Thiết kế thí nghiệm phát hiện Listeria monocytogenes trong mẫu bệnh phẩm?

1) Mục đích thí nghiệm:

Phát hiện đoạn gene hly A (1717 bp) trong mẫu bệnh phẩm thông qua đó khẳng định sự
hiện diện của L. monocytogenes.

2) Cơ sở khoa học:
Theo công bố của Ashwani Kumar, Sunita Grover và Virender Kumar Batish đăng trên
tạp chí 3 Biotech năm 2015, đoạn gene hly A là gene đặc trưng cho Listeria monocytogenes mà
không tìm thấy ở các loài Listeria khác như L. aquatica, L. booriae, L. grayi, etc.

3) Mô hình thí nghiệm:

Tách chiết DNA tổng số trong mẫu bệnh phẩm => thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại
gene hly A mục tiêu trong mẫu DNA tổng số => chạy điện di trên gel agarose 1,4%.

4) Quy trình thí nghiệm:

Giai đoạn 1: Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm theo quy trình của Mitchell Henry
Wright, Joseph Adelskov và Anthony Carlson Greene đăng trên Journal of Microbiology and
Biotechnology năm 2017 gồm cac bước như sau:
a. Chuyển 10ml dung dịch nuôi cấy mẫu bệnh phẩm vào ống falcon và ly tâm ở tốc độ
7,500 rpm trong 10 phút. Loại bỏ phần dịch nổi.
b. Tái huyền phù 476 μL dung dịch RNase 100 μg/mL trong dung dịch đệm P1 (chứa 50
mM Tris-Cl (pH 8.0) và 10 mM EDTA) rồi chuyển vào ống ly tâm 1.5 ml. Thêm 8 μL lysozyme
24,000 kU/mL và 5 μL achromopeptidase 50 kU/mL, trộn đều nhẹ nhàng và ủ ở 37 độ C trong
60 phút.
c. Thêm 30 μL dung dịch SDS (sodium dodecyl sulfate) 10% và 3 μL proteinase K 20
mg/mL, lật úp ống nhẹ nhàng rồi ủ ở 50 độ C trong 60 phút.
d. Thêm 525 μL dung dịch PCI (chứa Phenol:Choloroform:Isoamyl với tỷ lệ 25:24:1 ) và
trộn đều trong vòng 10 phút bằng cách lật úp ống nghiệm nhẹ nhàng. (Lưu ý: cần có dụng cụ bảo
hộ vì Phenol là chất độc, có thể gây bỏng nặng).
e. Chuyển phần dịch nổi ở phía trên vào ống ly tâm 1.5 ml vô trùng, cẩn thận không làm
xáo trộn hai lớp dung dịch.
f. Thêm ehthanol 100% ở -20 độ C với thể tích tương đương dịch nổi vào ống ly tâm rồi
lật úp để trộn. Ly tâm ở tốc độ 12,000 rpm.
 g. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi phía trên và làm khô hoàn toàn phần rắn còn lại ở nhiệt độ
phòng hoặc bằng cách ủ ở 50 độ C (Lưu ý: không để cho dung dịch bị quá khô vì như vậy sẽ gây
khó khăn cho việc hoà tan chúng trở lại vào dung dịch).
h. Tái huyền phù phần rắn khô bằng cách bổ sung 50 μL dung dịch đệm TE (chứa 10mM
Tris (pH 8.0) và 1mM EDTA) và bảo quản qua đêm ở 4 độ C.

Giai đoạn 2: Lựa chọn mồi

Theo công bố của Ashwani Kumar, Sunita Grover và Virender Kumar Batish đăng trên
tạp chí 3 Biotech năm 2015, đoạn mồi xuôi tên HF9 (F: 5′-gTTTggTTAATgTCCATgTT-3′) và
mồi ngược tên HR9 (R: 5′- TATTCTAgTCCTgCTgTCCC -3′) được thiết kế bởi Wagner và cộng sự
năm 2000 đặc hiệu cho vùng K9 dài 384 , một vùng không mã hoá trên gene hly A

Giai đoạn 3: Tiến hành kỹ thuật PCR với đoạn mồi HF9/HR9 đặc hiệu cho gene hly A của
L. monocytogenes:
a. Chuẩn bị các thành phần cần thiết cho hỗn hợp PCR với dung tích 25 μL theo công bố
có chỉnh sửa của Sameer A. Barghouthi trên tạp chí Indian Journal of Microbiology năm 2011:
 Sử dụng máy MiniCycler (MJ Research, Inc., Watertown, MA)
 0,8 μl dung dịch mồi HF9/HR9 25nM
 12,5 μL dung dịch Master Mix từ hãng Promega (chứa dung dịch 2X gồm Taq
DNA Polymerase, dNTPs và đệm phản ứng)
 0,5 μL mẫu DNA tổng số phân lập từ bệnh phẩm
 11,2 μL nước tiệt trùng

b. Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR theo công bố của Ashwani Kumar, Sunita
Grover và Virender Kumar Batish đăng trên tạp chí 3 Biotech năm 2015:
 Bước 1 - biến tính khởi đầu: 95 độ C trong 4 phút
 Bước 2 - biến tính cho từng chu kỳ: 95 độ C trong 30 giây
 Bước 3 - bắt cặp mồi: 58 độ C trong 1 phút
 Bước 4 - kéo dài: 72 độ C trong 1 phút
 Lặp lại từ bước 2 đến bước 4 với 35 chu kỳ

5) Kết quả kỳ vọng:

Thấy được sự khác biệt về kết quả điện giữa các mẫu đối chứng và mẫu bệnh phẩm.
6) Xây dựng đối chứng:
Chứng dương: thực hiện phản ứng PCR như trên nhưng thay DNA tổng số từ mẫu bệnh
phẩm thành DNA của L. monocytogenes
Chứng âm: thực hiện phản ứng PCR như trên nhưng không chứa mẫu DNA nào, thay
bằng H2O với thể tích tương đương
Chứng nội: thực hiện phản ứng PCR với DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm nhưng với đoạn
mồi đặc hiệu cho gene EF-1α (F: 5’ - CGAGATCAAGGAGAAGTGCG - 3’; R: 5’ -
CAACGGTCTGCTTCATGTCA -3’) được đề cập trong công bố của Hao Song và đồng sự trên
tạp chí PeerJ năm 2017 là đoạn gene giữ nhà (housekeeping gene) ở người ổn định nhất cho việc
chứng nội so với 12 gene khác được khảo sát như ACT, COX1, RL5, etc.

7) Đọc kết quả: Tiến hành điện di các sản phẩm phản ứng PCR trên gel agarose 1,4%
Trường hợp 1: Mẫu được xác định là dương tính khi:
 Mẫu DNA bệnh phẩm có hiển thị vạch
 Mẫu chứng âm không hiển thị vạch
 Mẫu chứng nội hiển thị vạch

Trường hợp 2: Mẫu được xác định là âm tính khi:

 Mẫu DNA bệnh phẩm không hiển thị vạch
 Mẫu chứng dương hiển thị vạch
 Mẫu chứng nội hiển thị vạch

Các trường hợp còn lại là không hợp lệ, yêu cầu xem lại thao tác kỹ thuật