BIOQUIMICA UF1 NF1

1. LES TÈCNIQUES ESPECTROMÈTRIQUES

Aquestes tècniques estan basades en la mesura de les radiacions electromagnètiques segons

com interaccionen amb la mostra (depenent les seves propietats).

Les radiacions electromagnètiques són un tipus d’energia que és poden expressar en ones o
partícules.

A menor longitud d’ona major és la seva freqüència i energia i a l’inrevés

Al laboratori s’utilitza principalment llum visible, UV i IR, amb aquestes llums es realitzen
tècniques espectrofotomètriques.

Què passa quan la radiació electromagnètica interacciona amb la matèria?

Es poden produir diferents fenòmens que depenen de factors com: agrupació, densitat,
concentració...
Mitjançant tècniques espectrofotomètriques pot permetre identificar i quantificar substàncies.

Absorció → espectrometria d’absorció molecular → UV-VIS/Infraroig

2. L’INSTRUMENTACIÓ: L’ESPECTROFOTÒMETRE

L’espectrofotòmetre és l’aparell que s’utilitza en les tècniques d’espectrofotometria.

El disseny de l’aparell varia segons la tècnica específica, però té uns elements comuns.

- Font de radiació: proporciona de forma contínua i estable

• Fonts d’espectre continu (absorció i emissió molecular)

• Fonts d’espectre de línies (absorció atòmica i emissió
molecular)
• Fonts de llum làser (espectrofotòmetres moderns.
(proporciona llum monocromàtica)
- Selector de longitud d’ona: permet obtenir llum monocromàtica

No és estrictament monocromàtica, sinó que té un ample de banda amb una λ nominal. A

menor ample de banda, resultats més exactes.

- Filtres: Són medis que només permeten el pas d’algunes λ (gran ample de banda). Els
interferencials tenen major capacitat de selecció que els d’absorció

- Monocromadors: Són dispositius òptics que dispersen la llum, separen les λ i seleccionen un
ample de banda estret (es pot escollir qualsevol λ d’un interval):

• Escletxa d’entrada: evitar l’entrada de llum difusa. Obtenir llum paral·lela

• Prisma o Xarxa de difracció: separa llum en les diferents λ
• Escletxa de sortida: permet el pas de la λ seleccionada
- Cubeta: recipient per col·locar la mostra durant la mesura

• Tenen diferents volums, però el camí òptic, generalment, és de 1 cm

• Diferents materials, normalment de plàstic amb 2 cares transparents i llises i 2 no

- Detector: Transforma el senyal lluminós en senyal elèctric.

• Estan basats en l’efecte fotoelèctric

• Són fototubs i tubs fotomultiplicadors, fotodíodes o detectors de càrrega acoblada
(CCD)

- Sistema de registre i lectura: transforma el senyal elèctric en senyal digital.

• Els més moderns fan corbes de calibratge

ESPECTROFOTÒMETRE DE FEIX SIMPLE: blanc i mostra s’estudien de manera consecutiva. Té els

components bàsics.
ESPECTROFOTÒMETRE DE DOBLE FEIX EN EL TEMPS: permet estudiar el blanc i la mostra
alhora. Els components no estan duplicats.

ESPECTROFOTÒMETRE DE DOBLE FEIX EN L’ESPAI: permet estudiar el blanc i la mostra alhora,

els components estan duplicats
3. ESPECTROMETRIA D’ABSORCIÓ MOLECULAR.

Basada en la capacitat de les molècules d’absorbir llum a unes determinades λ

- Cromòfor: grup químic responsable de l’absorció de llum a una λ concreta

- Espectre d’absorció: representa la quantitat de llum absorbida per una substància a diferents
λ, és únic o característic de cada substància.

A) ANÀLISI QUANTITATIVA:

• Utilitza llum UV-VIS. Es fonamenta en la llei de Lambert-Beer

• Permet obtenir la concentració de les magnituds bioquímiques, és la més utilitzada en
bioquímica
• Es compara la radiació absorbida (absorbància) en la mostra problema amb la radiació
absorbida pel patró (conc. coneguda).

B) ANÀLISI QUALITATIVA:

• Utilitza llum IR
• Al laboratori clínic, s’utilitza, per a conèixer la composició de càlculs urinaris.
• Es compara l’espectre d’absorció de la mostra problema amb els espectres d’absorció
dels gràfics patró.

Quan un feix de llum incideix sobre una mostra en dissolució i es produeix el fenomen
d’absorció molecular, una part de l’energia és absorbida i la resta és transmesa

A) TRANSMITÀNCIA: quocient entre la intensitat de la llum transmesa i la incident

B) ABSORBÀNCIA: quantitat de llum absorbida per la molècula d’interès
Llei de l’Ambert-Beer: L’absorbància d’un analit en dissolució és directament proporcional al
coeficient d’absorció de la molècula, a la distància recorreguda pel feix de llum en la dissolució i
a la concentració de l’analit.

A) LINEALITAT: interval de concentracions en el què existeix una relació lineal entre la

concentració i l’absorbància

B) DESVIACIONS: Diferents factors provoquen desviacions de la Llei de Lambert-Beer.

•
• Instrumentals: alteracions en la llum incident, la cubeta, al detector...
• Químiques: pH, interferents, absorbància del solvent...

ANÀLISI QUANTITATIVA

Les desviacions impedeixen l’aplicació directa de la Llei de Lambert-Beer → es calcula la

concentració per comparació amb una solució patró

Patró: Solució que conté la molècula d’interès a una concentració coneguda.

S’han de restar les absorbàncies que no són degudes a la substància que volem estudiar → es
fa un blanc que correspondrà al 0 d’absorbància

Blanc: solució que conté tots els elements excepte la molècula d’interès

Les determinacions es poden fer a un sol punt o amb una corba de calibratge (recta patró)
RECTA DE CALIBRATGE

1. Realitzar dilucions del patró i llegir l’absorbància (blanc, dilucions i mostres)

2. Representar gràficament els valors de les dilucions del patró: l’absorbància a les
ordenades (y) i la concentració a les abscisses (x)
3. Obtenir la concentració de la mostra a partir de l’equació de la recta: y=mx + n

Per a què la recta sigui vàlida per calcular la concentració de la mostra ha

d’haver-hi una bona correlació entre les absorbàncies i les concentracions→
Coeficient de correlació (R) pròxima a 1.

TIPUS DE DETERMINACIONS

A) COLORIMÈTRIQUES: reacció química entre reactiu i analit per aconseguir compost amb
color.
B) ENZIMÀTIQUES : L’analit és el substrat d’una reacció enzimàtica i és transformat en un
compost amb color.

4. ESPECTROMETRIA D’ABSORCIÓ EN L’IR

• S’utilitza per a conèixer la composició dels càlculs urinaris.

• Es representa gràficament la transmitància i la longitud d’ona.
• El gràfic és característic de cada compost. Es compara amb els gràfics patró.