Gıda Endüstrisinde

Fermentasyon Teknolojileri -2

Organizma: İzolasyon Seleksiyon / Geliştirme

 Endüstriyel Mikrobiyoloji

Gıda Endüstrisinde Fermentasyon

Teknolojileri
 Biyoprosesler ile yapılan üretimlerde şu
temel koşullar sağlanmalıdır
 1) Uygun endüstriyel mikroorganizma
suşunun temini (seleksiyon veya mutasyon
yolu ile)
 2) Mikroorganizma suşunun geliştirilmesi ve
çoğaltılması
 3) Uygun substrat seçimi ve formülasyonu
 4) Uygun koşullarda biyosentez
 5) Ürünün gelişme ortamından ayrılması ve
saflaştırılması
Endüstriyel öneme sahip
mikroorganizmalar
 The Organizma ve Mutantları
 İçerik
 Endüstriyel öneme sahip mikroorganizmaların
taşıması gereken özellikler

 Mikroorganizmaların bulunması ve seçimi

 Mikroorganizmaların özelliklerinin geliştirilmesi
 Hücre kontrol sisteminin düzenlenmesi

 Endüstriyel öneme sahip mikroorganizmaların

muhafazası
 – kültür kolleksiyonları
Endüstriyel öneme sahip m.o.’ların
taşıması gereken özellikler
 İstediğimiz ürünü üretiyor olması !
 But yield and titre may need subsequent
improvement. Get the product on the market first
and then improve!
 Hızlı üremeli ve ürünü büyük ölçekli
proseslerde de aynı hızda üretmeli.
 Resulting requirements for growth factors etc.
usually acceptable. Sometimes can only get
biomass / product yield required in small scale due
to aeration difficulties in larger fermenter.
Endüstriyel öneme sahip m.o.’ların
taşıması gereken özellikler
 Substrata uyum sağlayabilmeli.
 May require subsequent modification of medium
or organism e.g. v. low iron levels are required for
citric acid production by Aspergillus.
 Genetik manupilasyon yapılabilmeli
 Genome known.
 Gene transfer systems available.
 Genetik olarak stabil olmalı
 Güvenli olmalı ….Bacillus anthracis?
 Endüstriyel olarak bilinen bir mikroorganizma
olmalı.
 Could take genes for product formation and insert
them into an industrial “workhorse”
Ayrıca:
Maya ve küfler substratta başlangıçta var
olan yüksek konsantrasyondaki karbon
kaynaklarına dayanıklı olabilmeli
 Ürün toleransı yüksek olmalı………………
 will acid build up kill the organism?
 Ürün lokasyonu– is product excreted?
 Excretion e.g. amylases
 Can improve product tolerance(higher titres and yields).
 Easier purification (especially proteins).
 Essential for correct form of some recombinant products.
i.e. folding of protein
 Retention inside the cell e.g. B-glucosidase in
yeast
 Can assist product concentration.
 Ürünün mikroorganizmadan yada ortamdan kolaylıkla
ayrılması
 vis a vis viscosity or organism density (brewing)
Endüstriyel öneme sahip m.o
kaynakları
 Kültür kolleksiyonları
 Public e.g. NCCLS
 Private i.e. within industry

 Mevcut prosesler
 Existing processes often yield hyper-producing
strains due to self mutation…these may appear
different on plates.

 Doğa– Biodiscovery.
  Aranılan m.o’larca
Biodiscovery zengin kaynaklar için:
 Mikrobiyal
yoğunluğun fazla
olduğu çevreler
 Ekstrem çevreler
 Araştırılmamış
ortamlar
 Uygun
mikroorganizmaların
gelişmesini teşvik edici
ortamlar araştırılmalı
Biodiscovery: DNA Rotası
 İzolatlar toplanır veya DNA
rotası çıkarılır:
 Make total community DNA
extracts – can screen at this
level or:
 Put fragments (random or
selected) into a suitable host.
 Screen these recombinant
organisms.
 Artificial chromosomes (BACs
and YACs) can carry whole
pathways.
İzolasyon- İzolasyonda dikkat edilecek
kriterler
 Organizmanın besin gereksinimlerinin
ekonomik açıdan uygun olması için
uygun izolasyon ortamı seçimi
 Organizma için gerekli optimum sıcaklık
-ısıtma ve soğutma giderleri
gözönüne alınarak seçilmeli (mezofilik
m.o.)
 Organizmanın kararlılık özelliklerine ve
genetik müdaheleye uygunluğu
 Organizmanın substratı ürüne
dönüştürme verimi
 Ürünün kolaylıkla saflaştırılabilmesi
İzolasyon aşamaları
1. İzole edilmesi gereken m.o. cinslerinin
belirlenmesi
2. İzole edilecek mikroorganizmaların
bulunduğu ortamların belirlenmesi
3. M.O. seçimi sırasında çevresel
koşulların (sıcaklık, pH belirlenmesi)
4. Ölçek artırma sırasında karşılaşılması
olası zorlukların belirlenmesi
5. İzolasyon prosedürünün tasarlanması;
inkübasyon süresi, kültür ortamı
Tarama
 Süreç geliştirme veya iyileştirme sırasında
olanakları geniş bir dizi yararlı organizmalar /
genleri seçilmesi
 Hücre veya gen (DNA) düzeyinde çalışabilir
 Görevi kolaylıkla yerine getirebilmek için
 ilk deneylerin basit veya yüksek verimlilik
kapasitesine sahip tutulması
 İşe yaramayanlar elimine edildikten sonra diğerleri
üzerinde çalışılmalı
 Benzer olanlar elimine edilmeli (especially when
working with DNA)
Tarama
Daha Kompleks çalışmalar.
Ortam/proses
optimizasyonu, Genetik
kararlılık vb.

Basit /Yüksek Verimli

Decreasing No. of
denemeler
Isolates
Yüksek verimli Taramalar
 Hücre seçiciler,
mikroplaklar DNA
çipleri ve robotik
kullanımı
 Günde 3 000-10 000
analiz yapılabilmekte

www.degussa.com/en/inno
vations/
highlights_extremophile.ht
ml -
Suş/strain Geliştirme
 Yeni bir proses kurulumu yaparken veya
mevcut olana alternatif bir proses geliştirirken
oldukça önemli.
 Üremeyi veya verimi artırmak için suş
geliştirilmelidir.

Not
Organizma ortam ve proses ayrı ayrı ele
alınsa da endüstriyel bir proseste birlikte
düşünülmelidir.
 Antibiyotik Miktarının Artırılması

Titre

Year
Özellikleri Geliştirilmiş suşların
Elde Edilmesi
 Mevcut Mikroorganizma populasyonundan seçilir

 Kimyasal ajanlar veya radyasyon ile mutasyona tabi

tutuabilir

 “Klasik” Genetik: İki Mikroorganizma arası genetik

materyal değişimi- Konjugasyon, Transpozon,
transdüksiyon vb.

 Genetik Mühendisliği….strain construction, plasmid

vectors, temperature sensitive promoters, gene
shuffling using cassettes etc.
Hücre Kontrol Sistemlerini Yenmek
Araürün/son Ürün
Substrate Enzyme

Indüksiyon
Inhibisyon/Represyon
Enzim aktivitesini durdurur
Hücre içinde enzim ve metabolitlerin gereksiz
üretimini kontrol eden mekanizmalar vardır.
 Bu kontrol sistemleri manipüle edilerek
istenilen enzimin daha fazla üretilmesi
sağlanır.
Indüksiyon
Anında veya sonradan
Substrat Enzim üretilen ürün ( Ara
veya son ürün)

Indüksiyon
Inhibisyon/Represyon

 Enzim ortamda indükleyici varlığında üretilir

(genellikle substrat).
 Strateji:
 Konstitif mutantlar kullanmak
 Ortama indükleyici eklemek
Konsütatif Mutantlar
 Ortamda indükleyici olmadığında da enzimi
üretmeye devam eder. Enzim üretimi hiç
durmaz. LaKtoz Lac operon’un B-Gal enzimi
üretimini indüklerken Glukoz varlığı
operon’un durmasını sağlar. Glucose
switches off the operon. Konsütatif
mutantlarda Glukoz bunu durduramaz.

Lactose ---------------------------> Glucose + Galactose

ß-galactosidase
Bir populasyondaki Konsütatif
mutant üretimini artırmak için:
 Kemostat kültürler, substrat
sınırlayıcı besin (e.g. lactose)
The Chemostat
Bir populasyondaki Konsütatif
mutant üretimini artırmak için:
 Sıralıkesikli kültür kullanımı ile farklı
substratların indükleyici etkisinden
yararlanılır.
 Example: sequential cultures of
Escherichia coli alternating lactose and
glucose will enrich for mutants constitutive
for beta galactosidase.
 Konsütatif Mutant
 Gelişme özelliklerine bakılarak seçilebilir:

 When the sole carbon source (e.g. Lactose)

is a substrate for the enzyme but does not
induce it. Enzyme is switched on in presence
of both Lactose and Glucose
Inhibisyon/Represyon
Anında veya
Substrat Enzim sorasında oluşan ürün

Indüksiyon
Inhibisyon/Represyon
 Enzimin ürününün oluşturulması(metabolik iz
yolunda ara yada son ürün):
 Enzim aktivitesini durdurur(inhibisyon).
 Enzim üretimini durdurur(represyon).
 Strateji:
 İnhibitör veya represör maddelerin oluşturulmasında
kaçınmak.
 Bu mekanizmadan etkilenmeyen mutantlar bulmak.
İnhibitör veya represör maddelerin
oluşturulmasında kaçınmak
 İz yollarını modifiye etmek.
 Basit izyolları örnek: lisin üretimi
Aerobacter aerogenes.
 Dallanmış iz yolları: lisin üretimi
Corynebacteium glutamicum
 and effect of progressive and concretive
inhibition
 Basit İz yolu: The Lysine
Pathway in Aerobacter
aerogenes
Glycerol L,L DAP Meso DAP L-lysine + CO2

Feedback
Control

 Normal hücrelerde feed back control

lisinin iz yolunun başındaki reaksiyonu
durdurması ile sağlanır
Aerobacter aerogenes
kullanarak Lisin üretimi
 Dual/çift fermentasyon:
 İki farklı suş kullanılarak (A & B) yapılan
fermantasyon ayrı ayrı geliştirilen suşlar
aseton varlığında birleştirilerek hücre
bileşenlerinin karışması sağlanabilir
 Suş A-mutant
Glycerol L,L DAP Meso DAP L-lysine + CO2

 Meso DAP ‘ı l-lisin’ e

dönüştürememektedir
 Ortamda büyük miktarda gliserol ve çok
az lisin bulunmaktadır
 Böylece büyük miktarda L,L and Meso
DAP üretilir
SUŞ B
 Normal yaban tip m.o.
 Üremesi sırasında lisin veya diğer
ürünleri üretmez.
 Suş A ‘da bulunmayan enzimi doğal
olarak üretebilir
Kültürler karıştırıldığında :
 İki suşun kültürleri karıştırıldığında :
 Büyük miktarlarda L,L and Meso DAP (suş
A).
 Bunları Lisin’e dönüştürecek enzim (Suş
B).
 Sonuç büyük miktarlarda Lisin üretimi.
 Dallanmış iz yollarında feed back Kontrol:
Progresif and Concreted/toplu Control

 Dallanmış izyollarının sonunda oluşan

ürün dallanmadan önceki basamağı
kontrol eder.

Control Point
 Dallanmış İz yollarında Feed
Back Kontrol

 Kontrol daha komplekstir fakat iki gruba

ayrılabilir:
 Control is progressive – bir dalla oluşan ürün kısmi
durdurma sağlar diğer ürün bir kısmı daha durdurur
basamak basamak kontrol vardır
 Control is concerted – Bütün iz yollarının son ürünü
oluşmadan kontrol sağlanmaz.
The Lysine Pathway in
Corynebacterium glutamicum
Aspartate

Aspartate semi-aldehyde

Homoserine
Lysine

Methionine Threonine
CONCERTED
CONTROL Isoleucine
NOT

ve Treonin oluşmadan reaksiyon

 Lisin
durmaz
Lysine production using
Corynebacterium glutamicum
Aspartate

Aspartate semi-aldehyde

Homoserine
Lysine

Methionine Threonine

Isoleucine
 aspartate
semi-aldehiti homoserin’e
dönüştüremeyan bir mutant kullanılırsa
Lysine production using
Corynebacterium glutamicum
 Ortam da homoserin sınırlı miktarda
olmalıdır
 Treonin seviyesi düşük kalır böylece
büyük miktarlarda lisin üretilir
Inhibitör ve Represörleri
Tanımıyan mutantlar
 Bir enzimini kaybetmiş mutantlar izole
ettikten sonra bunların içinden geri dönüşüm
geçirenler seçilir
 e.g. Isolate a Lactose-negative E. coli and
then look for mutants that can use lactose.
 Ürün veya ara ürüne çok benzeyen
maddelerin varlığında gelişebilen suşlar
seçilebilir. Bu bileşik(an analogue) which:
 Kontol özelliklerini taklit edebilmeli
 Metabolize edilmemeli
 örn IPTG (isopropyl-B-D-thiogalactoside) laktoz
operon açar fakat B-galactosidase tarafından
Katabolik represyon
 Kolayca kullanılan karbon kaynakları
organizmalar için mevcut olduğunda
katabolik baskı oluşabilir
 İndüksiyon mekanizmasını baskılayabilir
 Bütün iz yolu durabilir
Catabolite Repression
(Glucose Effect)

- glucose

Glucose
galactosidase

added

+ glucose

Time (hr)
+ lactose
Katabolik represyon’un neden
olduğu problemler
 Kesiklibeslenen sistemler kullanılabilir
 Katabolik represyon olmayan mutantlar
seçilebilir -i.e. can grow in high levels of
glucose and still express galactosidase
The “In House” Culture
Collection
 Source material for
R & D.
 Strain preservation
during screening
and optimisation.
 Starter cultures for
production.
The “In House” Culture
Collection
 Isolates must remain.
 Uncontaminated.
 True to their known
characteristics, both
qualitative and
quantitative.
 Starters must be
provided in a suitable
and active form.
The “In House” Culture
Collection
 Toavoid changes due to mutation and
selection:
 Avoid excessive growth and subcuture.
 Store strains in an inactive state.

 Keep adequate backup stocks.

 Keep full records of characteristics and
validate strains periodically.
Some storage methods.
 Lyophilisation (freeze
dried stocks)
 Glycerol suspensions at
–80oc to -196oc
 Freeze onto cryobeads
(The Protect system)
 Agar slope cultures
overlaid with mineral oil
and stored at –20oc
Kültür
koleksiyonları
Dünya genelinde yaklaşık 500 kültür koleksiyonu
bulunmaktadır.
Kültür
koleksiyonları
Kültür
koleksiyonları
Kültür
koleksiyonları
Kültür
koleksiyonları
ATCC® Number: 700392™ Price:£215.00; €315.00
Organism: Helicobacter pylori (Marshall et al.) Goodwin et al.
Designations:26695 [KE26695]
Isolation:human stomach, stomach of patient with gastritis, United Kingdom [24488]
Depositor:KA Eaton
History:ATCC<<--KA Eaton <<- A.D.Pearson
Biosafety Level:2Shipped:frozen
GrowthConditions:ATCC medium 18: Trypticase soy agar
Alternate medium 260: Trypticase soy agar with defibrinated sheep
blood

Growth conditions: microaerophilic

Temperature: 37.0C
Permits/Forms:In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory
permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing
ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for
information regarding the specific requirements for shipment to your location.
TR’deki Kültür koleksiyonlarından
birkaç örnek…
Haftaya görüşmek üzere…☺