crecimiento, todos los constitu tes celulares aumentan, de moda que cada célula hija ree be un cromasoma completo y suficientes copias de todas las macromaléculas, monémems.¢ iones inorgsinicos, como par existireomo cétula independiente. Fl reparto del DNA ,-— Fommaciin del sept Vv Teminacion {det septo con fornaeisn de paredes bien dliferencadas Una genarscien DEER] 0250 wont ea tar ora ‘on forma Ge bscilo. Para simpiificar, el nucieoide se representa como An orculo sencito en verde. sa replicado entre las dos células hijas depende de fa unién del DNAa la membrana durante la divisidn, y la segrega- Gidn real de las dos copias es facilitada por la formacién de! septa (Figura 6.1). F1 tiempo necesario para completar un ciclo de creci- miento celular en las bacterias es muy variable y depende de varios factores, tantoynutricionales como genéticos, Bajo Jas mejores condiciones nuttitivas, la bacteria Escherichia coli puede completar el ciclo en unos 20 minutos; unas cuantas bacterias pueden crecer incluso mas ripidamente, pero la mayoria lo hacen mas lentamente. El control de la division celular es un proceso complejo y parece estar intimamente relacionado con sucesos que ocurren durante la replicaciéin del cromosoma, Proteinas Fts y el plano de Ia division celular ‘Se han identificado varias proteinasimportantesen el pro- ceso de la division celular de los procariotas. Estas protei- nas son esenciales para la division celular normal y se han Namado proteinas Fs (del inglés «filamentous temperatu- re sensitiver, que describe las propiedades de las células ‘con mutaciones en los genes que las codifican). En Escheri- chia coli otras bacterias se ha estudiado con detalle una protefna clave del grupo FisZ. Las proteinas Fts estin dis- fribuidas universalmente entre procariotas, incluyendo Ar- 2". Cuando cuatro células pasan a ocho, lo ex prosamos como 2? 2), y asi sucesivamente (Figura 6.6). Debido a esta progresion geométrica, existe una relacign directa entre el niimero de células presentes inicialmente ‘en un cultivoy el ntimero presente tras un periodo de ere- «imiento exponencial: N~ Na! donde N \ero final de eélulas, Ny ~ niimero inicial de células yn = mimero de generaciones que han ocurrido durante el periodo de crecimiento exponencial. El tiempo de generacién g, de la poblacién celular se calcula como /i, donde f indica simplemente las horas o minutos de c: miento exponencial. Por tanto, sabiendo el nimero ¥ final de eélulas en una poblaciGn que esta creciendo ponencialmente, es posible calcular 1 y conociendo ny I, Calcular el tiempo de generacién g. Para expresar n a partir de la ecuacién N ~ N,2", sene- cesita hacer las siguientes transformaciones: N=NE log N= log Ny + log 2 log. N log. No = i log 2 = BN — 10g No _ log N — tog Ny og2 030) = 33 (log N ~ log: NO) Expresando 1 en funcién de términos facilmente medi- bles como N y Np, se pueden calcular los tiempos de gene- racion. Como ejemplo para realizar estos célculos podemas usar los datos reales de la grafica inferior de la Figura 6.7. El tiempo de generacién de'5 horas, que en este caso se de- termino directamente a partir de la grdfica, se puede tam bién calcalar teniendo en cuenta que N= 10°,N, = 5 107 yt=2.Portanto, n= 3,3 [log 10" log (5 x 107)] = 33 (8 ~ 7,69) = 3,3 C301 Asi,el tiempo de generacion g, que definimes como i, sera g = Un = 2/1 = 2 horas, El tiempo de generacién también Se puede calcular a partir de la pendiente de la recta obte- rida en la representacién semilogaritmica del crecimiento exponencial, pues la pendiente tiene un valor de 0301/g.. Otro indice de la velocidad de crecimiento es la cons- ante de la velocidad de crecimiento, abreviadamente k. La constante de la velocidad de crecimiento se expresa coma k= "2 09 y tiene unidades dehora’ |, Mientras que g es tuna medida del tiempo que tarda una poblacién en dup! ‘car su niimero de células, k es una medida del nuimero de _generaciones que ocurren por unidad de tiempo en un cul- ivo exponencial. Si disponemos de los valores de n y de f, se puede cal- cular ¢ y k para diferentes microorganismos creciendo bajo diferentes condiciones de cultive. Esto resulta a voces itil144 © Capitulo 6 ® CRECIMIENTO MICROBIANO para optimizar las condiciones de cultive de un microorga- nismo particular y también para probar el efecta positive o negativo de algiin tratamiento sobre al cultivo bacteriano. 6.3 Revision de conceptos Las poblaciones microbianas muestran un modelo tipico de cre- cimiento llamado exponencial, que se analiza mejor represen: tando el nimero de celulas en funcidn del tiempo en una gritica somilogaritmica, Conociendo el nimero inicialy final de lasy el tiempo de crecimiento exponencial se puede calcular di- reclamente el tiempo de generacién de la poblacién celular, 7 Diferencie entre los términes velocidad de crecimienta y tiem po de generacion. ¥ Por qué el crecimiento exponencial origina grandes po- biaciones celulares en cortos periodos de tiempo? Y :Qué es una representaciin semilogoritmica? FE curva ae crecimiento Los datos presentados en la Figura 6.6 reflean sélo parte del ciclo de crecimiento de una poblacién microbiana, la fase llamada de crecimiento exponencial, En un sistema cerrado 0 ccultivo en medio no renooado, también conocido como cultioo imonojfsico, se obtiene una curta de crecimiento tipica coma la que se indica en la Figura 6.8. Fsta curva de crecimiento pue- de dividirse en distintas fases llamadas fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte, Fase de latencia ‘Cuando se inocula una poblacién micrebiana en un medio fresco, por lo general el crecimiento no comienza inme- diatamente sino s6lo tras un periodo de tiempo que const tuye la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga 90 70 Logis de exganismes viables/ 60 50 Fages de crecimiento baton Exponencal-}-——— Estacionana ——-__—uete i ; Fecuento de viabies a Turbiler eas (densidad éptica) dependiendo de la procedencia del cultivo y de las condi ciones de crecimiento. Si un cultive exponencial se inocula en eS —> Lamuasira se extionde uriformemente rocedimionto de recuento microscopico directo ulizando una carrara de tipo Perof-Hausser ‘mezcla de las colonias. En el método del vertido en placa (Figura 6.10) se pipetea un volumen conocido (normal- mente 0,1-1,0 ml) decultive en una placa Petri estéril sobre Ja que se afiade el medio con agar fundido y se mezcla todo bien con suaves movimientos de la placa sobre la superfi- cie de la mesa antes de dejar que se solidifique. Como la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar voltimes de inéculo mayores que en el método de recuen= {0 por extensi6n; sin emhango, con este métodlo e! organis- _mo quese cuenta debe ser capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45°C. Dilucién de las suspensiones celulares antes de la siembra en placa Enos dos métodos scfalados anteriormente es importan- te que el nsimero de colonias que aparezcan en las places no sea demasiado grande, pues algunas colonias se podriant fusionar dando estimaciones errOneas. Tambien es impor~ tante que el ntimero de colonias no sea demasiado bajo para Incuibacin Sepibelo sorelasupericie sobre a supeil al apr tnmnoo un delaplaca con ager fou de va este Siembra por vertido en placa Ze treubacion La mussva se ppstea Seanad redo ester se Resutado piso del verti cia placa ester mezcla bien con el nocule en placa, os motos de Yea una Glarninacn de Gums vablesVecvento on Pca. En Gada Saxo usta 6 Glave HoT mente antes ce semsbrar.65 = MEDIDAS DIRECTAS DEL CRECIMIENTO MICRO! ‘que e cilculo sea estadisticamente significativo. En la préic- fica, el niimero de colonias por placa oscila entre 30 y 300. PPara obtener el ntimera apropiado de cellonias casi siem- [pre se diluye la muestra. Coma raramente se sabe de ante- mano el niimero de células viables, normalmente se hace iis de una dilucién. Lo mas frecuente es realizar dilucio- nes decimales de la muestra (Figura 6.11). Para hacer una ailcién de 10 'se mezelan0,5 ml dela muestra con 4,5 ml dediluyente o 1 ml de la muestra con9 ml del diluyente, Si senecesita una dilucién de 10 7, se pueden mezclor 0,05 ml dela muestra con 4,95 ml de diluyente 6 0.1 ml-con 9,9 ml, Por oira parte, una dilucién 10-*se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente des diluciones de tipo 10! En la mayor parte de los casos se realizan dichas di- Iucionesseriadas para akcanzar la diluciGn final deseada. Asi, Si se requiere una diluciGn 10 * se puede lograr haciendo Ines cihuciones sucesivas de 10 * o seis sucesivas de 10 (figura 5.11). Mucstras am a dotorminar Ditwcion —— vio, i901 ao) a4 (10%) Pasara placa muestias de 1 nt @O0000 vit wige oy 104) ane (05 197 a 0 Demasiadas —colonias colonias colonias coionias colonia Peracontar 369 x 10° = 159 x 10 Recuento Factor Células (unidades dela” de formadoras de colorias) placa due por mili de muesira original Procadimiento pars la determinacion de viables vaan do ducienes seriadas de la muestra y el método del vertido en placa. El fquido estén! usado para hacer las dluciones puede ser simple ‘mente agua, pero una solucién salhia equllrada © medio de Cultivo sue dar mejor recuperacion. El factor de cilucion 6s.) inverso ola ‘lucien. En o caso de sternbra por extonsion (Figura 8.10) puecen ser necesaries mas cilucones para extender muesiras de 0,1 mi \NO: CELULAS TOTALES Y VIABI =aT Fuentes de error en el recuento en placa El nimero de colonias que se obtiene en una determina- cién de viables no slo depende del tamano del indcule sino también de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las condiciones de incubacién, asf como de la duracién de la incubacién. Las eélulas depositadas en la placa no se desarrollarin todas en colonias.a la misma velocidad y si se emplea un corto tiempo de incubacién, se obtendesin menos colonias de las posibles. Ademas,el tamafio de las color varia y sise desarrollan colonias muy pequefias pueden pa- sar desapercibiday en el recuenio. Es habitual establecer las condiciones de incubacién (medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor ntimero de colonias para un determinado organismo y usar luego estas mismas con. diciones. La determinaci6n de viables puede estar sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de hacerse con cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Hay que advertir que una agrupacién de dos o ‘mas células s6lo producira una colonia, de modo que el re- ‘cuenta de viables sera erriineamente menor. El recuento de vViables se expresa a menudo como unidades formadoras de colonias obtenidas, mas que como niimero de células viables (ya que una unidad formadora de colonias pudo originar- se a partir de una o mas células iniciales) Pese a estas dificultades, el recuento de viables suminis- tra una buena informacién sobre el ntimero de estulas viables ¥ este procedimiento se usa ampliamente. Fn la alimenta- ‘i6n, industria Lictea, medicina y microbiologia acuatica, el recuento de viables seemplea rutinariamente, El méted tie- ne la ventaja de tna elevada sensibilidad: se pueden contar muestras con pocas células, lo que permite una deteccién muy sensible de la contaminacién microbiana de productos ‘omateriales. Ademas, el uso de medios selectivos y de cier- tos condiciones de cultivo (adaseSeacién 24.2) permite contar, ‘mediante la determinacién de viables, tipos celulares parti culares en una poblacién mixta de microorganismes. La gran anomaifa det recuento en placa ‘Aunque es una técnica may sensible, el recuento en placa puede ser irrealizable cuando se trata del recuento de mues- tras naturales, tales camo suelo 0 agua. Por tanto, el recuento directo en muesiras naturales suele dar un niimero mucha mayor de organismos que los que se obtienen en cultivo en placas de cualquier tipo de medio de cultivo (oéanse Seccio- nes 183 y 18.4). Algunos microbidlogos se refieren a este he- cho como «la gran anomalia del recuento en placa». gPor queé'los recuentos en placa lan menores nvimerosde células que los recuentos directos al microscopic? Fsto se debe a ‘una combinacién de factores, como el hecho de que los mé- todos micrnscépicos cuentan células muertas, mientras que Jos métodos de viables no; y al hecho de que diferentes or- ganismos, incluso en una muestra muy pequefa, pueden tener requerimientos nutricionales y de cultivo muy diver- 50s (ofanse Capitulos 5, 17, 18 y 19). Por tanto, aunque los Fecuentos en placa especificas con medios altamente selee- tivo, como en el andlisis microbiano de aguas residuales 0 le alimentos, puede dar resultados fiables (osanse Secciones 28.1 y 29.1), «ios recuentos del ntimero total de eélulas» de Jos mismos habitat pueden ser, y habitualmente son, subes- timados en varios érdenes de magnitud,148 ® Capitulo 6 ® CRECIMIENTO MICROBIANO 65 Revision de conceptos crecimiento se mide porel cambio en el niimero de céhalas ao Jangodel tiempo. Fl necuento de eélulas al micmscopio mide el mero tolal de eélulas de la poblacién, mientras que 6 recuento de visbles (reciente de colonias) mide sole la poblacion viva. ¥ dor qué un recwento de viables es més sensible que wn re ‘cuenta micrescépien? ¥ (Qué suposicion se hace al relacionar el rectientey en placa toned niimere de eétulas? Y Describa céme abtendria una dil bacieriane, {Que es la ogrananomaliay del recuentro en placa? Medidas indirecta: crecimiento microbiano: turbidez Un método muy rapido y itil de obtener estimaciones del mimero de céhulas son las medidas de turbides. Una suspen- Sidn celular aparece turbia ala vista porque las céhulas dis persan la luz que atraviesa la suspensién. Cuantas més Ccélulas estén presentes mayor seré la luz dispersada y, por fanto, mayor la turbidez. La turbidez puede medizse con aparatos comoel foldmetro o espectiofutdmetro que hacen pa- sar la luz 2 través de suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergenteno dispersada (Figura 6.12). La principal diferencia entre estos dos instrumentoses que un, folometro emplea un filtro simple para generar luz inci- dente de longitud de onda relativamente corta, mientras que un espectrofotometro emplea un prisma o red de di- fraccién para generar Iuz incidente en una banda muy es- trecha de longitudes de onda (Figura 6.12). Las longitudes de onda mas comtinmente usadas para medir la turbide bacteriana son 540 nm (verde), 600 nm (naranja) y 660 nm, (rojo), Sin embargo, tanto los fotémetros (nefelémetros) como los espectrofotsmetros miden solamente luz no dis- persada y las lecturas se expresan en unidades fotométricas {por ejemplo, «unidades Klett» para el fotmetro Klett-Sum ‘merson) (ova Figura 6.12b) ocn unidades de densidad op- tica (DO) en un espectrofotémetro. ién 10°? de un cultive Obtencién de una curva estandar Eneleaso de organismos unicelulares, las unidades fotome tricas o de densidad 6ptica son proporcianales (dentro de Giertos limites) al mimero de células; por consiguiente, las lecturas de turbidez pueden usarsecomo un sustituto de los ‘metodos de recuento directo. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como sistema para estimar el nuimero de células, se debe preparar primero para cada microorganismoa estu: diar una curva estinder relacionando alguna medida direc~ ta del niimero de células (micruscspica o recuento de viables) de la masa (peso seco) con la medida indinecia obtenida por turbidez (Figura 6.120). Tal curva de ealibracién puede con- tener datos tanto del niimero de células como de la masa co lular, permitiendo una estimacién de ambos parimetros a partir de una simple lectura de la turbide2 (Figura 6:12+). Aalias concentraciones celulares, la luz dispersoda por una célula, quenormalmente nealcanzaria el detector, pue- de ser redispersada por otra de tal modo que para la célu- Ia fotoeléctrica es como sino hubiese sido dispersada nun- a. Cuando esto ocurre, la correspondencia entre el niimero de célulasyy la turbidez pierde linearidad (Figura 6.12c) Sin ‘embargo, en unos limites, las medidas de turbider pueden ser razonablemente precisas y tienen la virtud de ser rip das y faciles de realizar, Ademas estas determinaciones se pueden hacer normalmente sin destruir o modificar signi ficativamente la muesira, Por estos motives, las medidas de la turbidex se usan con frecuencia para seguir la veloci- dad de crecimiento en los cultivos microbianos; la misma muestra puede medirse repetidamente, los resultados se pueden representar semilogaritmicamente frente al tiem Po (Figura 6.12) y usarse para calcular el tiempo de gene- raci6n de un cultive en crecimiento. Y_6.6 Revision de conceptos Lacmedidas de la turbides son un método indimceta muy iil yr pido de medirel erecimiento bacieran, Sin embargo, para rel Sonar un recuenta de células directo can wn valor de la turbid, s¢ requiere establecer primero una curva estindardle calibracién, Cite dos ventajas del uso de la turbiclez para medir el ene ‘imiento celular. ¥- Describa cémo usaria un valor de la turbider para deducir ‘cuintas colonias obtendria alsembrar en placa un cultivo de tuna DO determinada, Cultivo continu: quimiostato Hasta ahora nos hemos referide alerecimiento microbiano en cultivos en sistemas cerrados 9 en medio ne renovado, «3 decir, cuando el crecimiento ocurte en un voluumen fijo de ‘medio de cultivo queestd sienclo continuamente modificado por la accidin de los microorganismos que crecen hasta que ya ‘hg es adlecuado para permitir mas crecimiento. En los cult vos en medio nb renovado o sistemas cerrados, las condi- cones pueden ser relativamente constantes al principio de la fase exponencial de crecimiento, pero después, cuando elni- ‘met de céluias Hega a ser muy elevado, ocurren cambios ‘drasticos en la composicién quimica del medio. En muchos ‘estudlios, sin embargo, es deseable que los cultivos se man- tengan en un ambiente constante durante langos periodos de tiempo, y esto puede lograrse empleando cultioes anntinuos. Uncultivo continuo es un sisiema abierto, con volumen cons- tante, al que se afiade continuamente medio fresco y del que se retira continuamente medio (usado) con células a una ve- locidad constante (cultivoen medio renovado) Una vez que se alcanza el equilibrio en el sistema, el niimero de células y el estado metabélico permanecen conslantes'y se dice enton ces que el sistema sta en estado de equilibrio, El quimiostato El tipo mas comin de aparato que se wiliza para obtener un cultivo continu e el quimiostato (Figura 6.13), que con {rola tanio la densidad de la poblacidn celular como la ve~ locidad de crecimiento del cultivo. Para lograr este control 71 un quimiostato son importantes dos factores, la velocidad de dilucion y la concentracion de un nutriente que actua comoMuoeira I ‘ee ne ta iretonte @ 400] Oraanismo & o8 300 os Oroanisro 8 200 04 % 19 03 z z g fm 02 op g 7° 2 3 3 a On “ ~ 06 10% 2) 8 30 eS ? ° & Tempo h) 6.7 = cULTIVe CONTINUO: Luz no ‘dspersada,/ Célula fotosiéetrion (mide lane Reger dispersed.) unidades 1. Espectrofotémetro— densidad éptica (00) h ~toe Teérica 400 os 350 ‘acu 197 300 as 250 os oo 200 os 460 03 100 02 Ea 04 0 ‘Wimera de céllae 0 pve seco "Medidas turbidinévicas del crecimiento microbiano. (a) Las medidas de lurbides se realian on un e=pectrofoloreiro @ Tato {Ula fotosléctrica mide la uz incidente ne dispersada por las céulas en suspensién y da lecturas de densidad éptica o unidades for {ométicas, 2) Curva de crecimiant tipies representada con datos en unigadee Klett para des organiemos que erecen con velocidades diferentes. Para practicar, calcul 0 tempo de generaciin (g) de los doe cutivae usenda la férmulan ~ Jog N Jog N1/0201, donde N y Na son dos valo res ferentes co unidaces Klett tornados nun inervale de tempo t, {Qué organo erece mas répide, A o B? (0) Relacion eno ol ramero do lula 0 peso seco y sus lactures turbidimetricas. Nétese que la equivalencia se pierde a valores aos de turbide2 factor limitante, tal como la fuente de carbono o de nitrige- no. En un cultivo cerrado, la concentracién de nutrientes afecta a la velocidad de crecimiento y a la produccién de microorganismo, (Figura 6.14). A concentraciones muy ba- jas de un nutriente determinado, la velocidad de creci- ienio disminuye debido probablemente a que el nutriente ‘nose transporta al interior de la célula lo suficientemente pido como para satisfacer la demanda metabélica, mien- tras que a concentraciones moderadas o altas de eve mismo nnutriente, la velocidad de crecimiento no se vers afectada y la producciin de células aumentara (Figura 6.14). A diferen- sia de esto, en un quimiostato la velocidad de crecimiento yl produccién de c¢lulas pueden controlarse independ temente ura de otra; la primera ajustando la velocicad de’ lucién y la segunda variando la concentracién de un Hutriente que acta como factor limitante. En la Figura 6.15 se representan los efectos que se pro- ducenal variar la velocidad de dilucién y la concentracién del nutriente limitante. Como puede verse, los limites en los que la velocidad de dilucién controla la velocidad de crecimiento son muy amplios, aunque a valores extremos el equilibrio se rompe. A velocidades de dilucién muy altas, el organismo no puede erecer lo suficientemente ripido como para evitar su dilucién, y el cultivo desaparece por «lavado» del quimiostato. Por el contrario, a velocidades de dilucién muy bajas, una gran parte de la poblacién ce- lular puede morir porque el nutriente limitante no llega a ser suministrado a la velocidad adecuada como para per~ mitir el mantenimiento del metabolismo celular. En el quimiostato, la densidad celular (células/ml) se conirola por el nivel del nutriente que actiia como factor li- ritante, de igual manera que se controla la biomasa celu-150 ® Capitulo 6 " CRECIMIENTO MICROBIANO. Medio resco =. Regulador ‘dal eservorio. 7 bethio ‘Are gas —e cent Espacio con aire o gas |— Recipiente ‘de cutive Cukiva Rebosadere do oacape ‘Medio con cétulas ‘microbianes ———j Esquerna de un aparato de cutive continao (quimios- {ato) En este dispositive la densidad de pablacién se centro pr la Cconconiracién del nutriente lmitarte presente.an al reservar, y la ve- locidad de crecimiento s9 conirola por la velocidad de flujo © salida (véase Figura 6.15). Amboe pardmatros puadon fijrse por ol expert montador lar en un cultivo cerrado (Figura 6.14). Si se eleva la con- centracicn de este nutriente en el medio entrante, mante- niendo constante la velocidad de dilucién, la densidad celular aumentard. Por tanto, manipulando la velocidad decdilucin y el nivel de nutrientes, el experimentador pue- de obtener —a voluntad— una gran variedad de dei [ee san foe seco] s ta = prkccnes i 2 3 3 g $ : j 3 3 5 i i @ 028 as 08 Concentracion de nutrientes (mg/ml) [GRUIEERED etecién ortre in concentvacién de nutrients, velo ‘dad de crecimiento linea continua) y produccién de céluas (nea slscontinua) en un sistema cerrado © Cultivo en «batch. A baja con ‘centracin de nuirentes tanto la velocidad de crecimiento como a pro- ‘duccion se ven afectadas. 5 —equitoio —4 gs Concentacin bacterin a a a4 oe i : # é i , é “ 8 PP Swen | t .' Oareracisn bo ° 0 025 05 07s ‘flo elocidad le diucn@) eR ‘Relaciones 67 un quimiostato en estado de equlibi, {La veloctiad de ciucion viene determinadia por la velocidad de fujo 0 {de salda y por el volumen del recipiente del cultivo. Asi, con un reci- piente de 1 000 my una velocidad de flujo de SOO mUh la velocidad de diucien sera de 05 h'. Nétese que a velocidados de diucén alas, et crecimiento no puede equiibrar ala diucon y a poblacion resulta a vada del cultvo. Nétese igualmente que aunque la densidad de po- blacién permanece constante en equllbrio, a velocidad de crecimiento \y tiempo de generactn) puede variar amplamente. Por tanto, ol ex erimentador puede obtener poblaciones con velocidades variables {9 crecimiento sin aleciara la densidad de poblacién eslular des de poblacién celular creciendo a distintas velocidades de crocimienteo, Uses experimentales del quimiostato Una de las mayores ventajas de este instrumento es que permite al experimentador controlar la velocidad de creci~ ‘miento y la densidad de poblacion de modo independiente, ‘Como se muestra en la Figura 6.15, con margenes bastan- tes amplios, en el quimiostato se puede obtener cualquier velocidad de crecimiento deseada simplemente variando la velocidad de dilucién. Andlogamente, la densidad dela poblacién puede definirse variando la concentracion de un tinico nutriente (el factor limitante) en el recipiente de me- dio. En los cultivos monofésicos, el control independiente deestos dos pardmetros criticos del crecimiento resulta im= Posible porque son sistemas cerrades desde el punto de vise ta de la adicién de nutrientes y de la eliminacion de Productos, y por tanto las condiciones varian constante- mente con el tiempo. Una veniaja practica del quimiostato es que permite mantener una poblacién en fase exponencial de crecimien- to durante mucho tiempo, dias ¢ incluso semanas. Cora las «élalas en fase exponencial de crecimiento suclen ser las més. adecuadas para experimentos fisiolégicos, mediante el qui- miostato se puede disponer de tales células en cualquier momento. Asi los experimentos se pueden planear con de~ talle y luego realizarlos cuando sea més conveniente. Ade més, los experimentos se pueden repetir sabiendo que la poblecién celular es précticamente la misma cada vez.El quimiostato también es muy uitil en estudios de eco- Jogia microbiana, Por ejemplo, como el quimiostato puede simular las bajas concentraciones de sustrato que ocurren menudo en la naturaleza,es posible el estudio en un qui- ‘miostato de poblaciones bacterianas mixtas para determinar ‘uestiones de competitividad de un organisma sobre otro a concentraciones particulares de nutrientes. Utilizando métodos de cultivo clésicos, asf como téenicas de ecologia ‘molecular (o¥ase Capitulo 18), se pueden ir estudiando los ‘cambios en la comunidad microbiana en funcién de las con- diciones del quimiostato. A menudo, estos experimentox revelan interacciones entre componentes de la poblacion que no resultan evidentes mediante estudios de crecimnien- pra cl aislamiento y enriquecimiento de bacter Secciones 1.5 y 18.1). A partir de un inéculo mixto, se pue- de seleccionar una poblacién estable bajo determinadas condiciones de nutrientes y velocidad de dilucién, y luego irencrementando la velocidad de dilucién hasta que séto jquede un tipo de microorganismo. De este modo, se ha con- seguido aislar recientemente una bacteria con un tiempo de generacion de 6 minutos, que es Ia bacteria de creci- miento mas rapida que se conoce. ¥_6.7 Revision de conceptos Los sistemas de cultive continuo © en media renovade (qui- imiestatos) permiten mantener poblaciones de eélulas ef creci- iiento exponercial durante largos periodos de tiempo. En un uimiostato, la velocidad de dilucidn del cultive determina la elocdad de crecimiento mientras que el tamaito de la poblacion ‘eri determinado por la concentracisn de nutriente limitante: agus entra en el rcipiente. ¥- {Enqué se diferencian los microorganismas de un quimios Into delos procedentes de un cultivo en un sistema cerrado 0 ex medio no renvoada? 4 Expliquela que ecurreen un quimiostata sila velocidad de dilucivin supera la velocidad de crecimiento de un argaris- iostate? ¥ etienca queusae cultivos pures en ung il EFECTOS AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO Hasta ahora hemos descrito el crecimiento de los microor- ganismos considerando esencialmente las condiciones ide- ales del laboratorio. Sin embargo, las actividades de los thicroorganismos se ven muy afectadas por las condiciones quimicasy fisicas del media, El conocimiento de losefectos ambientales nos permite explicar la distribucién de los mi- ‘ermorganismos en la naturaleza y hace posible diseniar mé fodes que controlen o potencien las actividades microbianas, ‘Aesie respecto se pueden considerar muchos factores am bientales, pero hay cuatro factores que tienen una funcion destacado en cl control del crecimiento microbiano: la tem perotura, cl pH la disporibilidad de agua y el oxigeno.Con Sideraremos cada uno de estes factores-con detalle. EL CRECIMIENTO © 151 Efecto de Ia temperatura sobre el La temperatura es uno de los factores mas importantes que afectan al crecimiento ¥ a la supervivencia de los microor- ganismos. A temperaturas muy frias 0 muy calientes los microorganismos no creceran, Pero los valores absolutes de estas temperaturas minimas o maximas varian mucho entre microorganismos diferentes y, por lo general, reflejan el rango de temperatura media de sus hibitat naturales. A continuacién, examinaremos el efecto de la temperatura so- bre el crecimiento microbiano. ‘Temperaturas cardinales La temperatura ejerce dos tipos de efectos opuestos sobre los arganismos vivos. A medida que se eleva la tempera tura, las reaceiones quimicas y enzimstieas de la célula son més ripidas y el erecimiento se acelera. Sin embargo, por encima de una cierta temperatura algunas proteinas parti- culares pueden sufrir datos irreversibles. En consecuencia, dentro de un cierto margen, un aumento de temperatura supone un incremento cn el erccimiento y en el metabolis: ‘mo hasta un punto en que tienen lugar las reacciones de inactivacidn. Por encima de tal punto, lay reacciones celu- lares caen rapidamente a cero, Asi, para cada organismo existe una temperatura minima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una temperatura dptina a la que se produce el crecimiento mas répido, y una temperatura ma: "Ximit por encima de la cual no es posible el crecimiento (F- ‘gura 6.16). La temperatura optima esta siempre mas cerca de la maxima que de la minima, Estas tres temperaturas, que se llaman temperaturas cardinales o fundamentales, generalmente son caracteristicas de cada tipo de organis- ‘mo, pero no son completamente fijas, pues pueden ser li- geramente modificadas por otros factores del ambiente, en particular por la composicién del medio, Velncidas de crecimiento [GEER Gtecto dot temperatura sobre ta volociad de crech Imientoy corsecuencias moleculares para la cul Lao res tempera tras caruinales varian para cada organisiH0,152 = Capitulo 6 = CRECIMIENTO MICROBIANO La temperatura maxima de crecimiento de un organis- mo determinado tefleja probablemente la inactivacion de tuna o mas proteinas en la célula. Sin embargo, los factores quedeterminan la temperatura minima de crecimiento de un Corganismo no son tan claros. Coma se mencioné antes (06t- se Seccién 4.5) la membrana citoplasmatica debe estar en un estado fluido para su correcto funcionamiento y tal vez la temperatura minima de crecimiento sea resultado de la wcon- ‘gelacion» de esas funciones de la membrana en cuanto al transporte de nutrientes o a la formacién del graciente de protones. Esta interprotacidn ests tespaldada por experi entos en los que la temperatura minima de un organismo uede alterarse en alguna medida varianda la composicién lipfdica dela membrana (ase Secei6n 6.9). Las temperatt ras cardinales o fundamentales de diferentes microorganis- ‘mos difieren mucho entre si; algunos muestran temperatura Sptimas tan bajas como 4°C y otros tan altas como més de 100°C. Elrango de temperaturas en el que ocurre crecimiento «incluso mas amplie queeste margen, desde temperaturas pordebajo del punto de congelacion hesta temperaturas su- Periores a las de ebullicidn (jla arquea Pyrolobus fumarti tie- Fe una temperatura maxima de 113°C), No obstante, no hay rhingtin microorganismo que tenga todo este intervalo de temperaturas que, para el caso de un organismo determina- do, suele ser de unos 30°C, aunque algunos presentan mar- _genes de temperatura mas amplics que otros. Clases de microorganismos segiin la temperatura Aunque existe todo un espectro continuo entre los micro- oiganimos, desde los que tienen st temperatura Optima a femperaturas may bajas hasta los que la tienen a tempera- tura alta, se pueden distinguir cuatro grupos de microonga nismos con relaci6n a su tomperatura Sptima: psieréfilos, ‘Velocisad ae crecimiento ‘ con temperaturas éptimas bajas; meséfilos, con tempera- turas dptimas moderadas; term6filos, con alias tempera- turas Optimas;e hiperterméfilos, con temperaturas 6ptimas muy elevadas (Figura 6.17). Los meséfilos se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acusticos y te- rrestres de latitudes templadas y tropicales. Los psicrofilos ¥ los terméfilos se encuentran en ambientes mity frios 0.ca- lientes, respectivamente, Los hiperterméfiles son tipicos de ambientes concretos extremadamente calientes como fuen- tes termales, géisers y fuentes hidrotermales submarinas (o¥anise Secciones 6.10 y 19.8), En Excherichia coli, un tipico mesbfilo, se ha estudiado con detalle el crecimiento en funcién de la temperatura y se han definido con precision las temperaturas cardinales 0 funda- ‘menlales, La temperatura Gptima de E.coli en un mediocom- plejoes39°C, la maxima 48°Cy la minima 8°C. Estos valores son susceptibles de pequenas variaciones debidasa diferen- tes cepas y, en general, las temperaturas maxima y minima suclen ser respectivamente mayores y menares cuando se Uusan medios complejos en vez de medlios definidos. /_ 6.8 Rovisién de conceptes LLatemperaturacsun factor ambiental importante en el contol delercenmentomicrobian, Las temperatura cardials one dlamentales definen le lemperaturas minima, Gptima y masa 2 Tas que erece cada onganiomo. Los microorganisms pueden agrupame segtn los margenes de tomperetara que reqs 4% :Cusles son ls temperaturas cardinales aproximadas de Esoherchia coli? 2A que clase pertenece por Su temperatura ptima? 1 gEn aque se diferencia um hiperiermsile de un pico? 7 scherichia coli puede crecera temperatura més alla en me dio complejo que en medio defi. Por que? @ 7 a oo 10 0 120 Temperatura PO) Rolaciin ene la temperature y las velocidades de creciverto de paris, mesofies, eMmoHIOs y dos hipertermotios Ge Tentes. En cact caso, se hcican ls ternperaturas Sptimas de microorganismos representatiros.6.9 = CRECIMIENTO MICROBIANO A BAJAS TEMPERATURAS © 153 temperaturas Como los seres humanos vivime: perficie de nuestro planeta en lugares donde las tempera turas son generalmente moderadas, consideramos que los, ambientes muy calientes y muy fries son «extremos». Son fextremos para Jos humanos porque moririan rapidamente si se les metiera en agua hirviendo o en agua congelada. Sin embargo, los habitat normales de muchos microorga~ rismos pueden ser extremadamente calientes 0 extrema- damente frios. Tales microorganismos se conocen como extreméfilos (oéanse Secci6n 24 y Tabla 2.1) y han evolu ionado hasta crecer de modo éptimo en esas condiciones. Aqui consideraremos organismos que crecen a bajas tem- peraturas. y trabajamos en la su: Ambientes trios Gran parte de la superficie terrestre experimenta bajas tem peraturas. Los océanos, que representan mass de la mitad de lasuperficie terrestre, tienen una temperatura media de 5°C ‘ylas profundidades marinas tienen temperaturas constan- fes de 1-3°C. Enel Artico y en el Antartico hay vastas dreas permanentemente congeladas, o que se descongelan solo algunas semanas al aio (Figura 6.18). Estos ambientes fri- tsraramente son estériles y se encuentran microorganismos Yivos creciendo a cualquier temperatura baja en la que atin exista agua liquida, Incluso en muchos materiales congela- ny dos existen normalmente pequeas Zonas microscépicas con agua Iiquida donde los microorganismos pueden metaboli- zar y crecer. Es importante distinguir entre los ambientes que son frios alo largo del ano y aquellos que son frios soa mente en el invierno. Los uiltimos son caracteristicos de cli- mas continentales templados y pueden tener temperaturas estivales fan altas como 40°C y temperaturas invernales de =20°C 0 mas frias. Tales ambientes altamente variables son mucho menos favorables para los organismos adaptadosal frio que los ambientes que estan constantemente frios, como los que se encuentran en las regiones polares, aelevadas turas, en las profundidades ocesnicas, Microorganismos psicréfilos y psicrotolerantes Como ya se indies, losorganismoscon temperatura Sptima baja se llaman psier6filos. Un psicrofilo puede definirse como un organisme que tiene una temperatura dptima de crecimiento de 15°C 0 inferior, una temperatura maxima de crecimiento por debajo de 20°C y una temperatura mi- rnima de crecimiento de 0°C 0 mas baja. Los onganismos que crecen a 0°C pero tienen temperaturas optimas de 20-40°C se llaman psicrotolerantes, Los psicrotilos se encuentran en ambientes perma- rnentemente frios, como en las regiones polares y sus sedi- mentos marinos, y mueren répidamente si se exponen a temperatura ambiente normal. Por esta razén, su estudio en laboratorio requiere un gran cuidado para estar seguros de que nunca se calientan durante el muestreo, el trans porte al laboratorio, elaislamiento y otras manipulaciones. irr ‘Misroorganiemos del hielo del mar Antarico, a) Una muestra de agua de mer permanortomentehelada de MeMurda Sound, An Hits. Nétezo Ia irtonaa coloracién debida a microorgariamos pigmentados y la betaincluida como eecala, (2) Miciografa de contraste de ase emicroorganiemcs fototrofos de la mvestra anterior. Lammaycria de los microogarismos sen diatormeas oalgas verdes (odos microorganismmos carta154 © Capitulo 6 = CRE IENTO MICROBLANO Algunos de los psicrOfilos mejor estudiados son algas que crecen en masas densas entre o bajo el hielo de las re- giones polares (Figura 6.18b). Las algas psicrofilas se ob- servan a menudo sobre la superficie de zonas nevadas y slaciares en ntimero tan elevado que prestan un color rojo © verde a la superficie (Figura 6192). El alga de las nieves mas comtin es Chlamydomonas nioalis, cuyas esporas de Jor rojo brillante son las responsables de la oasional tona- lidad rojiza de la nieve (Figura 6.19b). Estaalga verde crece dentro de la nieve como células vegetativas con pigmenta- ci6n verdosa y luego esporula; cuando la nieve se der ha erosidn y la vaporizacién facilitan que las esporas se con- centren en la superficie. F mente en campos de nieve permanente que se derriten en algas se ven mis frecuento- el verano y son bastante comunes en dreas soleadas y secas, ya que en zonas mas lluviosas son lavadas de los campos de nieve. Ademis de las algas delas nieves, se conocen bac- terias psicr6filas quimioorganotrofas, muchas de las cua Jes proceden del Antitico (Figura 6.184). Alyunas de estas tienen la temperatura maxima menorde crecimiento de to- dos los microorganismos conocidas. Los microorganismos psicrotolerantes tienen una dis- tribucién mucho més amplia que los psicrofilos, y se pue- den aislar desuelos y aguas en climas templados asi como de cames, leche y productos derivados, sidra, vegetales y {ruta almacenada bajo refrigeracion (4°C). Como se ha alado, los psicrotolerantes crecen mejor a temperaturas entre 20-40°C, Como los ambientes templades se calientan «en verano, no se pueden desarrollar en ellos los psicr6filos, {que son sensibles al calor, y el calentamiento representa una = @ @ fuerza selectiva que favorece a las especies de psicrotole- antes y excluyea las formas psicrofilas. Debe sefialarse que aunque los psicrotolerantes son capaces de crecer a 0°C, no ccrecen muy bien a esa temperatura y, a veces, deben espe- rarse varias semanasantes de que se pueda apreciar el cre- cimiento de colonias en medios de cultivo. Varios géneros de Bacteria, hongos, algas y protozoos tionen representan- {es que son psicrotolerantes. Adaptaciones moleculares a la psicrofilia Los psicréfilos produ 1as que funcionan dptima: mente en frie y que con frecuencia se desnaturalizan o in- activan incluso a temperaturas muy moderadas. Las bases molcculares de este hecho no se conocen por completo pero se ha ebservado que, en general, las erzimas actives en frio poseen mayor cantidad de hélices-a y menor cantidad de hhojas-B en su estructura secundaria (odéense Seccin 37 y Fie gura 3.16) que las enzimas que son inactivas en frio. La dis- posicion en hoja-B tiende a ser una estructura mas rigida, y la mayor cantidad de helices-« en las enzimas activas en ‘rio puede permitir a estas proteinas mayor flexibilidad en ‘esas condiciones. Las enzimas activas en frio también tien: den a tener mas aminoicides polares y menos aminoici ‘dos hidrotébicos que las enzimas presentes en mes6filos terméfiles, lo que puede servir igualmente de ayuda para matener la proteina flexible y enzimaticamente activa a ba- jas temperatura Otra caracteristica de los psieréfilos, en comparacién con los meséfilos, es que el transporte activo (oéase Seccién 4,7) funciona mejor baja temperatura, lo que indica que la E WGN i oa tven a ince cerns mn Sera \ina, Calflora, con colorctn‘oj dobidaa a procera deals La ‘nieve rondo comin durante al vmno en bance deriv de a varie ates en Yodo e mundo) Microgratias de exporas pi mera en oe dl sig de aa ewes Cardona Ls coporaa geinan organo cla del la verdes moves. pe cies lasionadan ccna igadea eve Gue comin cere i mmentos cavtenedes (vease Secon 173) por todo, as rons Ccupeds por ot ga dea reve tat puton so vr, rai rman o purpura,membrana citoplasmatica de los psicrifilos esta construida etal mocio que las bajas temperaturas no inhiben estos fe- némenos. Diversos estudios sobre la composicin de las ‘membranas en los psicrOfiles han puesto de manifiesto que tienen un mayor contenido en dciclos grasoss no saturados (ase Seccién 5.15), lo que facilita el estado semifluido de Jas membranas a baja temperakira (las membranas com plestas fundamentalmente de écidos graves saturadox se ‘yuolven céreas y no funcionales a esas temperaturas). Los los de algunas bacterias psicréfilas también contienen Bes procs polimatiadere Nidmcarburye Sa cadena Jaga con muchos enlaces dobles. A este respecto, en los li- pidos de algunas bacterias del Antirtico se ha identificado unhidrocarbure con nueve dobles enlaces (Cyy3),y la bac- Aetia Paycroflexes contiene deidos grasos con 4 y 5 dobles enlaces. Congelacion Apesar de la capacidad de algunos organismos para crecer a bajas temperaturas, existe un limite por debajo del cual es ‘imposible la reproduccidn. Flagua pura se congela a (fC y lagna de mara ~2.5°C; pero la congelaciéin no es un pro- -xs0 homogéneo, ¢ incluso a temperaturas mas bajas exis- ten depssitos microscépicos de agua no congeladls. Aunque acongelacisn evita cl crecimiento microbiano no causa ne- exsariamente la muerte celular. Adem: sion de las células afecta su sensibilidad al frie. Los iquides solubles en agua, como el glicerel y el dimetilsul- féxido (DMSO), cuando se anaden al medio una concen- {racin final de! 10%, penetran en las células y las protegen de los efectos de la deshidratacién a la vez que evitan la formacion de cristales de hielo, De hecho, la adici6n de ta- les agentes, denominades crioprotectores (0 criogenicos), es lun metodo habitual para conseraar los cultives microbianos a femperaturas muy bajas (normalmente de 70°C a 196°C). Las células congeladas, preparadas adecuadamente, pue- den permanecer viobles durante mucho tiempo (al menos varias décadas), 16.9 Revisién de conceptos [is organismos con temperaturas éptimas bajas se Haman ps ‘ies y les semplos masextremos habitan ambientes perma- hentemente fries. Los psirofiles paseen moleuls biol {he funeionan mejor a baja temperatura, pero ancrmal sensibls a tempernturas templadas. J. dfin qué se diferencia un onganismo psierfilo de un psiero- tolerate? 4 2Qué adaptaciones presenta la membrana cituplasmaitica de ls psicrofilos y por qué son necesarias? Crecimiento microbiano a altas a vida microbiana erece bien en ambientes con elevada lemperatura, incluso en el agus hirviendo. Por encima de las formas procaridticas de vida, peroen esas es existe una enorme diversidad de microorga- 6.10 = CRECIMIENTO MICROBIANO A ALTAS TEMPERATURAS = 155 nismos pertenecientes a Bacteris y Arclues. Consideraremos algunos de estos ambientes calientes y sus formas micro- bianas de vida Ambiontes con temporaturas altas Recordemos que los microorganismos cuya temperatura Gptima est’ por encima de 45°C se Laman terméfilos: y que aquéllos cuya temperatura dptima esti por encima de 80°C son los hiperterméfilos (Figura 6.17). En a naturaleza, tem- peraturas tan allas s6lo se encuentran en algunas dreas muy restringidas. Por ejempio,en suelos muy expuestos a la luz solar se alcanzan a mediodia temperaturas superiores a 50°C, ¢ incluso se puede llegar a los 70°C, aunque en unos pocus centimettos por debajo de la superficie la tempera furs es mucho mis baja. Les materiales en fermentacién, ‘como las actimulos de abono y los ensilados, pueden al- canzar facilmente temperaturas de 60-65°C. No obstante, en la naturaleza los ambientes extremes mas extensos y con temperaturas mas altas estén asociados a fenomenos vol- canices, Muchas fuentes termales tienen temperaturas préximas a la de ebullicidn y las fuentes hidrotermales submarinas (fumarolas) pueden alcanar los 150-500°C. Las fuentes hi- drotermales del fondo de los oceinos tienen lemperaturas de 35("'C 0 superiores (verse Secci6n 19.8), Las fuentes ter- males se encuentran distribuidas por todo el mundo, pero se concentran particularmente al oeste de Estados Unidos, Nueva Zelanda, Islandia, Japn, Italia, Indonesia, Améri Central y Africa Central. La zona de mayor concentracién cle este tipo de fuentes termales esel Parque Nacional de Ye~ Howstone, Wyoming (USA). Aungue en algunas fuentes termales la temperatura es variable, en otros es muy cons- tante, con variaciones: menores de 1-2°C en varios aos. ‘Adeentas, estas fuentes tienen composiciones quimicas y va lores de pH diversos, yen general contienen niveles sufi- cientes de nutrientes que permiten el crecimiento de poblaciones de quimioorganoirofos y quimiolitotrofos, Hipertermotiios en fuentes termales Muchas fuentes termales tienen el agua en el punto de ebullicién a una altitud dada (92-93°C en Yellowstone, 99-100°C en localidades mas proximas al nivel del mar). En fuentes termales en ebullicion (Figura 6,20), hay una gran variedad de hipertermofilos tipicos. El crecimiento de estos organismos puede estudiarse mediante la in~ mersién de portaobjetos (para microscopia) en la fuente y su extraccidn al cabo de unos ‘sépico de los portadbjetos pone de manifiesto colonias de otas (Figura 6.206) que se desarrollan a. partir de ws aisladas que se adhieren y crecen sobre ta su perficie del vidrio, Los estudios ecaligicos de estos organismos que viven en fuentes termales en ebullicidn demuestran que las velo- cidades de crecimiento son notablemente répidas y con tiempos de gencracién inferiores a 1 hora. Se han obtenido. eultivos de muchos de estos procariotas y existen muchos tipos morfologicos y fisiolégicos (osase Capitulo 13), Los e3- tudios filogenéticos basados en lo secuenciacién del RNA ribosémico (oéense Secciones 2.2.y 11.5) han revelade una ran diversidad evolutiva entre estes hiperierméfilos, como© SLED] Ciecimonio de biparermtios en agua hiviendo. a) Boulder Sprna, un peqvera arroyo de agua hivente enol Parque Na- cional de Yelowstane. Este arroyo calerte preseta una temperatura de 1-2°C por encma del purte de ebulliién. Los depésitos minera les cerca del cauce son de slice y aut. (3) Micrograia de una mi crocolonia de procaritas desaralasa sobre un portatjetosinerso onal agua del cauce varias Bacteria y especialmente Archaed. Algunos de estos hipertermofilos presentan temperaturas Optimas superiares 1 100°C y, por tanio, en el Laboratorio se cultivan en cama- ras presurizadas que permiten aleanzar temperaturas s periores al punto de ebullicion, Terméfilos Muchos terméfilos (temperatura dptima 45-80°C), se pre- sentan en fuentes termales y en otros ambientes cilidos. En fuentes termales,a medida que el agua hirviendo emer ge, se desborda de las orillas se aleja dela fuente, se en- fria gradualmente y origina un gradiente de temperalura. A lo largo de este gradiente crecen varios microorganismos (Figura 6.21), con diferentes especies que crecen en los di ferentes rangos de temperaturas. Estudiando la distribu- ci6n de las especies en tales gradientes y examinando las fuentes termales y otros ambientes lermales a diferentes temperaturas en distintas partes del mundo, es posible de- terminar los limites superiores de temperatura para cada clase de organismo (Tabla 6.1). A partir de esta informa- Gdn, se ha Tlegado a la conclusién de que (1), en general, los organismos procaridticos son capaces de crecer a tem: peraturas mas elevadas que los eucaristicos; (2) los mis terméfilos de todos los procariotas son algunas especies de Archaea: y (3) los organismos no fototrsticos son capa cos de crecer a temperaturas mas elevadas que las formas fototréficas. Los procariotas terméfilos se también en ambientes térmicos antificiales. Los calentadores de agua dlomésticos o industriales tienen temperaturas de 35-80°C y constituyen por tanto un habitat favorable para el creci miento de procariotas termofilos. fn calentadores de agua, se han aislado organismos semejantes a Thermus oquatl cits, wn termofilo Commun en fuentes termales. Las centra- jas industrias que usan agua caliente y otras artificiales de naturaleza térmica son sitios don: Ge pueden crecer los termatilos; y en ellos se pueden aislar faciImente utilizando técnicas adecuadas de enriqueci- miento. Adaptaciones moleculares a la termofilia £Cémo pueden crecer los terméfiles y los hiperterméfilos a tan altas temperaturas? En primer lugar, sus enzimas y TEENA Sesinints de wra carotacira teria un are ‘yo de agua caliente de! Parque Nacional de Yellowstone. Patrén de desarolo caracterstico en el gradiente térmico, formada por cieno ‘bacterias en el limite superior de temperatura, 70-74°C. Eipatrén cam bia porque el agua se entia mds rapidamente en los borces qu en centro del cauce. El agua fuye desde dts de la fotografia hacia ol fondo de la misma. Por encima del ugar donde al centile aparece arrodilado el agua esta carnasindo calles par al desarrolo de ce- nohacterias, El color vordos9 #2 debs @ algunas formas de Synecho ‘coccus resistentas a la temperatura. A medida que thie el egua ere ‘gradionte, a masa de céllas aumenta y el cobr verde se intensific