一、叶绿素含量的测定

⑦ 叶绿素 a/b 含量测定

每个处理称取 3 份剪碎的新鲜样品 0.1 g 放置在 2 毫升离心管，加入 2 ml 无水乙醇，室温避
光保存过夜。待叶片组织全部变白，使用紫外分光光度计，分别在
645nm、663nm、470nm 波长进行比色，以无水乙醇为空白调零。根据各波长的 OD 值按照
李合生的方法计算叶绿素 a、叶绿素 b 的浓度（mg·L-1），根据下列公式计算叶绿素浓度及
样品中的叶绿素含量。
叶绿素 a 浓度：Ca=13.95D665-6.88D649
叶绿素 b 浓度：Cb=24.96D649-7.32D665
总叶绿素浓度：Ct=Ca+Cb
色素在叶片中的含量（mg/g）=色素浓度（mg/L）×提取液总体积（ml）×稀释倍数/样品质
量（g）

二、花青素含量的测定

盐酸-甲醇提取花青素
1. 将植物叶片尽可能剪碎，取 0.1g 放入有 5mm 小钢珠的 2mL 离心管中，放入液氮罐中速
冻 5 分钟，用镊子拿出后，用球磨仪 1500 转 1min 将样品打成粉末。注：球磨仪放置盒在
液氮中过一下，要不样品打不碎。
2. 加入 1mL1%盐酸-甲醇溶液，摇晃混匀倒到 10mL 的棕色离心管中，贴上标签纸并写清楚
品种名称和重复，然后加入 10mL 的 1%盐酸-甲醇溶液。（加溶液带上手套和口罩，甲醇微
毒）
3. 将离心管用涡旋震荡仪震动混匀后，放置于 4℃冰箱，锡纸遮光浸提 12h，在此期间摇晃
3~4 次。
4. 带上酶标仪、200ul 的移液枪和黄枪头、笔记本和手套口罩，吸取浸提液点样 200ul（在
纸上要标注好加样的顺序），每一板都要用 1%盐酸-甲醇溶液做空白对照，在 530nm 下测
吸光值。
以 A530 = 0.1 作为花青素单位（Unit），相对花青素含量 = A530 x 10
1%盐酸甲醇溶液：吸取浓盐酸 2250 μL 滴入 200mL 甲醇

三、植酸酶含量的测定

1、以磷含量为横坐标，OD415 吸光值为纵坐标，建立标准曲线；

1. 制备磷标准溶液(50 mM)；

2. 将磷标准溶液梯度稀释成 0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM 和 6 mM 的溶液 50mL；

磷 终 浓 度 0 0.5 1 2 4 6

mM

磷标准液 mL 0 0.5 1 2 4 6

蒸馏水 mL 50 49.5 49 48 46 44
3. 标曲配置与待测样品步骤相同，可同时配置。每 30 个样（一个板）搭配一组标曲。

2、待检测样品浸提；

1. 取 0.1 g 鲜样于 2 mL EP 管中，并放入钢珠 4 颗，液氮速冻高通量组织研磨 20s，55Hz；

2. 加入植酸酶提取液 1mL，离心(4000r/min，4°，10min)，取上清于新 1.5 mL EP 管，得到

植酸酶浸提液。

3、酶活性测定反应

1. 取新 1.5mL 管，先加入 160 uL 乙酸缓冲液，再加 160 uL 浸提液/标准液，37℃预热 5

min；

2. 所有管加入 160 uL 的植酸钠溶液，37℃保温 30 min；

3. 所有管加入显色液 320 uL，若出现浑浊，离心 6000 r/min，2-4min，

4. 取 96 孔酶标板，每个样（EP 管）分 3 孔，每孔 100 uL，吸取时敲打混匀反应液，第一

枪不加入板中（有机溶剂会沾在枪头中造成误差）只打一档，用酶标仪测定 415 nm 吸光

值。此过程最好控制低温环境，温度过高离心后的反应液还是会出现浑浊。

注：从加入植酸钠底物开始，每个管加样时间间隔一致，控制每个反应时间均为 30 min。

4、酶活性测定反应

结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线建立的直线回归方程，计算出各个待测

样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出待检测样品中的植酸酶活性：
U / g = Y m × 30 × N

Y-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度（mmol/L）；

N-样品溶液的稀释倍数（此为 1）；m-样品质量（g）；30-反应时间，min。

一、试剂与溶液

1.磷酸二氢钾（KH2PO4）：准确称取 0.6804g 在 105℃烘至恒重，于 100ml 容量瓶中，用乙

酸缓冲液（250mmol/L）溶解并定容后形成磷标准溶液（50mM）。

2.乙酸缓冲液（250mmol/L）：称取 20.52g 无水乙酸钠，加水搅拌溶解，用冰乙酸调节 pH

至 5.5，再转移至 1000ml 容量瓶中定容，4℃存放。

3.植酸酶抽提缓冲液：称取 20.52g 无水乙酸钠，加水搅拌溶解，用冰乙酸调节 pH 至 5.5，

再转移至 1000ml 容量瓶中定容，4℃存放。用前加入 0.075%的 TritonX-100（在生命科

学领域，该产品经常被用于水中帮助分解蛋白酶；但是，必须使用尽可能低的浓度否则
 会污染样品）。

4. 植 酸 钠 （ 15mmol/L ） ： 称 取 植 酸 钠 （ C6H6O24P6Na12 相 对 分 子 量 为 923.8 ， 纯 度 为

95%）1.38g，用乙酸缓冲液溶解，用冰乙酸调节 pH 至 5.5，再转移至 1000ml 容量瓶中

定容，4℃存放。

5.硝酸溶液：1 份浓硝酸加入 2 份水。

6.钼酸铵贮液（100g/L）：称取 10g 钼酸铵，加水溶解，定容至 100 ml，置棕色瓶 4℃保

存。

7.偏钒酸铵（2.35g/L）：称取 0.235g 偏钒酸铵溶于水，加入 2mL 硝酸溶液，必要时可微加

热。然后定容至 100mL，棕色试剂瓶，避光 4℃保存。

8.酶促反应终止液及显色液：取 2 份的硝酸溶液，1 份的钼酸铵溶液， 1 份偏钒酸铵溶液，

混合后使用，现用现配。

二、仪器和设备

分析天平：感量 0.1mg；微孔板连续波长生物测读仪，微孔板恒温振荡器，圆周震荡摇

床，磁力搅拌器，涡流式混合器，pH 计，离心机，研磨仪，酶标仪。

烧杯，100，1000mL 容量瓶，

试剂整合：

磷酸二氢钾（KH2PO4 ），无水乙酸钠（ CH3COONa），冰乙酸，TritonX-100，植酸钠

（C6H6O24P6Na12），浓硝酸，钼酸铵（H8MoN2O4），偏钒酸铵（NH4VO3）。

四、酸性磷酸酶

紫色酸性磷酸酶

醋酸钠缓冲液：醋酸钠 3.85g+冰乙酸 0.25ml，定容至 1000ml （PH=5.8, 50mM）

2M 氢氧化钠：100ml+8g

1mM 对硝基苯酚：用醋酸钠缓冲液配制 0.01391g/100ml

1mM 对硝基苯酚磷酸二钠：用醋酸钠缓冲液配制 0.139g/350ml

标曲

1mM 对硝基苯酚 0 400 500 600 700 800

醋酸钠缓冲液 uL 1300 900 800 700 600 500

 氢氧化钠 uL 200

静止 2min，405 测 OD

1. 加入 1.5ml 缓冲液，4℃，9000r 离心 15min

2. 取上清液

上清液 300ųL

1mM 对硝基苯磷酸二钠 1000ųL

37℃水浴 15min

氢氧化钠 200ųL

3. 405 测 OD

n：标曲对应的对硝基苯酚的物质的量 n（umol）

M：对硝基苯酚分子质量 139.11 g/mol

N：稀释倍数 1

W：样品鲜重 0.1 g

T：反应时间 15 min

更实际的和常用的值是酶单位（U）= 1μmol/min。
 1mM 对硝基苯酚 0 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

mL

对硝基苯酚物质的 0 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

量(n)μmol

μg·h-1·g-1 =0.4×10-3mmol-1×10-3×139.11gmol-1/ （ 0.1g×0.25h ） =0.4μmol×10-3×139.11gmol-

1
×（10g-1×4h-1）=0.4×10-3×139.11×10×4 μg·h-1·g-1 =0.4×5.5644μg·h-1·g-1 = 2.22576 μg·h-1·g-1