Quantikine ELISA – Human IL-2 Immunoassay

(R&D Systems)
Reagensek előkészítése:
- Wash Buffer (ha bármilyen kikristályosodás tapasztalható, szobahőre melegedés után
kevertetni, amíg teljesen feloldódik):
20 ml W.B. koncentrátumhoz 480 ml ioncserélt v desztillált vizet adni → 500 ml

- Szubsztrát oldat: Color Reagent A és B-t egyenlő térfogatban mixelni, majd 15 percen
belül felhasználni! Fénytől védve használandó! → 200 ul/well

- IL-2 standard: Calibrator Diluent RD5-5 (sejtkultúrák felülúszó mintájához)

felhasználásával a csövön megjelölt mennyiségben → az így kapott stock oldat 2000
pg/ml-es. Legalább 15 percig óvatosan mozgatva hagyni kell állni, mielőtt elkezdjük a
hígítási sort készíteni.

6 tesztcsőbe 500-500 ul Calibrator Diluent RD5-5 oldatot mérni, majd az IL-2 standard
stock-ból hígítási sort készíteni: 500 ul-ek tovább pipettázásával:
→ 1000 pg/ml → 500 pg/ml → 250 pg/ml → 125 pg/ml → 62,5 pg/ml → 31,3 pg/ml
A C.D. oldat zéró standardként szolgál: 0 pg/ml.

Lépések:
Minden reagens és minta szobahőn legyen használat előtt! Mindent duplikátumban javasolt
használni.
1. mintákat, reagenseket, standardokat előkészíteni a fent leírt módon
2. eltávolítani a felesleges microplate szalagokat a plate keretéről, visszatenni a
párátlanítót tartalmazó fóliatasakba, visszacsomagolni
3. 100 ul Assay Diluent RD1W-t mérni minden well-be
4. hozzáadni 100 ul-t a standardból, a kontrollból vagy a mintából; lefedni (a csomagban
lévő ragasztószalaggal v alufóliával), inkubálni: szobahőn, 2 órán át
5. oldat eltávolítása minden well-ről majd mosás (2-300 ul W.B./well), megismételni 2x
(összesen 3 mosás); a folyadék tökéletes eltávolítása fontos a pontos eredményhez!
6. minden well-hez 200 ul Human IL-2 Conjugate hozzáadása, lefedni (új ragasztócsíkkal),
inkubálni: szobahőn, 2 órán át
7. mosási lépések megismétlése (lásd 5. pont)
8. 200 ul Szubsztrát oldat minden well-be, inkubálni: szobahőn, 20 percig, fénytől védve!
9. 50 ul Stop Solution minden well-be: kékről sárgára kell változzon a színe; ha zöldes vagy
a színváltozás nem egységes, óvatosan érintve keverjük!
10. félórán belül megmérni az OD-t microplate reader-en 450 nm-en (+ korrekció mérése
540 vagy 570 nm-en). Átlagolás majd a zeró standard OD-jának levonása után standard
görbe készítése (IL-2 konc. vs OD 450), egyenes illesztése.
Szenzitivitás: minimum detektálható dózis (MDD) <7 pg/ml
IL-2 standard hígítási sor készítése:

Az assay alapelve: