THỰC HÀNH HHTM

ĐIỀU CHẾ HỒNG CẦU MẪU HUYẾT THANH MẪU

1) Sản xuất Huyết thanh mẫu
Nguyên tắc
- Huyết thanh mẫu được điều chế từ mẫu máu toàn phần, sau khi gạn tách huyết tương và loại bỏ
yếu tố đông máu.
- Huyết thanh chứa kháng thể được sử dụng để định nhóm máu bằng việc kiểm tra hiện tượng
ngưng kết hoặc không ngưng kết với hồng cầu chứa kháng nguyên.
- Huyết thanh chứa hỗn hợp gồm các protein không có trong quá trình đông máu, các chất điện
giải, các nguyên tố vi lượng, đa lượng và nước.
Cách điều chế huyết thanh mẫu
- Lấy máu tĩnh mạch, cho vào ống nghiệm không chứa chất chống đông
- Để ở nhiệt độ phòng 30 phút đến 1 giờ cho đến khi máu đông lại để loại bỏ yếu tố đông máu.
- Sau đó để vào ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ 2-6 độ C để bảo quản từ 2-3 ngày.
- Quay li tâm thu được phần huyết thanh ở phía trên.
- Sau khi điều chế huyết thanh cho dung dịch sodium azide 5% (để bảo quản)
- Cho thêm các phẩm màu để phân biệt giữa các HTM
 Cho xanh methylene vào => HTM anti-A
 Cho đỏ congo hoặc eosin => HTM anti-B
Kiếm tra huyết thanh mẫu
❖ Kiểm tra độ nhạy:
- Nhỏ lên lam kính:
 1 giọt HTM
 2 giọt HCM sau khi pha loãng lên giọt HTM
 Trộn thành vòng tròn 3cm (bấm đồng hồ chạy)
 Sau khi thấy hiện tượng ngưng kết đầu tiên bằng mắt thường, bấm dừng đồng hồ và đọc
kết quả
❖ Đo cường độ
- Nhỏ lên lam kính:
 1 giọt HT mẫu
  1 giọt HCM sau pha loãng
- Trộn đều và bấm thời gian
- Nếu thấy có hiện tượng ngưng kết hoàn toàn trc 3p bấm dừng đồng hồ
- Trong 3p phải ngưng kết hoàn toàn (+++)
❖ Hiệu giá kháng thể:
- Chọn mẫu HT đã biết trc nhóm máu
- Pha loãng HT bằng nc muối sinh lý theo tỉ lệ (½, ¼, ⅛, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128) vào 7 ống nghiệm
- Cho 200µL HCM “A” vào 7 ống nghiệm.
- Tiến hành quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút
- Lắc mạnh các ống nghiệm cho lớp hồng cầu ở dưới bong lên, quan sát hiện tượng ngưng kết, sau
đó đọc kết quả
2) SẢN XUẤT HỒNG CẦU MẪU
Nguyên lý
- Hồng cầu mẫu được điều chế từ mẫu máu toàn phần, loại bỏ hết huyết tương bằng nước muối
sinh lý NaCl 0,9%.
Tiến hành
- Cắt dây túi máu (nhóm máu cần điều chế) cho vào ống nghiệm 1ml máu
- Cho NaCl 0,9% vào ống nghiệm. Trộn đều máu và nước muối
- Đem quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.
- Sau khi quay ly tâm xong, lấy ống nghiệm ra, dùng pipette pasteur hút bỏ lớp dịch ở bên trên.
- Tiếp tục cho NaCl 0,9% vào ống nghiệm có chứa máu vừa hút dịch, lắc đều. Đem quay ly tâm
3000 vòng/phút trong 3 phút, làm liên tục như vậy thêm 2 lần.
- Sau khi rửa HC 3 lần như vậy, tiếp tục cho NaCl 0,9% vào ống nghiệm. Lắc đều
- Đem quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để cho HC lắng và ổn định.
- Sau khi ly tâm xong, dùng pipette pasteur hút bỏ lớp dịch ở trên và lớp bạch cầu tiểu cầu ở giữa.
- Cho NaCl 0,9% vào ống nghiệm pha loãng, lắc đều ➔Thu được HCM mong muốn
- Sau khi điều chế HCM mong muốn cần kiểm tra lại có đúng như HCM mà mình muốn điều chế
không được xác định bằng cách: Dùng HTM mẫu
 HỆ THỐNG NHÓM MÁU ABO

- Nhóm máu A1:

• Ngưng kết mạnh với kháng thể chống A
• Không bị ngưng kết với kháng thể chống H
- Nhóm máu A2:
• Ngưng kết kém hơn với kháng thể chống A
• Bị ngưng kết với kháng thể chống H
- Nhóm máu O: kiểu hình Bombay
• Không có KN A, B, H
• Có KT chống A, chống B và chống H
• LƯU Ý: Nhóm máu O Bombay chỉ nhận từ người có máu O Bombay
- Nhóm Ohm: O bombay trung gian
• Không có KN A, B, H
• Có KT chống A, chống B nhưng không có KT chống H
 ĐỊNH NHÓM MÁU TRỰC TIẾP

ĐỊNH NHÓM MÁU TRONG ỐNG NGHIỆM

❖ Phương pháp TT
- Pha 5% máu BN (tỷ lệ 1:19) thu được mẫu HC pha loãng 5%
- Hút 200 µl mẫu HC 5% vào 4 ống nghiệm
- Hút 400 µl mẫu HC 5% vào ống Ctrl
- Nhỏ 1-2 giọt huyết thanh lần lượt Anti A, B, AB, D vào 4 ống
❖ Phương pháp GT
- Pha HC mẫu A và B
- Mẫu BN sau khi quay ly tâm thu đc huyết tương
- Hút 200 µl HTg BN cho vào 2 ống nghiệm
- Hút 200 µl HCM A, 200 µl HCM B vào 2 ống chứa HTg
- Đem tất cả các ống nghiệm ở phương pháp trực tiếp và gián tiếp quay li tâm 3000
vòng/ 3 phút.
- Sau khi li tâm xong, lấy tất cả ống nghiệm ra, lắc mạnh tay cho lớp hồng cầu ở
đáy bong lên, tan đều.
-Tiến hành đọc kết quả
- Cần kiểm tra mẫu Control trước khi đọc kết quả:
 Nếu không có hiện tượng tự ngưng kết, đọc kết quả bình thường
  Nếu tự ngưng kết thì phải đem đi xử lý bằng cách rửa hồng cầu từ 3-6 lần với nước muối
sinh lý cho hồng cầu giảm ngưng kết, nếu không được nữa sẽ xử lý cách khác
- Kết quả
TH Anti A Anti B Anti AB Anti D Ctrl HC A HC B
Máu A (-/+) + - + -/+ - - +
Máu B (-/+) - + + -/+ - + -
Máu AB (-/+) + + + -/+ - - -
Máu O (-/+) - - - -/+ - + +

BIỆN LUẬN MỘT SỐ TH:

TH Anti A Anti B Anti AB Anti D Ctrl HC A HC B
1 +/- - + + - - +
2 3+ - 3+ 4+ - A1: 2+ 4+
3 4+ + + 4+ - - +
4 + + + + + - -
5 - - - + + +
6 - - - -

❖ TH 1:
- TT: có thể máu “A+”
 HC quá đậm nên Anti A ngưng kết không hết ➔kết quả (+)/(-) ➔ giải quyết: Pha loãng
HC BN
 BN có 2 quần thể hồng cầu do BN máu “A” truyền máu “O” (thường gặp)
- GT: máu “A
 Tại sao máu “O” mà HCM A vẫn (-) do truyền khối HC đã hạn chế KT cũng như BC, TC
❖ TH 2:
- TT: Máu “A+”
 Bất thường HCM A
 BN máu “A2”
o Phụ thuộc vào máu “A”, Có KN A nhưng yếu hơn
o Có KT chống A1 ➔ HCM A (+)
 Thay thế bằng HCM A2 ➔ nhóm máu A2 sẽ (-) tại HCM A2
- GT: máu “O”
 Anti A và Anti AB: bất thường
 ❖ TH 3:
- TT: máu “AB+”
 Xuất hiện KT bất thường bên HCM B
- GT: máu “A”
 Xuất hiện KN lạ
- Kinh nghiệm: cái nào dương thấp ➔ bất thường
❖ TH 4:
- Ctrl (+)
 Không được trả nhóm máu
 Xem xét quy trình của khoa để xử lý
 Mẫu tự ngưng kết: Ảnh hưởng đến CT máu ➔ lấy ống máu ủ 37oC/15p➔ kiểm tra thấy
máu tan ➔ chạy khẩn➔ phù hợp
 Rửa HC ➔ nếu ko được sẽ dùng thuốc
❖ TH 5:
- Máu “O+” nhưng tan máu gây tai biến ➔ “O” bombay
- Rh (-) thì vẫn ghi âm, ghi chú làm thêm XN khẳng định có thể (+) yếu.
❖ TH 6:
- TT: Máu “O”
 HCM dư do tán huyết
 BN có KT yếu (trẻ < 1 tuổi)
- GT: Máu “AB”
 Anti hư
 KN yếu do bệnh hoặc do tuổi già
 ❖ TH 1:
- TT: máu “O”
 HCM A và B hư
 BN có KT yếu ➔ Kiểm tra lại mẫu
- GT: máu “AB”
 Anti A và B hư
➔ kiểm tra lại lọ Anti
❖ TH 2:
- BN máu “A”, bất thường ở pp gián tiếp HC A(+) là sai. Nguyên nhân có thể là do lộn giữa
HCM A và HCM B ➔ sử dụng 1 bộ HCM khác để định lại nhóm máu.
❖ TH 3:
- Ctrl (+) ➔ KTBT
❖ TH 4:
- TT: máu “O”
 Anti “AB” hư
- GT: máu “AB”
 Anti A, B và HCM A,B: hư
 Xuất hiện KT bất thường
 NGHIỆM PHÁP COOMBS TRỰC TIẾP
1) Nguyên lý
- Sử dụng thuốc thử kháng ϒ globulin người (AHG) để xác định sự có mặt của kháng thể miễn
dịch đã cảm nhiễm trên bề mặt hồng cầu người bệnh.
2) Ý nghĩa
- Phát hiện kháng thể/bổ thể gắn trên bề mặt HC:
 Thiếu máu tan máu tự miễn, bệnh hệ thống
 Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh do bất đồng nhóm máu mẹ con
 Phản ứng tan máu sau truyền máu do truyền không hòa hợp nhóm máu giữa người cho và
người nhận
3) Tiến hành
- Rửa HC BN (3 lần)
- Pha dd HC 5% (tỉ lệ 1:19)
- Nhỏ 1 giọt HC 5% và nhỏ 2 giọt thuốc thử AHG vào ống nghiệm, trộn đều
- Đem ly tâm 1000 vòng/phút
- Sau khi ly tâm, lắc đều ống nghiệm và xem kết quả.
4) Lưu ý
- Khi hút phần dịch nổi sau khi cho NaCl 0,9%, những lần hút đầu không nên hút cạn dịch, chỉ
hút cạn dịch ở lần rửa cuối cùng để tránh rửa trôi hết HC.
- Pha HCM đúng nồng độ 1/20
- Dùng anti D để kiểm tra vì anti D có khả năng ngưng kết mạnh.
- Câu hỏi: AHG gắn ở vị trí nào của kháng thể? AHG gắn ở vị trí Fc của
kháng thể.

NGHIỆM PHÁP COOMBS GIÁN TIẾP

1) Nguyên lý
-Sử dụng huyết thanh kháng ϒ globulin người (AHG) để xác định sự có mặt của các kháng thể
miễn dịch có tự do trong huyết thanh/huyết tương của người bệnh.
2) Ý nghĩa
- Phát hiện kháng thể bất thường trong huyết thanh/huyết tương bệnh nhân
- Ứng dụng trước khi truyền máu để xác định sự hòa hợp nhóm máu và phát hiện những kháng
thể bất thường được sinh ra sau những lần truyền máu trước, tránh tai biến sau truyền máu.
3) Tiến hành
- Rửa HCM O
- Pha dd HC “O” 5%
- Cho 1 giọt hồng cầu “O” 5% + 3 giọt huyết thanh bệnh nhân vào ống nghiệm rồi trộn đều
- Thêm 3 giọt dung dịch Liss vào ống nghiệm trên, trộn đều rồi ủ 37oC/15 phút
- Sau 15 phút quan sát nếu kết quả âm tính, thì tiếp tục cho NaCl 0,9% vào ống nghiệm và thực
hiện rửa hồng cầu bệnh nhân 4 lần
- Sau khi rửa, hút bỏ phần dịch nổi, cho 2 giọt thuốc thử AHG vào, đem quay ly tâm 1000
vòng/30s
- Sau khi quay ly tâm, lắc đều quan sát trước bằng mắt thường, sau đó quan sát bằng kính hiển vi
 Mẫu dương: khi HC kết cụm
 Mẫu âm: khi HC rời rạc
- Kết quả
 Sau khi thêm dung dịch Liss: âm tính
 Sau khi nhỏ thuốc thử AHG: hồng cầu ngưng kết → dương tính
4) Lưu ý
- Giai đoạn cảm nhiễm: lấy HT bệnh nhân cho vào hồng cầu “O”, ủ 37oC/15 phút
- Trong truyền máu cho và nhận: thay hồng cầu “O” bằng hồng cầu túi máu.
- Kháng thể bất thường là những kháng thể lạ chưa được định, sinh ra sau khi truyền máu.
- Hồng cầu chứng để kiểm tra chất lượng AHG
- Anti D để kiểm tra số lượng hồng cầu sau rửa.

CHỨNG NGHIỆM PHÙ HỢP

1) Nguyên lý
- Khi kháng nguyên có trên bề mặt hồng cầu phản ứng với kháng thể có trong huyết thanh sẽ
xuất hiện các đám ngưng kết (vón cục) thì đó là phản ứng kháng nguyên - kháng thể dương tính.
Ngược lại, không thấy xuất hiện các đám ngưng kết thì đó là phản ứng âm tính
2) Ý nghĩa
- Là phản ứng để tìm sự hòa hợp về nhóm máu hệ hồng cầu ABO và các hệ nhóm máu khác giữa
túi máu và bệnh nhân → Chọn những túi máu phù hợp với bệnh nhân về miễn dịch, góp phần
bảo đảm an toàn truyền máu.
3) Tiến hành
- Pha HC túi máu 5% và HC BN 5%
- Đánh dấu ống 1 và ống 2
 Ống 1 (ống chính): 1 giọt HCTM 5% + 2 giọt HTBN
 Ống 2 (ống phụ): 1 giọt HCBN 5% + 2 giọt HTTM
- Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 30s, đọc kết quả
 Ống 1 (ống chính) : âm tính
 Ống 2 ( ống phụ) : âm tính
- Thêm 2 giọt dd Liss, ủ 37oC/15 phút
- Rửa HC 3 lần bằng Nacl 0.9%
- Thêm 2 giọt AHG, ly tâm 1000 vòng/phút trong 30s, KQ
 AHG âm tính ➔ Không có kháng thể bất thường trong huyết tương của bệnh nhân.
- KQ âm tính, thêm 1 giọt Anti D, ly tâm 1000 vòng/phút trong 30s, quan sát và đọc KQ (kiểm
tra quá trình rửa HC)
 Sau khi quay ly tâm, lắc đều quan sát trước bằng mắt thường, sau đó quan sát bằng kính
hiển vi
 Mẫu dương: khi HC kết cụm
 Mẫu âm: khi HC rời rạc.
4) Biện luận KQ
- Ống 1, 2 (-): truyền được, không giới hạn thể tích truyền
- Ống 1 (-), ống 2 (+): khác nhóm máu, hạn chế truyền. Truyền < 250ml
- Ống 1 (+): không được truyền
5) Lưu ý
- Khi nhận chỉ định truyền máu: cần định nhóm máu, thực hiện chứng nghiệm phù hợp để đảm
bảo không bất đồng nhóm máu.
- Nguyên tắc truyền máu: kháng thể người nhận không gây ngưng kết với hồng cầu người cho.
- Tùy thuộc vào loại chế phẩm máu được truyền vào cơ thể người bệnh để đưa ra quyết định chỉ
thực hiện chéo ống 1, chéo ống 2 hay cả 2 ống chéo
 Nếu bệnh nhân truyền khối hồng cầu thì chỉ làm ống chéo 1.
  Nếu bệnh nhân truyền huyết tương hoặc tiểu cầu thì làm ống chéo 2.
 Nếu bệnh nhân truyền máu toàn phần thì làm cả 2 ống chéo.
- Kết quả phải được quan sát trên kính hiển vi để xác định chắc chắn có hay không có phản ứng
ngưng kết.
- Trong trường hợp truyền máu khác nhóm nên hỏi ý kiến bác sĩ và chỉ nên truyền tối đa 250ml
dưới sự theo dõi chặt chẽ.
- Trong trường hợp kết quả nghi ngờ cần rửa hồng cầu bệnh nhân trong nước muối sinh lý sau đó
thử lại phản ứng chéo ở 37oC.
- Cho LISS vào để tăng khả năng gắn kết vào bề mặt HC của kháng thể (nhờ sự chênh lệch
cation và anion).
- Nếu không có LISS, vẫn thực hiện kỹ thuật được, ủ thời gian 30 phút.
- Ở một số mẫu máu được lưu trữ lâu ở trong tủ đông, có thể xuất hiện các kháng thể lạnh, nên
cần ủ 37oC, cần kiểm tra lại bằng ống chứng.
- Giai đoạn 1 có vai trò khẳng định lại quá trình định nhóm máu có chính xác không.
- Ống 1 phải âm để tiếp tục làm giai đoạn 2.