I.

Tổng quan tài liệu

1.1. Khái niệm chung
Methyl salicylate công thức hóa học C 6H4(HO)COOCH3 còn được gọi là salicylic acid methyl
ester hay methyl-2-hydroxybenzoat là một hợp chất hóa học có trong cây cỏ, đặc biệt là trong
cây cỏ thuộc họ gừng và cây cỏ thơm, thường được sử dụng trong ngành dược phẩm và trong
các sản phẩm làm mát cơ thể như dầu mát xa vì có tính chất làm dịu và làm mát.

1.2. Điều chế methyl salicylate và cơ chế phản ứng:

Methyl salicylate có thể được điều chế từ acid salicylic bằng phản ứng ester hóa, trong đó acid
salicylic phản ứng với methyl ancol để tạo ra methyl salicylate và nước. Methyl salicylate sau
đó có thể được tách ra và tinh chế để sử dụng trong các ứng dụng khác nhau, chẳng hạn như
trong dược phẩm hoặc trong sản phẩm làm mát cơ thể. Dưới đây là phản ứng tổng quan và cơ
chế phản ứng:

1.3. Đặt vấn đề

Dầu lộc đề xanh được sử dụng rộng rãi như tinh dầu hoặc trong hương vị thực thẩm. Methyl
salycilate – 1 thành phần chính của dầu lộc đề xanh cũng là 1 este quan trọng. Tuy nhiên
methyl salicylate vấn đề của dầu lộc đề xanh là sự không ổn định của nó. Methyl salicylate
được phát hiện là dể dàng thủy phân môi trường acid hoặc kiềm trong khoảng pH từ 5 đến 9
thông qua cơ chế xúc tác acid hoặc bazơ đã biết. Việc hiểu thêm về quá trình thủy phân methyl
salicylate có thể giúp chúng ta tìm được cách để ổn định và tăng thởi hạn sử dụng.
Gần đây chế độ ăn có tình kiềm đang được quảng cáo rộng rãi vì tốt cho sức khỏe, Các thực
phẩm có tính kiềm như thịt gà, thịt, đậu nành có chứa nhiều acid amin làm tăng quá trình thủy
phân Methyl salicylate. Tuy nhiên, cơ chế chi tiết về cách thức và lý do acid amin có thể đẩy
nhanh quá trình thủy phân trong nước ở độ pH cao vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Mặc dù cơ chế
thủy phân methyl salicylate trong dung môi hữu cơ đã được báo cáo và thảo luận kỹ trước đây.
Nhưng quá trình thủy phân este của methyl salicylate với sự có mặt hoàn toàn của nước khi bổ
sung acid amin dường như nhận được rất ít sự chú ý. Để hình thành một sản phẩm thực phẩm
ổn định có chứa dầu lộc đề xanh và acid amin trong môi trường kiềm, cần hiểu rõ hơn về phản
ứng và cơ chế này.
1.4. Mục tiêu của nghiên cứu
Mục đích của nghiên cứu này là tìm hiểu vai trò của glycine trong quá trình thủy phân methyl
salicylate trong dung dịch nước ở pH kiềm. Chuỗi xung tổng hợp tiền bảo hòa đã được áp dụng
để triệt tiêu hiệu quả sự cộng hưởng nước trong phổ NMR của mẫu, cho phép định lượng nồng
độ methyl salicylate theo thời gian. Sự kết hợp giữa NMR và lý thuyết chức năng
mật độ (DFT) đã được sử dụng để hiểu vai trò của acid amin và methyl salicylate trong phản
ứng thủy phân. Những kiến thức trong nghiên cứu này có thể cung cấp thêm thông tin trong
việc tìm ra cách ổn định các thực phẩm chứa cả acid amin và dầu lộc đề xanh.

II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Các chất hóa học được dùng trong nghiên cứu

Methyl salicylate Acid salicylic

Methyl Paraben Methyl benzoate

Glycine Boc-glycine

Boc-glycine methyl
Glycine methyl este
este
2.2. Mẫu chẩn đoán
Để theo dõi quá trình thủy phân của methyl salicylate trong nước với sự có mặt của glycine, ta
pha mẫu giữa methyl salicylate với dẫn xuất của glycine theo tỉ lệ 1:1. Độ pH của môi trường
phản ứng phải được hiệu chuẩn bằng dung dịch đệm và có độ pH tại 4,7,10. Tất cả mẫu phải
được hiệu chuẩn lại pH trước mỗi thí nghiệm bằng máy đo chuyên dụng và kết quả được gấp
ba lần để thu được giá trị trung bình ở 25℃ . Độ pH được điều chỉnh đến thích hợp bằng
NaOH và HCl. Cuối cùng nồng độ của methyl salicylate được dùng là 0,05 wt% (3,29mM)
được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các mẫu NMR đều chưa 5 wt% D 2O nhằm khóa từ
trường NMR trong thí nghiệm.
2.3. NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
Đầu tiên, NMR là viết tắt của kỹ thuật phân tích cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng để
nghiên cứu tính chất phân tử và thành phần của chúng. Nó dựa trên nguyên lý hoạt động rằng
hạt nhân nguyên tử có số lẻ proton hoặc neutron trong hạt nhân có momen từ, nghĩa là chúng
hoạt động như một nam châm nhỏ khi đặt trong từ trường. Khi mẫu NMR được đặt trong từ
tường mạnh thì các spin hạt nhân được đặt song song hoặc phản song song với từ trường. Sự
sắp xếp làm cho hạt nhân hấp thụ và phát ra bức xạ điện từ trường ở những tần số cụ thể mà
thiết bị NMR có thể nhận biết được.
Có nhiều loại NMR nhưng trong quá trình theo dỗi sự thủy phân của methyl salicylate trong
nước khi có mặt của dẫn xuất glycine thì chỉ cần proton NMR ( 1H NMR). Quá trình thu phổ 1H
NMR được đo bằng máy chuyên dụng sử dụng dò đầu đa hạt nhân 5mm với tốc độ 1H. Cho
mẫu methyl salicylate 0,8ml vào ống NMR 5mm và nhanh chóng đưa vào đầu dò. Thu quang
phổ trong khoảng 90 phút. Phát ra xung bão hòa có tần số cùng với tần số cộng hưởng của nước
để loại bỏ tín hiệu của nước trong quang phổ. Phản ứng thủy phân từng mẫu được theo dỗi sau
32 giờ và 48 giờ. Độ pH trong quá trình được kiểm tra sau 48 giờ cho thấy sự thay đổi nhỏ hơn
0,5 và ống NMR 5mm được bịt kín để tránh quá trình bay hơi theo thời gian, nhiệt độ được
kiểm soát ở 25± 0 , 1℃ . Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng các công hưởng
của methyl salicylate, acid salicylic, glycine và methanol có thể được trình bày như hình 1. Ban
đầu phổ của methyl salicylate bao gồm methoxyl (5) tập trung ở mức 3,77ppm và bốn vạch
tương ứng với proton phenol nằm trong khoảng từ 6,7-7,7ppm (1-4). Sau 12 giờ, cường độ
tương ứng với nhóm methoxy của methyl salicylate giảm 30% còn metanol bắt đầu hình thành
2,7ppm. Ở 48 giờ, cường độ methoxy của methyl salicylate tiếp tục giảm còn metanol tăng
mạnh. Tóm lại, sau khi thu nhận phổ NMR sau 48 giờ methyl salicylate bị thủy phân dần tạo ra
metanol khi có mặt của các dẫn xuất glycine.
 Hình 1. Phổ 1H NMR mô tả quá trình Methyl Salicylate bị thủy phân khi có mặt Glycine

III. Kết quả và kết luận

3.1. Thủy phân Methyl Salicylate với sự có mặt của Glycine ở các giá trị pH khác nhau.
Quá trình thủy phân được theo dõi bằng phổ 1H NMR nhưng để định lượng một mẫu ở nồng độ
dưới 0.1% khi nằm hoàn toàn trong nước là rất khó khăn. Để khắc phục điều này, việc áp dụng
các xung tổng hợp pi/2 trước các tiền xung bão hòa để triệt tiêu một cách hiệu quả tín hiệu
cộng hưởng của nước với mẫu chứa 0.05% methyl salicylate trong nước.

Hình 2. Phổ 1H NMR của mẫu sử dụng chuỗi xung NMR với (a) chuỗi xung có độ bão hòa truyền thống và với (b) chuỗi
xung thành phần để triệt tiêu tín hiệu nước ở tốc độ 4,7 ppm
Tín hiệu dao động của phổ 1H NMR có được bởi chuỗi xung tổng hợp được cải thiện phần lớn
so với hệ số sử dụng chuỗi xung bão hòa truyền thống. Từ đó giúp phát hiện và định lượng chất
pha loãng methyl salicylate trong nước một cách rõ ràng. Tiếp tục theo dõi cường độ cộng
hưởng của NMR trong từng phân tử theo thời gian có thể thu được thông tin động học của quá
trình thủy phân methyl salicylate (Hình 3). Nhận thấy rõ ràng nồng độ của methyl salicylate
giảm trong khi nồng độ của acid salicylic và methanol tăng theo cấp số nhân theo thời gian.
Đặc biệt là nồng độ Glycine không đổi trong toàn bộ quá trình thủy phân (Hình 3). Điều này
cho thấy Glycine không hình thành liên kết cộng hóa trị với methyl salicylate thông qua quá
trình aminolysis trong phản ứng thủy phân.

Hình 3. Sự phụ thuộc thời gian của quá trình phân hủy methyl salicylate và sự hình thành acid salicylic, metanol

3.3. Xác định sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân Methyl Salicylate với sự có
mặt Glycine.
Glycine và acid salicylic trong nước tại pH 9 sau 48 giờ sẽ được xác định rõ ràng bởi quang
phổ 1H NMR và sự dịch chuyển hóa học giữa chúng không xuất hiện bất kì cộng hưởng mới
nào. Điều quan trọng là sự dịch chuyển hóa học nhỏ ở proton của glycinecin và methoxy làm
thay đổi pH trong quá trình thủy phân dưới 0,5 sau 48 giờ thí nghiệm.

3.4. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân Methyl Salicylate không có amino acid:
Quá trình thủy phân este carboxylate phụ thuộc rất nhiều vào độ pH. Để hiểu ảnh hưởng của
pH đến quá trình thủy phân Methyl Salicylate, động học của quá trình thủy phân Methyl
Salicylate trong nước không có acid amin trong khoảng pH 8 và 11,5 đã được nghiên cứu bởi
1
H NMR (Hình 4)
Chúng ta thấy được sự phân hủy của Methyl Salicylate trở nên nhanh hơn (hằng số tốc độ thủy
phân của Methyl Salicylate tăng lên) khi dung dịch trở nên base hơn.
Tỷ lệ mol được tính toán giữa OH− và Methyl Salicylate ở pH 8, 9, 10 và 11,5 là 0003, 0,003,
0,03 và 0,9. (Hình 5)
Kết luận: Nồng độ Methyl Salicylate ban đầu trong 4 mẫu này không đổi. Điều đó cho thấy
rằng quá trình thủy phân Methyl Salicylate được quyết định bởi nồng độ của ion hydroxide
trong dung dịch và hydroxide hoạt động như một tác nhân ái nhân tấn công vào este
carboxylate của Methyl Salicylate tạo thành sản phẩm cuối cùng là Salicylate và methanol. Vậy
nên việc tăng nồng độ OH- ( hoặc độ pH tăng cao) có thể đẩy nhanh quá trình thủy phân.

Hình 4. Nồng độ methyl salicylate theo thời gian khi không Hình 5. Sự phụ thuộc vào pH, dạng ion glycine và nồng độ
có glycine trong mẫu ở các giá trị pH khác nhau OH- của methyl salicylate
3.5
. Sự ảnh hưởng của nhóm hydroxyl phenolic của Methyl Salicylate đến quá trình thủy
phân ở pH cơ bản: nghiên cứu quá trình thủy phân của hai hợp chất tương tự là methyl
benzoat và methyl paraben.
Kết quả thí nghiệm cho thấy không xảy ra sự thủy phân este của cả hai hợp chất methyl
benzoate và methyl paraben khi có hoặc không có Glycine ở pH 9,0 trong 48 giờ. Ngược lại,
Methyl Salicylate có hoặc không có Glycine có thể hiện sự thủy phân đáng kể theo thời gian (
Hình 6). Cho thấy, nhóm hydroxyl phenolic của Methyl Salicylate cần phải ở vị trí ortho để có
liên kết hydro nội phân tử hỗ trợ sự phân tách nhóm este trong dung dịch kiềm trong quá trình
thủy phân. Liên kết này cũng có thể được hình thành bởi dung môi và nó không nhất thiết phụ
thuộc vào pH, dự kiến sẽ làm tăng điện tích dương của carbonyl cacbon của I, do đó làm cho
nó có xu hướng hoạt động như một chất điện di tốt cho phản ứng thủy phân Methyl Salicylate.
Quan trọng, nếu nhóm OH không có trong vị trí ortho, liên kết hydro nội phân tử không còn tồn
tại. Vậy nên quá trình este của Methyl Salicylate không xảy ra, cả khi có Glycine ở độ pH cao.
Liên kết hydro nội phân tử của 1 đóng vai trò chính trong quá trình thủy phân.
 Hình 6. Sự ổn định của methyl paraben, methyl benzoate và methyl có và không có glycine ở pH 9,0

3.6 Vai trò của amino acid trong quá trình thủy phân Methyl Salicylate:
Để nhận biết Glycine có tương tác vật lý với methyl salicylate trong nước của quá trình thủy
phân hay không. Do đó, việc sử dụng phương pháp quang phổ HNMR khi Methyl Salicylate có
hoặc không có Glycine ở pH = 9,0 được thu thập trước khi thủy phân như (Hình 7)
Nhận thấy có độ chuyển dịch hóa học H của proton anpha của Glycine khi có mặt của Methyl
Salicylate có độ chuyển dịch xuống 0.2 ppm. Từ đó cho thấy tốc độ thủy phân Methyl
Salicylate tang khi tăng nồng độ Glycine trong quá trình thủy phân (Hình 8). Tuy nhiên,
Glycine không phải là chất xúc tác vì nếu Glycine là chất xúc tác thì tốc độ thủy phân không
phụ thuộc vào nồng độ Glycine. “Chất xúc tác” thường được định nghĩa là chất làm thay đổi
tốc độ phản ứng hóa học nhưng sau đó vẫn không thay đổi về mặt hóa học.

Hình 7. Nồng độ methyl salicylate khi có glycine ở các tỷ lệ Hình 8. Phổ H NMR cho thấy độ dịch chuyển hóa học của
glycine/methyl salicylate khác nhau methyl salicylat và methyl salicylate+glycine
3.7 Vai trò của nhóm amin so với nhóm carboxyl của Glycine trong quá trình thủy phân
Methyl Salicylate:
Để tìm hiểu vai trò của nhóm amin và nhóm carboxyl tương tác với Methyl Salicylate, một thí
nghiệm được tiến hành bằng cách tạo ra loạt dẫn xuất của glycine có gắn các nhóm bảo vệ vào
nhóm amin hoặc nhóm carbonyl hoặc cả hai nhóm. Cụ thể, các nhóm bảo vệ như T-
butyloxycarbonyl (BOC) được gắn vào nhóm amin và methyl este được gắn vào nhóm
carbonyl, từ đó tạo ra các chất Boc-glycine methyl este, Boc-glycine, Glycine methyl este để
tương tác với Methyl salicylate, thí nghiệm được quan sát nhờ vào phổ 1HNMR như (hình 9).

Hình 9. Nồng độ methyl salicylate khi có mặt các dẫn xuất của
glycine
Tuy nhiên, tại các mẫu mà không được gắn nhóm bảo vệ sẽ phụ thuộc vào pKa và pH của dung
dịch. Được biết, pKa của nhóm amin và carboxyl của glycine lần lượt là 9,6 và 2,3. Ở pH 9,
dạng anion của nhóm amin chỉ có gần một nửa so với của nhóm carboxyl (Hình 5). Do đó,
Boc-glycine có nhiều nhóm carboxyl bị khử proton hơn để sẵn sàng tương tác với Methyl
Salicylate dẫn tới tốc độ thủy phân khi có Boc-glycine lại cao hơn khi có Glycine methyl este.
Phát hiện này cho thấy nhóm carboxyl của Glycine rất quan trọng trong tốc độ thủy phân
Methyl Salicylate.
Bên cạnh đó, cấu hình phản ứng thủy phân Methyl Salicylate được thực hiện bằng phép tính
DFT như trong (Hình 10). Mô hình cho thấy nhóm carboxyl của Glycine tạo phức hợp bằng
liên kết hydro với oxy của nước. Sau đó, oxy của nước trong phức chất hoạt động như một tác
nhân ái nhân (nucleophile) tấn công nhóm cacboxyl của Methyl Salicylate tạo phức hợp trung
gian TS3. Tiếp đó phản ứng chuyển sang TS2 và được ổn định nhờ liên kết hydro được hình
thành giữa nhóm -OH (gắn ở vị trí ortho) với nhóm carboxyl của Methyl Salicylate do độ dài
liên kết gần nhau, chỉ khoảng 1,58 Å, cuối cùng tạo thành sản phẩm. Quá trình này đòi hỏi
năng lượng kích hoạt cao tức nồng độ Glycine phải cao để đảm bảo tốc độ phản ứng thủy phân
nhanh.

Hình 10. DFT của methyl salicylate + glycine

Theo các giá trị pKa của Glycine, tỷ lệ nhóm amin bị proton hóa và bị khử proton của Glycine
ở pH 9,0 bằng 4:1 (Hình 5). Để hiểu amin bị proton hóa của Glycine ảnh hưởng thế nào đến
quá trình thủy phân, thí nghiệm được thực hiện ở pH 7,0 và pH 5,0, trong đó hơn 99% Glycine
ở dạng trung tính (+NH3CH2COO-). Thấy rằng, dạng trung tính của Glycine không tạo thành
phức chất với nước, do đó, nó không góp phần vào quá trình thủy phân. Kết quả là Methyl
Salicylate không bị thủy phân ở pH 7,0 và pH 5,0 sau 48 giờ.Có thể hiểu rằng, Glycine dạng
amin proton hóa dù chiếm ưu thế về nồng độ vẫn không ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Methyl Salicylate.
Tiếp đến, giả thuyết thủy phân Methyl Salicylate có thể xảy ra khi Methyl Salicylate và
Glycine trộn lẫn với nhau trong dung dịch kiềm: Methyl Salicylate có thể bị ly giải qua quá
trình aminolysis. Nhận thấy, không có sự hình thành liên kết amit sau khi thủy phân bằng
Glycine. Người ta luôn phát hiện ra acid salicylic là sản phẩm thủy phân chính quá trình này.
Vậy nên, Glycine không phản ứng trực tiếp với Methyl Salicylate và hình thành liên kết cộng
hóa trị thông qua quá trình aminolysis.
Tóm lại, từ thực nghiệm giả thuyết hoạt động được đưa ra là nhóm cacboxyl của Glycine tạo
có thể tạo thành phức chất ổn định với phân tử nước thông qua liên kết hydro. Oxy của nước
trong phức chất này sẽ hoạt động như một nucleophile gắn vào nhóm carbonyl của Methyl
Salicylate trong môi trường kiềm. Được biết, phức chất glycine-nước này chỉ có thể hình thành
nếu nhóm amin của Glycine bị khử proton hoàn toàn hoặc một phần chứ nhóm amin không
tham gia nhiều vào quá trình thủy phân.
IV. Bàn luận.
Bài nghiên cứu này chỉ ra vai trò của Glycine trong quá trình thủy phân Methyl Salicylate. Khi
có Glycine trong dung dịch thì có tăng tốc độ thủy phân dù Glycine. Ngoài ra, tốc độ thủy phân
Methyl Salicylate tăng đáng kể ở độ pH cao hơn dù có Glycine hay không. Vì vậy, người xây
dựng công thức phải thận trọng hơn khi kết hợp Methyl Salicylate vào các acid amin trong sản
phẩm. Giải pháp được đưa ra là giữ hoặc giảm quá trình thủy phân này bằng cách giảm độ pH
hoặc giảm nồng độ acid amin. Phát hiện này cũng sẽ rất hữu ích trong việc ổn định 1 như một
hương vị trong sản phẩm tiêu dùng hoặc thực phẩm có chứa acid amin, chẳng hạn như chế độ
ăn kiềm.
Nhìn chung, Methyl salicylate có tác dụng làm xung huyết da, thường được phối hợp với các
loại tinh dầu khác để làm thuốc bôi ngoài da, thuốc xoa bóp, băng dính điều trị đau. Công trình
này cung cấp sự hiểu biết cơ học về quá trình thủy phân bằng acid amin và bài học từ công
trình này có thể hữu ích cho việc phát triển sản phẩm trong tương lai khi sử dụng dầu lộc đề
xanh làm hương liệu.

Tài liệu tham khảo

1
:https://issuu.com/daykemquynhonofficial/docs/oclrmsasnamo?
fbclid=IwAR3UdH3hFmJxM3xg15SaOXl8Taf9SbxKHwMTmpMVp35KY9G3B5RAHE7sw9
c