Trường Đại học Y Hà Nội

Bộ môn Bệnh học phân tử

Kỹ thuật tách chiết RNA

GV: Nguyễn Quý Hoài
Mục tiêu học tập
1. Trình bày nguyên lý của kỹ thuật tách chiết RNA toàn phần
2. Hiểu được tác dụng của một số hóa chất tách chiết
3. Trình bày được khái niệm cDNA, RT-PCR và ứng dụng của ngân hàng cDNA
Video
Link: https://youtu.be/MgNicWbANkA
1. Giới thiệu chung
• RNA kém bền và dễ phân huỷ bới enzym ribonuclease (RNase) có nhiều ở khắp
nơi, hoạt tính cao và bền nhiệt (90°C)
• Để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch, ngoài phenol chloroform còn sử dụng
Guanidinium thiocyanate
• Để tách RNA ra khỏi hỗn hợp acid nucleic, dùng pH acid (pH = 4)
• Bảo quản RNA sử dụng DEPC (Diethylpyrocarbonat)
Dung dịch Histopague 1077
Guanidinium thiocyanate
Guanidinium thiocyanate là dung dịch muối mạnh làm biến tính protein, RNase,
và tách rRNA từ protein ribosome.
Khi có mặt chloroform, các dung môi phân tách hoàn toàn thành hai pha với màu
sắc khác nhau: pha nước ở trên (chứa các axit nucleic) và pha hữu cơ ở dưới (có
chứa các protein hòa tan trong phenol và lipid hòa tan trong chloroform)
2. Nguyên lý kỹ thuật tách chiết RNA
1. Phá vỡ màng tế bào
2. Loại bỏ protein và peptide
3. Tủa RNA
 Quy trình tách chiết RNA toàn phần bằng Trizol

pH acid

Bảo quản -800C DEPC

Quy trình tách chiết RNA toàn phần bằng cột ly tâm
Quy trình tách chiết RNA toàn phần bằng bi từ tính
Video
Link: https://youtu.be/RmPsLoIPRwc
 mRNA
• mRNA chiếm 1-5% tổng số RNA trong tế bào
• mRNA rất đa dạng và có kích thước khác nhau. Tuy nhiên, tất cả đều có đuôi poly A
• Để tách mRNA, chúng ta phải đi từ tế bào biệt hoá biểu hiện gen cần nghiên cứu, nghĩa
là số lượng mRNA ở đây phải nhiều hơn ở các vị trí khác.
• Ứng dụng: nghiên cứu về biểu hiện gen (gene expression), hay các đột biến mất đi một
hay nhiều exon (hiện tượng skip exon)
Phương pháp sắc ký ái lực oligodT-xenlulose

RT PCR
 cDNA (complementary DNA)
• cDNA là phân tử DNA được tổng hợp từ RNA nhờ enzym phiên mã ngược
Reverse transcriptase
à So sánh cDNA và gDNA?
 Ngân hàng cDNA
Ø Tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của 1 tế bào. Ngân hàng được thiết lập
từ 1 loại tế bào xác định, vì vậy chúng mang tính tế bào cao.
ØMục đích
§ Nghiên cứu biểu hiện của 1 gen xác định cùng với những vấn đề liên quan (như điều
hòa biểu hiện gen). Tuy nhiên việc phân tích kết quả đòi hỏi sự thận trọng, vì sự biểu
hiện của 1 gen phụ thuộc rất lớn vào tình trạng sinh lý tế bào, một số gen được phiên
mã nhưng không được dịch mã.
§ Xác định thành phần, cấu trúc của protein được mã hóa bởi đoạn DNA cụ thể, biểu
hiện của gen, của mRNA
RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) là phương pháp
dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược.
Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzym:
• Enzym Reverse Transcriptase
• Enzym DNA Polymerase
Kỹ thuật RT-PCR có thể thực hiện theo một bước hoặc hai bước.
 Các bước tổng hợp cDNA

1. Ủ mẫu với enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase)

để tổng hợp sợi đơn DNA
2. Phá hủy liên kết hidro giữa DNA-RNA bằng dung dịch
kiềm. Cấu trúc dạng kẹp tóc được hình thành
3. Ủ với enzym DNA polymerase để tổng hợp mạch còn lại
4. Sử dụng enzym S1 nuclease để cắt cấu trúc kẹp tóc
RT-PCR một bước/ hai bước
 Ứng dụng của kỹ thuật RT-PCR

Ø Phát hiện các gen có nguồn gốc từ các retrovirus: HIV, cúm gia cầm…

Ø Dùng để nghiên cứu biểu hiện gen

Ø Xác định sự biểu hiện của gen được biến nạp hay chuyển nạp vào vật chủ mới

Ø Thu được đầy đủ chiều dài của gen quan tâm