Case 1: Thiết kế thí nghiệm nhằm phát hiện corona virus 2019 trong mẫu bệnh phầm

1/ Mục đích thí nghiệm: Xác định hiện diện của gene RdRp_SARSr-P2 (108bp).
Giả thuyết: Có hay không sự hiện diện của gene RdRp_SARSr-P2.
2/ Cơ sở khoa học: Theo công bố của Victor M.Corman và cộng sự, Euro Surveill, 2020, gene
RdRp_SARSr-P2 (108bp) đặc trưng cho virus 2019-nCoV và không phát hiện trên SARS-CoV.
3/ Mô hình thí nghiệm: Tách chiết RNA tổng số có trong mẫu bệnh phẩm để phát hiện gene
RdRp_SARSr-P2 bằng RT-PCR.
4/ Quy trình thí nghiệm:
- Tách chiết RNA: Quy trình được thực hiện tương tự như phương pháp được mô tả bởi
Mohanty và cộng sự, nhưng đã được sửa đổi
+ Lấy 1 ml mẫu bệnh phẩm, thêm 500 µl dung dịch đệm dừng. Ly tâm ở 5000 g, 5 phút ở 4°C.
+ Huyền phù phần cặn trong 200 µl dung dịch ly giải bằng vortex.
+ Đặt mẫu vào đá khô trong 90 giây và sau đó ủ 90 giây trong bể nước 37°C, lặp lại bốn lần.
+ Cho vào mẫu dung dịch huyền phù ethanol đá khô, 35 µl acid axetic 20 mM.
+ Đặt trở lại bể nước 37°C, thêm 200 µl Catrimide 10% khi mẫu đã tan hoàn toàn.
+ Vortex nhanh và ly tâm ở mức 16 000 g trong 10 phút ở 4°C.
+ Cặn được huyền phù trong 500 µl LiCl 2 M trong ethanol 35% bằng vortex.
+ Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút, ly tâm ở 16 000 g trong 10 phút ở 4°C.
+ Chuyển cặn vào trong 500 µl LiCl 2 M trong nước sau đó lặp lại quá trình ly tâm.
+ Phần cặn được vortex nhanh trong ethanol 75%, ly tâm ở 8000 g trong 5 phút ở 4°C.
+ Loại bỏ dịch nổi sau đó ly tâm nhanh và loại bỏ phần dịch nổi còn lại.
+ Phơi khô cặn trong không khí 10 phút, thêm 100 µl nước và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
+ Vortex mạnh, ly tâm ở lực tối đa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, chuyển dịch nổi sang ống mới.
- Thực hiện RT-PCR:
1. Tổng hợp cDNA: Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của công ty Invitrogen cho
enzyme Superscript II reverse transcriptase và có một số chỉnh sửa.
+ Cho 5 µg RNA vào 7 µl H2O.
+ Thêm 5 µl mồi (100 ng/µl) (có thể dùng hexamer).
+ Biến tính ở ~85° trong 3 phút. Cho vào đá, lắc đều.
+ Thêm 4 µl đệm 5x First Strand; 2 µl 0,1 M DTT và 1 µl 15 mM dNTP (cty Amersham
Pharmacia Biotech).
+ Trộn kỹ và ủ ở 42°C trong 2 phút.
+ Thêm 1 µl enzyme Superscript II (200 U/µl). Ủ ở 42° trong ~1 giờ.
+ Vô hiệu hóa ở nhiệt độ ~85° trong 10 phút.
+ Thu nhận cDNA.
2. Phản ứng RT-PCR one-step: quy trình được thực hiện tương tự hướng dẫn của công ty
Qiagen cho Qiagen QuantiTect SyBr Green RT-PCR Kit và có sửa đổi cho phù hợp.
+ Thiết kế primer.
+ Chuẩn bị Solution 1 (20µl H2O, 1 µl primer.up 6.25 µM, 1 µl primer.dn 6.25 µM, 10 µl Qiagen
Quantitect Sybr Green-Enzyme and Dye mixture/ cho mỗi phản ứng, khuyến nghị +1 phần
Solution 1 dư).
+ Thêm 1 phần Solution 1 cho mỗi 8 µl cDNA (đã pha loãng 1:16).
+ Thiết lập phản ứng PCR.
95°C 15 phút
94°C 30 giây
55°C 30 giây
72°C 1 phút
+ Thực hiện 39 chu kỳ.
+ Lưu mẫu ở 12°C cho tới khi sử dụng.
5/ Kết quả kỳ vọng
Thấy được sự khác biệt giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng.
6/ Xây dựng đối chứng
- Chứng nội: DNA người để xác định điện di thành công.
- Chứng dương: chứa gene RdRp_SARSr-P2 để xác minh tính chính xác của thí nghiệm.
- Chứng âm: dung dịch đã bảo quản RNA là nước và không chứa gene RdRp_SARSr-P2
để kiểm soát nhiễm chéo.
7/ Đọc kết quả
Xác định kết quả thông qua phương pháp điện di trên gel agarose 2%
- Điện di thành công khi chứng nội và chứng dương xuất hiện, chứng âm không xuất hiện.
- Trường hợp 1: Mẫu bệnh phẩm được xác định là dương tính khi thấy vạch chứng nội,
vách 108bp (vạch thể hiện sự hiện diện của gene RdRp_SARSr-P2), chứng âm không
hiện.
- Trường hợp 2: Mẫu bệnh phẩm được xác định là âm tính khi chỉ thấy vạch chứng nội.
- Các trường hợp còn lại xem lại quy trình, các chứng để tránh trường hợp âm tính
giả/dương tính giả.
Định lượng bằng RT-qPCR để xem số bản sao của gene mục tiêu.

Ct

Dựa vào điểm Ct để xác định mức độ nhiễm corona virus trong mẫu bệnh phẩm.