CIENCIA 16(2), 241 -250, 2008 Maracaibo, Venezuela Determinacion de nitritos en chorizos por espectrofotometria derivativa, utilizando un sistema de anilisis en flujo Maximo Gallignani*, Lyda Castellanos, Maribel Valero xy Maria del Rosario Brunetto Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad de tos Andes (UA), ‘apartado postal 440, Mérida 5101-A, Venezuela. Resibidor 13.0607 Aceptada 12.02.08 Resumen En cl presente trabajo se disefié un método de andlisis para la determinacién de nitritos en productos carnicos (chorizos), que utiliza un sistema acoplado de analisis en flujo (AF) con de- teceién espectrofotométrica basada en la reaceiGn de Shinn, El sistema permite la adquisicién de espectros de absorcidn en continuo con un espectrofotémetro convencional dispersive, utili- zandbo el blanco quimico como referencia. Se seleccion6 como criterio de medica el maximo a 590 nm de la derivada de segundo orden del espectro de absorcién, que permite eliminar las in- terferencias espectrales de matriz, Se estudié el efecto de pardmetros espectrosedpicos del sis- tema AF y de la reaccién quimica sobre la seal analitica. La optimizacién del sistema se realiz6 por el método univariado. Las figuras de mérito (rango lineal hasta 1,5 4g NO, ml: deteceién (30) y cuantificacién (100) de 0,004 y 0,015 ugg", respectivamente: precisién menor al 1%, y frecuencia de medida de 30 muestras h) son apropiadas para el andlisis propuesto. Los estudios de recuperacién y adicién estandar corroboraron la exactitud del método que se aplicé al anilisis de chorizos. Palabras claves: nitritos, espectroscopia derivativa, andlisis en flujo, espectrofotometria, chorizos, Derivative spectrophotometric determination of nitrite in sausages, using a flow analysis system Abstract In this work, a flow analysis (FA) derivative spectrophotometric method, based on the Shinn reaction, has been developed for the determination of nitrite in sausages. The system allows the acquisition of the absorption spectra in a continuous mode with a conventional spec- trophotometer, using the chemical blank as a reference. The peak at 590 nm of the second order derivative spectra was selected asa measurement criterion, in order to avoid the spectral matrix Interference. The effect of different spectroscopic, instrumental, flow analysis, and chemical reaction parameters on the analytical signal was evaluated. The optimization of the system was carried out by the univariate method. The main figures of merit (linear range up to 1.5 \1g NO, mL *; limits of detection (30) and quantification (100) of 0.004 and 0.015 yg mL’, respectively - E-mail: maximoeula.ve Autor para la correspondenci Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008-M. Gallignan et.al | Ciencia Vol. 16, N?2 (2008) 241 - 250 242 precision lower than 19%, and sample frequency of 80 samples h"), are appropriate for the pro- posed analysis. The recovery and standard addition studies showed the proposed method as accurate. The method was applied to the determination of nitrite in sausages (chorizos). Key words: nitrite. Spectrophotometry. Introduccién El nitrito de sodio (0 potasio), al igual que los correspondientes nitratos. se utiliza de forma extensiva en el proceso de curado de muchos productos carnicos, ya que elton nitrito inhibe el desarrollo anaerébico de cierios microorganismos, especialmente del Clostridium botilinum, que ayuda a fijar el color en las carnes rojas y contribuye al de- sarrollo de las caracteristicas organolépt cas del producto (1). Los nitratos presentes. en los productos carnicos se reducen a la forma de nitritos por accién de bacterias que se desarrollan en ese medio, mientras los ni- tritos son parcialmente reducidos a la forma dle NO, compuesto que reacciona con la mio globina y por esta via es el responsable de la coloracién tipica de las carnes curadas. Sin embargo, en la actualidad, esta bien docu- mentado el efecto perjudicial y t6xico que cjercen los nitritos sobre la salud (2-4) El nitrito es responsable de la metahe- moglobinemia y ¢s un importante precursor en la formacién de las N-nitrosaminas, mu- chas de las cuales son eancerigenas y muta- Kénicas (1. 2). Por esta razén, las legislacio- nes actuales de muchos paises restringen el contenido de nitratos y, especialmente, de nitritos en los alimentos. La legiskaeién v nezolana establece un limite en el contenido total de ambos iones en productos carnicos de 180 ug g', expresado bajo la forma de ni- tritos (5). Por todo lo expuesto, es evidente que se requieren métodos analiticos accesi- bles, validos y viables para el control de eali- dad de este parametro. En la literatura se encuentran deseri- tos una gran cantidad de métodos para la determinacién de nitritos, muchos de los cuales han sido incluidos en algunos articu- derivative spectroscopy, flow analysis, sausages (chorizos), los de revisi6n (6-8). Sin embargo. en la ac~ tualidad, la mayoria de los métodos pro- puestos son espectrofotométricos y se fun- damentan en diversas variantes de la reac cién de Griess-losvay, especialmente la reaceién de Shinn. La base de estos métodos es una reac: cién quimica en la que interviene el i6n nitrito para generar un compuesto tipo azo. intensa- mente coloreado, cuyo maximo de absorcién, se encuentra en el visible (8-10), Muchas de estas propuestas metodolégicas se han desa- rrollado en sistemas de andltsts por inyeccién. en flujo (AIF) en las que se monitorea la ab- sorbancia en el maximo de absoreién, lo que ha permitido, con relativa facilidad, su auto matizacién, Sin embargo, esta estrategia pierde su vigencia en el anilisis de aquellas muestras que presentan interferencias ¢s- pectrales por parte de la matriz. Para estos casos, la espectroscopia derivativa puede ofrecer sohuctones simples. directas y valtdas desde el punto de vista analitico (11-15). No obstante, para desarrollar esta estrategia. es indispensable disponer del espectro de ab- sorcién. El espectro de absorcién permite, entre otras opciones: i) corregir la absorban- cia en el maximo de absorcién por desplaza- mientos del espectro respecto a la linea de base. ii) observar desplazamientos en el ma- ximo de absorcisn, tit) observar de forma cla- rala presencia de interferencias de matriz, 1v) seleceionar diversos criterios de medida. y v) el desarrollo de estrategias fundamentadas en la espectroscopia substractiva. la espec- troscopia derivativa o en ambas. El principal objetivo de este trabajo fue diseftar-y desarrollar— un sistema acoplado de andllisis en flujo con deteccién por espec- troscopta derivativa de absorceién molecular enel visible (AF-EDAM-Vis), simple y accesi- Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008243 Determinacin de ntritos en chorizos por espectrofolometria derioation ble, que permita la adquisicion rapida de los espectros de absorcién en una modalidad continua, utilizando un espectrofotémetro convencional de tipo dispersivo. Esta condi- cién es fundamental para poder desarrollar estrategias fundamentadas en la espectros- copia derivativa. El método se aplies a la de- terminacién de nitritos en productos carni- cos (chorizos). Materiales y métodos Instrumentacién La figura I muestra el diagrama esque- matico del montaje AF-EDAM-Vis utilizado, que consiste basicamente en el acoplamiento ce un sistema simple de analisis en flujo con un espectrofotémetro convencional de doble haz. que se ensamblé a partir de equipos y ac- cesorios comerciales, Consta de una bomba peristaltica (P) de cuatro canales, Ismatec IPC; tuberia de Tygon para la propulsién del portador (C); las muestras y estandares (Cy) y los diversos reactivos (C., v Cy.J: dos ser- pentines de reaccién de PTFE (R, y RJ: dos microceldas de flujo con un volumen interno de 160 ul y un paso éptico de 1 em (CF, y CF), que acttian como celda de trabajo y de referencia, respectivamente: yun espectrofo- témetro Perkin Elmer (PE), modelo Lambda 20. El sistema incluye un canal adicional (C,), también propulsado por P, que permite la recirculaci6n de la solucién de referencia a través de un circuito cerrado (figura 1) y una valvula selectora (VS) que permite la intro- duccidn selectiva de la solucién portadora (posicién 1) o las muestras o estandares (po- sicién 2) en el sistema. Los espectros de ab- sorcién se adquieren en una modalidad con- tinua (entre 680 nm y 440 nm) a una veloci- dad de barrido de 960 nm min''y una resolu- clén de 1 nm, El instrumento, asi como el procesamiento de los datos espectrales. se controla a través de um computador personal equipado con el software WinLab de PE. Reactivos y muestras Todos los reactivos utilizados en ¢l pre sente trabajo fucron de grado analitico, y se utilizé agua ultrapura (indicada en el texto con as siglas AD) suministrada por un siste~ ma Milli-Q TOC (Millipore). Se preparé I L de una solucién patrén de nitrito (1000 mg L’') a partir de nitrito de sodio secaco previamente en una estufa du- rante 5 horas a 110°C. A esta soluci6n se le anadié 1 g de NaOH para preventr la libera~ cién de acido nitroso y, tras el enrase, 1 mL de cloroformo (grado espectroscépico) para preventr el desarrollo bacterial. Las sohicio- nes de trabajo (esténdares) se prepararon. diariamente por dilucién adecuada del pa~ trén en AD. La solucién de sulfanilamida (SUL: 0.25% p/v) se preparé disolviendo 1,25 g de SUL en 25 mL de HCI concentrado, diluyendo hasta 500 mL con agua destilada. fea Cree ry Figura 1. Diagrama esquematico del portador (agua); Cuc muestra (estindar); rencia; VS: valvula selectora manual; Ri-Re: serpentines de reaccién; de trabajo y referencia, istema AF- Pc CFr Drenaje EDAM-Vis desarrollado. P: bomba peristiltica; Cr: (Coat sulfanilamida; Cor: NED; Cres solucién de refe- Fr, CFs celdas de flujo Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008-M. Gallignan et.al | Ciencia Vol. 16, N?2 (2008) 241 - 250 24 Por su parte, la solucién de N-(1-Naftil-et- ilendiamina (NED: 0,5% p/v) se preparé di- solviendo 2,50 g del reactivo en agua y le- vandola a aforo con el mismo solvente hasta los 500 mL. Estos reactivos, conservados en botellas ambar y bajo refrigeraci6n, son es- tables, al menos. por un mes. El blanco quimico del sistema, la solu- cidn que resulta de la mezela del portador y las soluciones de SUL y NED en la configu- racién que se ilustra en la Figura 1, se reco- geal comienzo de la sesién de trabajo ala sa- lida de la celda (CF,) durante la etapa en la que se introduce el portador de forma conti- nua en el sistema, Esta solucién, al igual que su espectro de absorcién. es estable du- rante las primeras doce horas. Diez diferentes tipos de chorizo produ- cidos artesanalmente en la ciudad de Méri- da, Venezuela, fueron adquiridos en expen- dios de alimentos de la ciudad y analizados por el método propuesto. Las muestras fure- ron procesadas siguiendo la norma 973.31 de la AOAC (16). que basicamente establece ¢l tratamiento de la muestra con agua ca- liente a 80 °C, La muestra es inicialmente triturada y homogeneizada en un procesa- dor de alimentos. Luego. 10 g de muestra (hiimeda) procesada se colocan con 50-60 mL de agua caliente en un beaker de 400 mL, se homogeiniza la mezcla y se somete al protocolo recomendado: el vaso dle precipi- tado se coloca en un banto de Maria a 80°C. se ahaden 250 mL de agua y se deja digerir la mezela por 2 horas. A continuacién, la muestra digerida se filtra, se afiaden unas gotas de NaOH 1 My se lleva a aforo hasta los 500 mL con AD. Tras el enrase, se afhade I mL de cloroformo. En este punto la solu- cién esta lista para ser analizada. Se proce- saron varias muestras en paralelo para mi- nimizar el impacto de esta etapa sobre el tiempo de andlists, Una fraceién de las muestras procesa- das se seeé mediante liofilizacién (para de- terminar el contenido de humedad), y en un procedimiento alternativo se repitié el pro- tocolo, pero tomando como base 5 ¢ de la muestra procesada seca. Procedimiento de anélisis Para iniciar el sistema, VS se coloca en la posicién 1 (figura 1) para introducir el porta- dor. En esta etapa preliminar se define la senial de fondo (background), y a continuacién se ad- quiere el espectro de referencia del sistema (blanco). En este punto, el sistema esta listo para comenzar el protocolo de trabajo. Elsistema opera en tres etapas: i) intro- duccidn de la muestra, i) adquisicién del es- pectro de absorcién y iii) etapa de limpieza (13-14). En la primera etapa, VS se coloca en Ja posicién 2 para introducir la muestra (es tandar) en el sistema. De esta forma, la solu- cién que contiene el analito en su recorrido hacia la celda de trabajo se mezcla y reaceto- na con la SUL en el serpentin de reaccién R, y la solucion resultante lo hace con el NED. en R,, donde finalmente se produce el azo compuesto caracteristico de la reaceién de Shinn, Por tiltimo, esta solucién se dirige ha- cia CF,y, finalmente, va al drenaje. En este punto, sc adquicre el espectro de absorcién correspondiente (secuencia 2) en una moda- lidad continua, realizando tres barridos de forma secuencial c independiente. El tiempo minimo necesario para que Ia solucién haga el recorrido descrito. des- de su introduccién al sistema, es de unos 20 8. Sin embargo, el tiempo de introdue- cidn de la muestra, previo a la adquisicién de los espectros, s¢ fijé en 30 s con el fin de asegurar una composicién homogénea de Ia solucién resultante y. con ello, la maxi ma senal analitica, Antes de introduciral sistema una nue- va muestra (o estindar), se recomienda rea- lizar una etapa de limpieza (secuencia 3) Para lograr este propésito, VS se vuelve a co- locar en la posicién 1 para introdueir agua al sistema durante unos 20 0 25 s. De esta for- ma se limpia el sistema y se evitan los inde- seables efectos de memoria (carry over). En Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008245 Determinacin de ntritos en chorizos por espectrofolometria derioation este punto, cl sistema esta preparado para la introduccin de una nueva muestra. El tiempo necesario para completar el ciclo de medida de cada muestra o estandar es del orden de los 2 minutos. Resultados y discusién Estudio espectral del sistema En la literatura se han descrito diver- sos métodos espectrofotométricos para la determinacién de nitritos en productos ali menticios que tienen su base en la reaceién de Shinn (6-10). Sin embargo, en algunos productos cérnicos. como los chorizos. la matriz de la muestra puede generar intere- santes problemas analiticos: interferencias de tipo espectral. La figura 2A muestra en forma compa- rativa los espectros correspondientes a las especies quimicas relacionadas con el siste- ma bajo estudio (blanco, muestras y estan- dares). El blanco del sistema (figura 2A-a) es transparente en la regién comprendida en- tre 400 y 700 nm, mientras que l azo com- puesto que se genera durante la reaccién de Shinn muestra una banda de absorei6n si- métrica y ensanchada entre 425 y 625 nm (figura 2A-b), con un maximo bien definido en 542 nm, En contraste, la solucién de la muestra de chorizo absorbe en todo el inter~ valo estudiado, mostrando una banda en- sanchada entre 435 y 625 nm, con un maxi- mo en 515 nm y dos hombros localizados en 545 y 480 nm, respectivamente (figura 2A-c), Esto evidencia la presencia de una in- terferencia espectral clasica, que se origina Figura 2. (A) Comparacién de los espectros de absorcién de reactivos, estindares y muestras. (a: blanco, (b): estindar (0,3 j1g NOr mL), (c): muestra (0,25 14g NOr mL). La figura A-(d) corresponde al espectro de absorcién de la solucién de la muestra obtenido en ausencia de la reaccién de Shinn. (B) Derivada de segundo orden (D®) de los espectros de absorcién correspondientes a: (a) estindar (0,3 ug NOx mL: figura 2A-b) y (b) muestra (0,25 1g NOr mL: figura 2-c). (C) Espectros D? correspondientes a una calibracién simple tipica: (a 1 (b) 0,25, (C)0,50 y (d)1,0 pig NOx mL*. (D) Espectro D*correspondientes a una curva de adicién de estandar: (a) 0, (8) muestra (0,25 ig NOr mL), y la misma muestra enriquecida con: (b) 0.25, (4) 0,50 y (d) 1,0 jug NOz mL. Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008-M. Gallignan et.al | Ciencia Vol. 16, N?2 (2008) 241 - 250 246 por la superposicién de las bandas de absor- cién del compuesto azo con las correspon dientes a la matriz de la muestra, De esta forma, el primer hombro tiene su origen, ev dentemente, en la contribucién del azo com- puesto, mientras que el segundo debe ser atribuido exclusivamente a la matriz. Es importante destacar que todas las soluciones ce Jas muestras que se obtuvie- ron tras el procesamiento de los chorizos Presentaron una coloracién rosado-rojiza en su estado natural (en ausencia de reac- cin de Shinn), cuyo espectro presenta un maximo en 480 nm, como se observa en la Ngura 2A-d, Sin embargo, la intensidad en la coloracién varia con la muestra. La colora- cién incrementa su intensidad cuando se aumenta la masa de muestra utilizada en la preparacién de las soluciones. Este compor- tamiento puede tener su justificacién en la presencia de colorantes hhidrosolubles que se incorporan en la produccién de este tipo de productos cérnicos, cuya concentracién y tipo varia segtin el produictor. La espectroscopia derivativa ha sido muy utilizada dentrode la espectroscopia de absorcién molecular (ultravioleta, visible & infrarrojo) para solventar este tipo de incon- venientes (11-13). En este caso particular, €l uso de la derivada de segundo orden del es- petro de absorcién (A/a. que se indica en el texto como D?) permite separar con cla- ridad Ia sefial del analito, como se observa en la figura 2B, donde se presentan los es- peetros D’ del estndar y la muestra previa- mente descritos. En este caso particular, el maximo (el pico) a 590 nm del espectro D* aparece como una sefial analitica clara, lim- pia y libre de interferencias. Este comporta- miento se ratifica en las figuras 2C y 2D, donde se observan los espectros D’ corres- pondientesa una calibracién tipica entre Oy 1ugNO, mLy a una calibracién por adictén de estndar que utiliza como base la solu- cidn de la muestra M2 con un contenido de NO, de 0.25 ug mL ', ylamisma muestra en- riquecida con nitritos en el intervalo de 0a 1 ug mL". Seleccién de las condiciones de operacién del sistema de anélisis La puesta a punto del sistema se llevé a cabo por el método univariado, Para esto se optimizaron 0 seleccionaron diversos paré- metros espectroscépicos (intervalo espec- tral, velocidad de barrido, resolucién nomi- nal. ctc,) del sistema AF (configuracién, cau- dal de los diversos canales, etc.) y relaciona- dos con la reaccidn de Shinn (coneentracién de reactivos. longitud de los serpentines de reacci6n, etc.) (15). Las condiciones de tra- bajo seleceionadas se resumen en la tabla 1. Caracterizacién analitica y validacién de la propuesta metodolégica EI sistema propuesto, bajo las condi- clones experimentales seleceionadas (ver ta~ bla 1), se caracteriz6 analiticamente en tér~ minos de: respuesta lineal (hasta 1,5 ug NO, mL"; tabla 2); limites de deteccién (86: 0,004, ug mL’) y cuantificacién (100: 0,015 ug mL); y precisién del sistema de medida -expresada por la desviacién esténdar rela- tiva (DER}- menor de 1% (0.7% para estan- dares ([NO,] = 0,50 ug mL"; n=5) ¥ 0.9% para muestras ([NO,]q = 0.55 ug mL"; n=5). La precisién clel método completo, incluida la preparacion de la muestra, se evalué prepa- rando cinco soluciones de la muestra M2 de forma independiente, y fue de 1,8%. Por tilti- mo, la frecuencia de analisis -o de medida (cin tomar en cuenta la preparacién de las muestras) fue del orden de 30 muestras por hora. Se realizaron curvas de adicién de es- tandar con las soluciones de las muestras de chorizo M1 y M2. con contenidos endégenos de nitrito de 0,55 ug mL" y 0.25 wg mL, res- pectivamente, siguiendo el procedimiento que se describe en la tabla 2. Las pendientes de estas curvas no mostraron diferencias significativas con respecto a la curva de cali- bracién simple, lo que indica la ausencia de interferencias por parte de la matriz. La exactitud del procedimiento pro- puesto se evalué mediante estudios de recu- Scientific Journal of the Experimental Faculty of Sciences, atthe Universidad del Zulia Volume 16 N° 2, April-June 2008