MỤC LỤC

1. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng trong quy trình chiết xuất polyphenol
trong lá chè xanh...........................................................................................1
1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng polyphenol........................1
1.2. Khảo sát lựa chọn nguyên liệu lá chè xanh...........................................2
1.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết...............................................................3
1.4. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu..........................................4
1.5. Khảo sát và lựa chọn kích thước nguyên liệu........................................4
1.6. Ảnh hưởng thời gian chiết......................................................................5
1.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ.........................................................................6
1.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi...............................................7
1.9. Ảnh hưởng của số lần chiết....................................................................7
1.10. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm.........................................................8
1.11. Tinh chế polyphenol từ chè xanh........................................................10
2. Quy trình chiết xuất polyphenol..............................................................11
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị..........................................................11
2.2. Sơ đồ quy trình.....................................................................................11
2.3. Các chỉ tiêu chất lượng cần kiểm soát trong quy trình........................13
2.4. Mô tả quy trình (quy mô 2kg chè khô/mẻ)............................................13
 DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Độ hấp thụ quang của dung dịch acid gallic chuẩn.........................2
ở bước sóng 765nm.......................................................................................2
Bảng 2. Hàm lượng polyphenol trong loại nguyên liệu khác nhau..............3
Bảng 3. Ảnh hưởng của dung môi................................................................3
Bảng 4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm ẩm nguyên liệu.................................4
Bảng 5. Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu.................................................5
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời gian chiết........................................................5
Bảng 7. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết xuất........................................................6
Bảng 8. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi........................................7
Bảng 9. Ảnh hưởng số lần chiết....................................................................8
Bảng 10. Kết quả ảnh hưởng của thời gian siêu âm.....................................8
Bảng 11. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chè/dichloromethan............................10
đến quá trình tinh chế polyphenol...............................................................10
Bảng 12. Nguyên vật liệu dùng trong quy trình.........................................11
 DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Đường chuẩn của acid gallic...........................................................2
Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng polyphenol........9
Hình 3. Ảnh hưởng của siêu âm đến quá trình chiết xuất polyphenol.........9
dựa trên sự thay đổi của kích thước nguyên liệu...........................................9
Hình 4. Sơ đồ quy trình chiết xuất polyphenol trong chè xanh..................12
 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT POLYPHENOL TRONG
CHÈ XANH
1. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng trong quy trình chiết xuất
polyphenol trong lá chè xanh
Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu đã có của Mai Thanh Nga [20],
Giang Trung Khoa [19], Đặng Minh Nhật [22]. Trong các nghiên cứu này,
nguyên liệu chè xanh được sử dụng trong nghiên cứu có thể được sử dụng:
lá chè già, lá chè bánh tẻ, lá chè non từ các vùng nguyên liệu khác nhau,
dung môi sử dụng có thể nước, nước acid, nước kiềm, ethanol, aceton,…
Các nghiên cứu thường sử dụng phương pháp chiết nóng và chiết nhiều lần
để chiết kiệt được hoạt chất.
Tại Thái Nguyên, nguyên liệu chè non thường được sử dụng chế
biến đồ uống, các lá chè già và lá bánh tẻ thường bị bỏ đi nhiều khi hết vụ.
Từ thực tế này, trong nghiên cứu của chúng tôi tận dụng nguồn nguyên liệu
là lá chè bánh tẻ và lá chè già. Quy trình chiết xuất khảo sát một số các yếu
tố dung môi, nhiệt độ, phương pháp chiết nhằm lựa chọn một quy trình phù
hợp với điều kiện thực tế của nghiên cứu.
1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng polyphenol
Trong các nghiên cứu về định lượng polyphenol trong chè xanh, có
phương pháp HPLC và quang phổ UV-Vis thông qua phản ứng tạo màu.
Trên thực tế, phương pháp quang phổ được ứng dụng khá phổ biến do dễ
thực hiện và chi phí thấp hơn so với phương pháp HPLC. Trong Tiêu chuẩn
Việt Nam 9745-1:2013 [25] cũng áp dụng phương pháp này để định lượng
polyphenol trong nguyên liệu chè xanh. Ngoài ra, phương pháp này cũng
đã được áp dụng trong nghiên cứu của Giang Trung Khoa [19], Lê Thị
Bách Diệp [12]. Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương pháp đo
quang phổ UV-Vis thông qua phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin-
Ciocalteu, kỹ thuật đường chuẩn để xác định hàm lượng polyphenol trong
nguyên liệu và dịch chiết chè xanh.
Nghiên cứu tiến hành xây dựng đường chuẩn của acid gallic trong
nước ở bước sóng 765nm. Pha dung dịch acid gallic có nồng độ chính xác
khoảng 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 µg/ml và đo độ hấp thụ quang ở
bước sóng 765nm. Kết quả được trình bày bảng 1 và hình 1:

1
 Bảng 1. Độ hấp thụ quang của dung dịch acid gallic chuẩn
ở bước sóng 765nm
STT Khối lượng acid galic (µg) Độ hấp thụ A
1 10,882 0,1025
2 21,765 0,2653
3 32,647 0,3869
4 43,530 0,5157
5 54,412 0,6373
6 65,295 0,748
7 76,177 0,8564
8 87,060 0,9708
9 97,942 1,1078

Hình 1. Đường chuẩn của acid gallic

Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ 10 - 90µg/mL, có mối tương
quan tuyến tính giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thụ quang, hệ số tương
quan R2 bằng 0,9991. Điều này chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính chặt
chẽ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chất khảo sát. Do vậy có thể sử dụng
đường chuẩn này để xác định hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu và
dịch chiết chè xanh.
1.2. Khảo sát lựa chọn nguyên liệu lá chè xanh
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng giống chè bản địa của Thái
Nguyên. Các mẫu lá chè được khảo sát bao gồm loại lá bánh tẻ (A), loại lá
già có 25% bánh tẻ (B), loại lá già (C) được thu hái, rửa sạch, sấy khô ở
nhiệt độ 450C. Lá chè khô được nghiền kích thước khoảng 0,5- 1,5 mm.
2
Tiến hành chiết xuất và định lượng polyphenol theo phương pháp đã xây
dựng, thu được kết quả như sau:
Bảng 2. Hàm lượng polyphenol trong loại nguyên liệu khác nhau
Loại nguyên liệu A B C
Hàm lượng polyphenol (%) 16,7 15,2 13,9
Từ kết quả có thể thấy rằng, nguyên liệu lá chè xanh càng non thì hàm
lượng polyphenol càng cao, tuy nhiên mức độ chênh lệch không lớn. Trong
một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự tổng hợp polyphenol phụ thuộc tỷ lệ
thuận với cường độ chiếu sáng [28], [76]. Tuy nhiên, cân nhắc về tính kinh
tế, nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu là lá chè loại B và C cho các khảo sát
tiếp theo.
1.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hệ dung môi là một trong các yếu tố
quan trọng nhất trong việc chiết xuất polyphenol trong dược liệu. Việc lựa
chọn dung môi có thể ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợp chất
phenol chiết tách được. Độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng
lớn bởi độ phân cực của dung môi sử dụng. Trong chiết xuất các hợp chất
phenol, các dung môi có độ phân cực cao như nước hoặc ít phân cực như
chloroform hay hexan thường không cho hiệu suất thu hồi cao [42].
Để khảo sát ảnh hưởng loại dung môi. Nghiên cứu tiến hành thử
nghiệm với các dung môi nước, nước acid pH 3,0; nước kiềm pH 9,5;
ethanol 70%, ethanol 90%, methanol 70%. Cố định số lần chiết 1 lần; kích
thước nguyên liệu 0,5- 1,5 mm; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/7; nhiệt độ
chiết xuất 600C; thời gian chiết xuất 3 giờ. Kết quả được trình bày bảng 3:
Bảng 3. Ảnh hưởng của dung môi
Loại dung môi Hàm lượng Hiệu suất
polyphenol (%) chiết (%)
Nước 7,7 36,9
Nước acid 14,1 73,7
Nước kiềm 12,7 63,0
Ethanol 70% 14,3 74,0
Ethanol 90% 13,2 65,1
Methanol 70% 10,8 51,7
Methanol 90% 10,5 50,7
Kết quả cho thấy, sử dụng nước acid và ethanol 70% cho hiệu suất
chiết cao hơn các dung môi còn lại. Trong hai loại dung môi này, nước
được acid hóa có ưu điểm có thể làm ổn định của các hợp chất phenol như
3
anthocyanin [49], ảnh hưởng đến độ hòa tan của các polyme có thể thủy
phân như lignin, hydroxycinnamic và procyanidin. Bên cạnh đó nó cũng có
thể làm yếu cấu trúc thành tế bào, từ đó giúp quá trình hòa tan các hợp chất
phenol được dễ dàng hơn. Thêm vào đó, polyphenol có tính khử mạnh nên
trong môi trường acid thấp nó sẽ được bảo vệ tốt hơn. Do vậy, nghiên cứu
lựa chọn dung môi là nước acid pH 3,0. Đây cũng là dung môi được áp
dụng trong quy trình chiết polyphenol từ chè xanh [5].
1.4. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu
Độ ẩm của nguyên liệu là một trong các yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu
suất chiết các hợp chất từ thực vật. Ảnh hưởng của nó thường thể hiện qua
sự liên kết giữa nước với protein và các thành phần háo nước khác của vật
liệu, từ đó ảnh hưởng đến sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong
vật liệu, làm chậm quá trình khuếch tán và ảnh hưởng đến hiệu suất chiết.
Để đánh giá độ ẩm nguyên liệu, trong thí nghiệm này, chúng tôi đã
thử nghiệm các mẫu chè có hàm ẩm từ 5% đến 12%, các yếu tố thí nghiệm
khác được cố định là: chiết 1 lần, kích thước nguyên liệu 0,5- 1,5 mm;
dung môi nước acid pH 3,0; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/7, chiết 1 lần;
nhiệt độ chiết xuất 600C; thời gian chiết xuất 3 giờ. Kết quả được trình bày
bảng 4:
Bảng 4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm ẩm nguyên liệu
Độ ẩm (%) Hàm lượng polyphenol (%) Hiệu suất chiết (%)
5,1 14,9 80,3
7,4 14,1 78,0
9,9 12,8 76,5
12,3 11,4 60,9
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm ẩm nguyên liệu tỷ lệ nghịch với
hàm lượng polyphenol và hiệu suất chiết. Nguyên nhân là hàm ẩm cao thì
dung môi thẩm thấu vào dược liệu khó hơn, và nó cũng ảnh hưởng đến độ
phân cực của dung môi, do đó ảnh hưởng đến độ tan của các hợp chất
phenolic. Trong các mẫu khảo sát thì hàm ẩm khoảng 5% là cho kết quả tốt
nhất, đây cũng là hàm ẩm an toàn để bảo quản nguyên liệu.
1.5. Khảo sát và lựa chọn kích thước nguyên liệu
Cùng với độ ẩm nguyên liệu, kích thước nguyên liệu cũng là yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất. Khảo sát kích thước nguyên liệu từ
0,25 mm - 2,0 mm. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

4
 Bảng 5. Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu
Kích thước Hàm lượng Hiệu suất
nguyên liệu polyphenol chiết
< 0,25 15,8 79,5
0,25-0,5 15,3 80,6
0,5-1,5 15,6 78,9
1,5-2,0 13,8 71,0
Kết quả cho thấy, không có sự khác nhau đáng kể về hàm lượng
polyphenol ở các mẫu có kích thước nguyên liệu <1,5 mm; tuy nhiên có sự
giảm một chút ở mẫu có kích thước >1,5 mm. Điều này là do khi kích
thước của vật liệu quá lớn sẽ làm giảm hiệu suất chiết xuất do diện tích tiếp
xúc bề mặt giữa vật liệu và dung môi thấp. Ngoài ra nó cũng làm tăng
quãng đường mà chất tan cần khuếch tán từ trong ra bề mặt vật liệu dẫn
đến hiệu suất và hàm lượng polyphenol thấp hơn. Tuy nhiên, nếu kích
thước nguyên liệu quá nhỏ cũng có thể làm giảm hiệu suất chiết vì bột mịn
có thể gây tắc các mao quản và giảm hiệu suất chiết [50].
1.6. Ảnh hưởng thời gian chiết
Thời gian chiết không những ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, mà còn
ảnh hưởng đến chi phí và chất lượng dịch chiết. Đánh giá các khoảng thời
gian chiết 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ. Kết quả thu được ở bảng:
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời gian chiết
Thời gian Hàm lượng Hiệu suất chiết
chiết (giờ) polyphenol (%) (%)
1 12,5 65,9
2 13,8 67,5
4 16,4 80,6
6 15,9 80,1
Như vậy, khi tăng thời gian chiết từ 1- 4 giờ thì hàm lượng polyphenol
và hiệu suất chiết đều tăng, tiếp tục tăng lên 6 giờ thì hiệu suất chiết không
tăng mà còn giảm xuống. Điều này có thể do thời gian chiết dài làm đến sự
phân hủy một số hợp chất, dẫn đến cả hàm lượng polyphenol và hiệu suất
đều giảm.
Thời gian chiết là yếu tố không những ảnh hưởng đến hiệu suất chiết
polyphenol mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của dịch chiết và hiệu quả
kinh tế. Thời gian chiết xuất ngắn thì hiệu suất chiết thấp, ngược lại nếu
thời gian quá dài sẽ gây tốn kém và có thể làm tăng nguy cơ oxy hóa các
hợp chất polyphenol. Perva-Uzunalic và cộng sự [46] cũng cho kết quả
5
tương tự, với dung môi nước, hiệu suất chiết catechin chè giảm mạnh khi
kéo dài thời gian chiết quá 20 phút ở nhiệt độ 80 0C và quá 10 phút ở 950C.
Trong nghiên cứu của Choung và Lee [42], trong dung dịch ethanol 40%
được acid hóa bằng 2% phosphoric acid không nhận thấy có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê về hiệu suất chiết tách catechin tổng số cũng như
EGCG trong thời gian từ 0,5 giờ đến 24 giờ (chiết ở 250C).
1.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cùng với thời gian chiết, dung môi/nồng độ dung môi thì nhiệt độ
chiết xuất cũng được xem là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến hiệu suất
chiết xuất và hoạt tính sinh học của dịch chiết.
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, các mức nhiệt độ được đưa vào
khảo sát 400C - 1000C. Đánh giá hàm lượng polyphenol tổng và hiệu suất
chiết. Kết quả được trình bày trong bảng:
Bảng 7. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết xuất
Nhiệt độ Hàm lượng Hiệu suất chiết
chiết polyphenol (%) (%)
40 10,6 51,3
50 13,4 63,9
60 14,6 74,1
80 15,4 78,3
100 13,8 65,3
Kết quả cho thấy, trong khoảng nhiệt độ chiết tăng 40 đến 80 0C thì
hàm lượng polyphenol tổng số thu được tăng và hiệu suất chiết tăng. Tuy
nhiên, nếu tiếp tục tăng đến 100°C thì hàm lượng polyphenol và hiệu suất
chiết xuất giảm.
Điều này có thể là do chiết xuất ở nhiệt độ thấp đã làm chậm quá trình
chuyển khối, lượng polyphenol chiết rút được ít, vì vậy mà hiệu suất chiết
thấp. Trong trường hợp nhiệt độ chiết xuất quá cao, dung môi bị bay hơi
nhiều, đồng thời có thể một phần polyphenol đã bị oxy hoá và làm giảm
hiệu suất chiết. Trong nghiên cứu của Cacace và cộng sự [40] đã chỉ ra
rằng, hiệu suất chiết polyphenol được tăng cường khi tăng nhiệt độ chiết.
Nhiệt độ cao làm giảm độ nhớt của dung môi, tăng tính bán thấm của thành
tế bào, tăng độ hòa tan và hệ số khuếch tán của chất cần chiết. Do đó có thể
cải thiện được năng suất chiết [45]. Thêm vào đó, polyphenol không ổn
định và bị phá hủy ở nhiệt độ cao [46]. Perva-Uzunalic và cộng sự [54] đã
chỉ ra rằng, hiệu suất chiết tách catechin chè với dung môi nước đã giảm
khi tăng nhiệt độ chiết từ 80°C lên 95°C. Thời gian chiết thích hợp với hai
6
mức nhiệt độ trên là 20 phút và 10 phút tương ứng. Ngoài ra, quá trình oxy
hóa và epimer hóa các catechin chè cũng diễn ra ở nhiệt độ chiết cao [43].
Điều này cho thấy, yếu tố nhiệt độ không những ảnh hưởng đến hàm lượng
polyphenol chiết tách được mà còn ảnh hưởng đến thành phần polyphenol
và có thể cả hoạt tính sinh học của nước chiết. Nhìn chung trong chiết xuất
polyphenol, nhiệt độ chiết xuất thường phải giới hạn dưới nhiệt độ sôi của
dung môi (hữu cơ) còn trong chiết xuất bằng nước, nhiệt độ khuyến cáo
thường nằm trong khoảng 80-950C [46].
1.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi
Với cùng một lượng nguyên liệu, nếu ta tăng lượng dung môi sử dụng
thì hiệu suất chiết xuất sẽ tăng theo. Đó là do sự chênh lệch nồng độ của
hợp chất cần chiết xuất trong nguyên liệu và trong dung môi sẽ càng lớn.
Tuy nhiên nếu lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch chiết
xuất và tốn thời gian cho các quá trình xử lý tiếp theo. Cho nên cần phải
chọn tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi cho thích hợp. Để đánh giá ảnh
hưởng tỷ lệ dược liệu/dung môi dược khảo sát 1/5, 1/7, 1/10, 1/15, 1/20.
Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 8. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi
Tỷ lệ dl/dm Hàm lượng Hiệu suất chiết
polyphenol (%) (%)
1/5 14,6 74,4
1/7 15,2 77,8
1/10 16,5 80,3
1/15 16,6 80,5
1/20 16,8 81,1
Kết quả cho thấy, khi tăng lượng dung môi thì hiệu suất chiết tăng.
Tuy nhiên tăng từ 1/10 đến 1/20 thì hiệu suất có cao hơn nhưng không
nhiều. Tỷ lệ dung môi càng cao tức nồng độ chất cần chiết xuất trên bề mặt
pha rắn càng thấp. Do đó, chênh lệch gradient nồng độ giữa bên trong và bề
mặt vật liệu rắn càng cao và làm tang sự khuếch tán của chất tan từ vật liệu
ra môi trường hay làm tăng hiệu suất chiết. Mặt khác tăng tỷ lệ dung môi
dẫn đến tốn nhiều thời gian để thu hồi dung môi, gây khó khăn cho quá
trình tinh chế về sau, chi phí tăng đáng kể. Do vậy, tỷ lệ dl/dm khoảng 1/10
là phù hợp.
1.9. Ảnh hưởng của số lần chiết
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất
chiết polyphenol được trình bày qua bảng:
7
 Bảng 9. Ảnh hưởng số lần chiết
Số lần Hàm lượng Hiệu suất
chiết polyphenol (%) chiết (%)
1 15.24 71.7
2 16.97 79.8
3 16.51 77.7
4 16,43 77.7
Kết quả cho thấy, hàm lượng polyphenol tổng số cũng như hiệu suất
chiết xuất tăng đáng kể khi số lần chiết xuất tăng từ 1 lần đến 2 lần. Tuy
nhiên khi tăng 3 lần thì hiệu suất chiết không tăng. Điều này là do chiết
xuất là quá trình khuếch tán phân tử, chất cần chiết xuất hoà tan vào dung
môi và khuếch tán ra khỏi tế bào. Khi polyphenol đạt nồng độ cân bằng
giữa trong và ngoài tế bào thì quá trình chiết xuất kết thúc. Chính vì vậy,
nếu số lần chiết xuất ít thì vào cuối quá trình, sự chênh lệch gradient nồng
độ của chất cần chiết xuất thấp, dẫn đến hiệu suất chiết xuất không cao.
Tuy nhiên, khi số lần chiết xuất quá nhiều thì hiệu suất chiết xuất tăng
không đáng kể do lượng chất cần chiết xuất còn lại trong nguyên liệu
không nhiều. Như vậy chiết xuất 2 lần là phù hợp trong chiết tách các hợp
chất polyphenol chè xanh.
1.10. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng sóng siêu âm đến hiệu suất chiết
polyphenol. Tiến hành cố định các thông số dung môi, tỷ lệ dược liệu dung
môi, phương pháp chiết nóng, nhiệt độ chiết 80 0C. Chiết xuất các mẫu sử
dụng và không sử dụng sóng siêu âm với thời gian siêu âm thay đổi 10, 20,
30, 50, 60, 90 phút trước khi tiến hành chiết nóng. Mỗi mẫu tương ứng 30g
bột chè. Kết quả thu được trình bày bảng và hình sau:
Bảng 10. Kết quả ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thời gian siêu Hàm lượng
âm (phút) polyphenol (%)

0 15,1
10 15,1
20 15,2
30 16,4
50 16,9
60 17,8
90 17,1

8
 Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng polyphenol
Khi đánh giá tác động của siêu âm lên hàm lượng polyphenol thu
được khi trong thời gian siêu âm khác nhau. Ta thấy, khi tăng thời gian siêu
âm từ 10 phút - 60 phút thì hàm lượng polyphenol thu được tăng rõ rệt. Tác
động của siêu âm làm tăng khả năng truyền động bên trong và ngoài vách
tế bào của lá chè xanh, năng lượng từ chu trình hình thành và phá vỡ bọt
bóng làm rách thành tế bào, cho phép sự hấp thụ dung môi vào trong tế bào
và sự khuếch tán, lôi kéo các chất tan ra ngoài thành tế bào lá chè xanh.

Hình 3. Ảnh hưởng của siêu âm đến quá trình chiết xuất polyphenol
dựa trên sự thay đổi của kích thước nguyên liệu
Khi kích thước vật liệu tăng thì ảnh hưởng của siêu âm đến quá trình
chiết xuất polyphenol cũng tăng. Khi chiết xuất mẫu ở kích thước < 1mm
ảnh hưởng của siêu âm là 16,4% khi kích thước mẫu trích tăng từ khoảng <
1mm đến khoảng 1- 1,5 mm, tức là tăng 17,7%. Từ các khoảng kích thước
mẫu 1,5mm - 2mm tăng 20,1%. Khi chiết xuất mẫu bằng phương pháp có
hỗ trợ của siêu âm ở khoảng kích thước > 2mm, ảnh hưởng của siêu âm đạt
23,8%. Kết quả này cho thấy sự ảnh hưởng mạnh mẽ của siêu âm đến kích
thước chè chiết, làm giảm khả năng ảnh hưởng của kích thước đến quá
trình chiết. Điều này có thể do, sóng siêu âm tác động mạnh đến thành tế
9
bào lá chè nhờ sự hình thành và vỡ bọt bóng trong chu trình kéo nén, gây
nên ảnh hưởng vật lý lên tế bào vật liệu, làm tăng nhiệt độ và áp suất tại
điểm kích động cho phép dung môi dễ dàng tiếp cận các hợp chất tan, đồng
thời tăng khả năng khuếch tán và hệ số truyền khối của các chất trong tế
bào, do đó ảnh hưởng của kích thước đến quá trình chiết xuất cũng giảm.
Như vậy, với sự hỗ trợ sóng siêu âm, hàm lượng polyphenol trong
dịch chiết tăng. Tuy nhiên, sóng siêu âm dễ ứng dụng ở quy mô nghiên cứu
phòng thí nghiệm, ở quy mô lớn khó khả thi.
1.11. Tinh chế polyphenol từ chè xanh
Sau quá trình chiết polyphenol trong chè xanh, loại bỏ bã thu được
dịch chè gồm hỗn hợp polyphenol, các chất màu, chất sáp như chlorophyl,
cafein, protein, pectin và một số chất khác. Để quá trình tách, tinh chế
polyphenol cho hiệu suất cao và chất lượng tốt cần tiến hành phân lập từng
phần các chất dựa vào đặc tính hòa tan chọn lọc của chúng trong các dung
môi khác nhau. Nguyên tắc chủ yếu loại trừ dần các chất không mong
muốn có trong sản phẩm polyphenol thu được. Các chất béo, chất sáp, chất
màu có đặc tính chung là hòa tan tốt trong nhau và tan tốt trong các dung
môi chứa gốc clo. Các loại dung môi này thường là dung môi độc và có
nhiệt độ bay hơi thấp như dicloetan, tricloetan, chloroform. Các dung môi
hydrocarbon khác như benzen, hexan lại hòa tan rất ít chất màu. Ngoài ra
nhóm chất chứa gốc clo còn hòa tan rất tốt cafein là chất cần được loại bỏ
trong quá trình tinh chế polyphenol.
Dichloromethan là dung môi được phép sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm và an toàn hơn chloroform. Tác dụng chính của nó là để loại
caffein, chất màu,... ra khỏi dịch chiết xuất thực vật. Trong thí nghiệm này,
tỷ lệ dịch chè/dichloromethane lần lượt là 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5. Kết quả
được trình bày bảng sau:
Bảng 11. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chè/dichloromethan
đến quá trình tinh chế polyphenol
Tỷ lệ dịch Hàm lượng Hiệu suất thu hồi
chè/dichlorometha polyphenol (%) polyphenol(%)
ne
1:1 15,72 78,6
1:1,5 17,30 83,1
1:2 17,33 83,5
1:2,5 17,25 82,6

10
 Kết quả chỉ ra rằng, tỷ lệ dichloromethan sử dụng có ảnh hưởng đến
độ tinh sạch của chế phẩm và hiệu suất thu hồi polyphenol trong quá trình
chiết tách và tinh chế. Trong các công thức thí nghiệm, tỷ lệ dịch chiết:
dichloromethan là 1-1 tạo cho chế phẩm có độ tinh sạch và hiệu suất thu
hồi thấp nhất, giá trị của nó chỉ là 15,72% và 78,6% tương ứng, sản phẩm
cho phản ứng định tính caffein (dung dịch iod – iodid cho tủa nâu). Tăng tỷ
lệ này từ 1-1,5 lên 1:2,5 thì hàm lượng polyphenol trong chế phẩm nằm
trong khoảng 17,25- 17,33% và hiệu suất đạt khoảng 83% và không cho
phản ứng định tính caffein. Như vậy, tỷ lệ dichloromethan thích hợp nhất
cho tinh chế dịch chiết polyphenol chè là 1-1,5.
2. Quy trình chiết xuất polyphenol
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị
a. Nguyên vật liệu
Bảng 12. Nguyên vật liệu dùng trong quy trình
STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Khối lượng/ mẻ
1 Lá chè xanh TCVN 9745-1- 2 kg
(bột khô) 2013
2 Nước cất Dược điển Việt 42 lít
Nam V
3 Acid citric USP 39-NF34 100g
4 Dicloromethan Tinh khiết hóa 30 lít
học
b. Trang thiết bị
- Cân phân tích BJ410C – Switzerland.
- Bếp điện Trung Quốc.
- Hệ thống chiết nóng 5 bình (dung tích 3 lít)- Việt Nam
- Tủ sấy Froilabo – Pháp.
- Máy khuấy que cao tốc.
- Máy quang phổ tử ngoại UV- Vis Halo RB -10.
- Máy nghiền dược liệu đa năng (Việt Nam).
- Cân xác định hàm ẩm nhanh Sartorius MA45 (Nhật).
- Bộ dụng cụ rây nhiều kích cỡ.
- Các dụng cụ thủy tinh (bình thủy tinh cao cổ, bình gạn, cốc thủy
tinh, đũa thủy tinh,…).
2.2. Sơ đồ quy trình
Trên cơ sở kết quả khảo sát, nghiên cứu có quy trình chiết xuất
polyphenol từ chè xanh được mô tả trong sơ đồ sau:
11
Hình 4. Sơ đồ quy trình chiết xuất polyphenol trong chè xanh

12
2.3. Các chỉ tiêu chất lượng cần kiểm soát trong quy trình
a. Sơ chế nguyên liệu
* Hình thức:
Phương pháp cảm quan. Yêu cầu lá chè xanh còn tươi, không bị dập
nát thối, chọn loại lá già và lá già với 25% bánh tẻ.
* Hàm lượng polyphenol:
Tiến hành theo phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin –
Ciocalteu được trình bày trong TCVN 9745-1-2013.
* Hàm ẩm của nguyên liệu:
Đo hàm ẩm bằng thiết bị đo hàm ẩm nhanh Sartorius MA45. Yêu
cầu hàm ẩm không quá 5%.
b. Nghiền lá chè xanh khô
Kích thước bột nguyên liệu: yêu cầu kích thước bột nguyên liệu
thuộc khoảng 0,5 mm- 0,8 mm. Sử dụng các loại rây cỡ 0,5 mm và 0,8 mm.
c. Chiết xuất
* Hàm lượng polyphenol:
Tiến hành theo phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin –
Ciocalteu được trình bày trong TCVN 9745-1-2013.
d. Loại tạp
* Hàm lượng polyphenol:
Tiến hành theo phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin –
Ciocalteu được trình bày trong TCVN 9745-1-2013.
e. Cô đặc và nghiền
* Hàm lượng polyphenol:
Tiến hành theo phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin –
Ciocalteu được trình bày trong TCVN 9745-1-2013.
f. Đóng túi, bảo quản
Đóng túi và hàn kín. Dán nhãn đúng quy định. Bảo quản trong kho
kiểm soát nhiệt độ nhỏ hơn 25°C và độ ẩm dưới 75%.
2.4. Mô tả quy trình (quy mô 2kg chè khô/mẻ)
a. Sơ chế nguyên liệu
Chè xanh tươi được thu mua tại Thái Nguyên, lựa chọn giống chè bản
địa của Thái Nguyên, loại lá già hoặc lá già có 25% bánh tẻ. Lá chè được

13
rửa sạch, diệt men bằng cách sấy nguyên liệu tươi 100 0C trong 10 phút, sấy
đến độ ẩm khoảng 5%.
b. Nghiền nguyên liệu
Lá chè xanh sau khi sơ chế, tiến hành nghiền bằng thiết bị nghiền đa
năng. Rây qua cỡ rây 0,5 mm và 0,8mm. Lấy phần bột nguyên liệu nằm
trong khoảng 0,5- 0,8 mm.
c. Chiết xuất
Hai thiết bị chiết nóng sử dụng trong nghiên cứu gồm 10 bình chiết
dung tích 3 lit. Cân khoảng 0,2 kg bột nguyên liệu vào mỗi bình chiết, thêm
nước acid thấm ẩm nguyên liệu, ủ ẩm trong 1 giờ. Sau thời gian ủ ẩm, thêm
2 lít dung môi nước acid vào mỗi bình chiết. Đặt nhiệt độ chiết 80°C, đậy
nắp bình. Thời gian tiến hành chiết 4 giờ. Sau 4 giờ rút hết dịch chiết, thêm
2 lit dung môi chiết lần 2. Sau khi kết thúc quá trình chiết thì gộp dịch
chiết. Cô dịch chiết bằng đun cách thủy thu được khoảng 4 lít dịch chiết.
d. Loại tạp
Mục đích công đoạn này là loại bỏ tạp caffein và chất màu tan trong
dicloromethan. Cho 2 lít dịch chiết chè trên vào bình thủy tinh cao cổ 5 lít.
Thêm 3 lít dicloromethan, đậy nắp, khuấy đều trong 30 phút, để yên nhằm
tách pha nước và dicloromethan, gạn bỏ lớp dicloromethan. Lặp lại quá
trình với pha nước thêm 2 lần nữa. Gạn và thu lớp nước chứa hỗn hợp
polyphenol (lớp nước không được có phản ứng của caffein).
e. Cô đặc dịch chiết nước và nghiền
Sấy ở 550C đến khi độ ẩm dưới 5% tạo hỗn hợp polyphenol thô khô
(khối lượng khoảng 800g). Nghiền sản phẩm bằng thiết bị nghiền đa năng.
Rây qua cỡ rây 0,5mm.
f. Kiểm nghiệm sản phẩm
Phân tích chất lượng sản phẩm. Phiếu phân tích số 2019GTP-301.
f. Đóng túi, bảo quản
Đóng túi lilong, dán kín miệng túi. Dán nhãn. Bảo quản kho có kiểm
soát nhiệt độ nhỏ hơn 25°C và độ ẩm dưới 75%.
Ngày tháng năm 2020
CƠ QUAN CHỦ TRÌ DỰ ÁN CHỦ NHIỆM DỰ ÁN

PGS. TS Trịnh Xuân Tráng PGS.TS Trần Văn Tuấn

14
15