TIEU CHUAN VIETNAM TCVN 6972 : 2001 Nusc géi dau Shampoo 1 Pham vi ap dung . Tiéu chuan nay ap dung cho nuéc géi ddu téng hgp ding nguyén liéu la hing | chat hoat déng bé mat d& bj phan huy sinh hoc va céc phy gia dugc b6 Y Té cho phép sit dung trong my pham. 2 Tiéu chuan vién din TCVN 1056 - 86 Thudc tht. Phuong phap chuan bi cac thuéc thir dung dich va hén hgp phy dung trong phan tich trac quang va phan tich duc khuy&ch tan. TCVN 3778 - 82 Thuéc thi. Phuong php xac dinh asen. TCVN 4851 - 89 (ISO 3696-1987) Nudc ding 48 phan tich trong phéng thi nghiém. Yéu cdu ky thuat va phuong phap thi. \ TCVN 5454 :1999 (ISO 607-1980) Chat hoat déng bé mat va chat t€y rita - Phuong phdp phan chia mau, TCVN 5456 - 91 Chat tay rita tng hop. Phuong phap xac dinh chi sé néng dé ion hidro (46 pH). TCVN 5491 - 91 (ISO 8212-1986) Chat hoat dong bé mat va chat téy ria. Lay mau trong san xudt, 3 Yéu cau ky thuat 3.1. Yéu cdu ky thuat cla nuéc géi du phai phi hgp véi cdc quy dinh trong bang 1 va bang 2.TCVN 6972 : 2004 Bang 1 - Cac chi tiéu ngoai quan Tén chi tiéu Yéu cau 4. Trang thai Léng sanh, déng nhat, khdng tach lép, phan tang va két tua khi bién déi nhiét d6 nhé hon 10°C va Idn han 45 °C 2. Mau Déng hat 3. Mai Dé chiu, dc trung cho ting san phdm | Bang 2 - Cac chi tiéu chat lugng Ten chi tiéu Mic chat tugng 1, Ham lugng chat hoat déng bé mat, tinh bang phan tram khéi lugng, khéng nhé hon 2. pH clia dung dich 1% 3. Ham lugng asen, tinh bang mg/kg, khéng lén han 4, Ham lugng kim loai n&ng, qui ra chi, tinh bang mg/kg, khéng ln hon 5, BG kich tng da 6. Vi khudn va ndm méc 6.1. Vi khuan staphylococcus aureus, candida albicans va pseudomonas | aeruginosa | 6.2. Téng sé ném méc séng lai dude, tinh bang sé lugng con trong mét gam mau, khéng duge ln hon | 6.3. Téng sé vi khuan hiéu khi séng lai duge, tinh bang sé lugng con trong mét gam mau, khéng duge lén hon 6.4. Téng sé Enterobacteria va cdc vi khugn Gram am khac, tinh bang sé lugng con trong mét gam mau, khéng dude lén hon Khéng dang ké Khéng dude phép 100 1000 4 Phuong phap thir 4.1. Quy dinh chung Hoa chat ding 48 phan tich la loai TKPT hoac TKHH. Nudc cat sir dung theo TCVN 4851 - 89 (ISO 3696-1987). Cén phan tich, c6 46 chinh xac 0,001 g.TCVN 6972 : 2001 4.2, Lay mau va chuan bj mau Lay mau va chuan bi mau theo TCVN 5454 : 1999 va TCVN 5491 - 91 véi lugng mau khéng it hon 1000 g dling dé thi nghiém va Iu. Mau thi nghiém/mau luu dug cho vao binh riéng bi&t dam bao sach, khé, c6 nut kin, ngoai binh 66 nhan ghi: — tén chat tay rita; - tén noi san xuat; — ngay san xudt; — ngay va nai I&y mau. 4.3. Danh gia ngoai quan san pham Lay khong 200 g mau vao ede thuy tinh 500 ml. Quan sét mu bang mat thudng, & noi cé ad anh Sang, tranh anh sang chéi va khdng bj anh hung cia mau s&c khée 3 gan va khéng c6 mai la. Quan sat cdc dac tinh sau: Trang thai: M6 t trang thai quan sat duge, dac biét lu y vé tinh dng nhat ctia san phém. Mau sac: M6 ta mau séc quan sat dugc. Mii: Mé ta mai cdm nhan duge. Tht mu 6 nhiét 46 nhé hon 10 °C : Lay khoang 200 g mau vao céc thuy tinh dung tich 250 ml va d&t 6 binh 6n nhiét 10 °C. Sau 24 gid mau dat 6 nhiét d6 nay, lay ra quan sat. Thi mau 4 nhiét do ién hon 45 °C + Lay khoang 200 g mau vao céc thuy tinh dung tich 250 ml va dat 3 binh én nhiét 45 °C. Sau 24 gid mau dat 4 nhiét do nay, lay ra quan sat,‘ Banh gia mau thir theo cdc yéu cau qui dinh 4 diéu 3.1 bang 1, 4.4 Xac dinh ham lugng chat hoat dong bé mat 4.4.1 Nguyén téc Cc chat hoat déng bé mat duge tach khdi nuéc g6i ddu bang etanol va duge tinh sau khi trit di nhiing thanh phén khac cing tan trong etanol nhu clorua, glyxerin. Chuan d6 mudi clorua (tinh ra NaCl) bang bac nitrat véi chi thi mau kali cromat. Dua vao phan img oxy hod khi ctia glyxerin véi kali periodat trong méi truéng axit, Iuong periodat du tac dung vdi kali iodua giai phong iot. Dinh lugng ot méi sinh bang chuan dé 'véi natri thiosunfat va tinh ra ham lugng glyxerin.TCVN 6972 : 2001 4.4.2. Hoa chat va thuéc thi ‘ = etanol 99%; = bac nitrat, dung dich 0,1 N; = kali cromat, dung dich 10 %; — axit nitric, dung dich 4: 4; = methyi dd, dung dich 0,1 % pha trong etanol; +19 va dung dich 1+ 1; - axit clohidric, d = — natri thiosunfat, dung dich 0,1 N; - kali periodat, dung dich 0,1 N; = kali iodua, dung dich 10%; - hé tinh bét, dung dich 1 %. 4.4.3. Thiét bi va dung cu: = tt say duy tri 6 nhiét d6 105 °C + 2°C; — bép cach thuy; — binh tam giée dung tich 100 mi; - binh tam gide 6 nut nhém, dung tich 250 mi; - céc thuy tinh, dung tich 250 mi; - buret 25 mi. 4.4.4. Cach tién hanh 4.4.4.1. Xéc dinh téng ham lugng chat tan trong etanol Can khoang 5 g mau (chinh xc dén 0,001 g) vao céc thuy tinh dung tich 250 mi, thém vao do 40 ml etanol. Day céc bang mat kinh déng hé, dun néng trén bép cach thuy va khudy cho mau phan tan hoan toan. Loc mau qua gidy loc vao binh tam giac dung tich 100 ml da duge sy khé va can truéc dén khéi lugng khéng déi m, (chinh xac dén 0,001 g). Tip tuc qua trinh hoa tan trén hai lan nifa, 1an véi 20 mi etanol. Thu gdp tat cd dung dich loc vao binh tam giac trén va cé nhe binh nay trén bép cach thuy cho dén khi chi con lai can. Say binh tam gidc nay nhiét d6 105 °C dén khéi lugng khéng déi. Dé ngudi trong binh hut 4m, sau 30 phut dem can la gia tri m, (chinh xac dén 0,001 g). 4.4.4.2. Xac dinh ham lugng mudi clorua tan trong etanol Hoa tan phan can sau khi xc dinh chat tan trong etanol 6 4.4.4.1 trong 20 ml nude cat va them hai giot methyl 48, néu dung dich cé mau vang thi trung hoa bang dung dich axit nitric 1 + 4 dén mau héng. Cho vao 2,5 ml dung dich kali cromat 10 %. Chuan dé bang dung dich bac nitrat 0,1 N dén khi xuat hién mau dé gach, thé tich chudn dé la V,. Déng thdi tién hanh thi nghiém mau trang vi tat ca cdc thudéc thir nhung khéng cé mu, thé tich chudn dé la Vo.TCVN 6972 : 2001 4.4.4.3 Xac dinh ham luong glyxerin tan trong etanol Hoa tan phan c&n sau khi xac dinh chat tan trong etanol 6 diéu 4.4.4.1 trong khoang 25 ml nude va them 5 ml dung dich HC! (1 + 1), chuyén dung dich vao binh tam giae ¢6 nut nham dung tich 250 ml, thém chinh x4c 25 ml dung dich kali periodat, day nut, lac déu mau, dé yén 15 phat. Lay mau ra, cho thém 20 ml dung dich axit clohidric (1 + 1) va 20 mi dung dich kali iodua. Bay nut, Ic tron, d8 yén trong béng téi 5 phut. Sau a6 chuan d6 dung dich bang dung dich natri thiosunfat dén mu vang nhat, thém vao 46 1 mi dung dich hé tinh bet va tiép tuc chugn 46 én khi mat mau xanh ctia dung dich, thé tich dung dich chugn 46 la Vz ml. Béng thai tién-hanh thi nghiém mau trang véi tat c& cc thuée thir nhung khéng cé mau, thé tich dung dich chugn dé 1a V; mi. 4.4.5 Tinh két qua 4.4.5.1 Téng ham lugng chat tan trong etanol Téng ham lung chat tan trong etanol (X,), tinh bang phan tram khéi lugng, theo céng thie sau: (m, - mo) x 100 X= ———__ m trong dé mM, la khdi lugng ciia binh, tinh bang gam; m, la khdi luong cla cn va binh, tinh bang gam; m la khdilugng mau thi, tinh bang gam. 4.4.5.2 Ham lugng mudi clorua tan trong etanol Ham lugng mudi clorua tan trong etanol (X,), quy ra NaCl, bang phan tram khéi Iugng (%), theo céng thiic sau: (Vs = Vo) x 0,0058 x 100 X= ——______ m trong do Vs_ 1a thé tich bac nitrat 0,1 N ding 4é chudn a6 mu thi, tinh bang milli; Vo la thé tich bac nitrat 0,1 N ding 48 chuan d6 mau trang, tinh bang mililit; m_ [a khéi lugng mau thi, tinh bang gam; 9,058 [a lugng gam natri clorua tuong ing 1 ml bac nitrat 0,1 N.TCVN 6972 : 2001 4.4.5.3 Ham lugng glyxerin tan trong etanol Ham lugng glyxerin tan trong etanol (X,), tinh bang phan tram khéi lugng (%), theo cng thie sau: (V3 - V2) x 0,0023 x 100 X= ——____ m trong 46 V2 1a thé tich natri thiosunfat 0,1 N ding dé chudn d6 mau thi, tinh bang mililit; V, la thé tich natri thiosunfat 0,1 N ding dé chudn dé mau trang, tinh bang mililit; m_ la khéi lugng mau thi, tinh bang gam; 0,0023 1a lugng gam glyxerin tuong img 1 mi natri thiosunfat 0,1 N. 4.4.5.4 Téng ham luong chat hoat déng bé mat tan trong etanol Téng ham lugng chat hoat déng bé mat tan trong etanol (X), tinh bang phan tram khéi lugng (%) theo céng thttc sau: X = Xq- (Xe # Xs) trong dé X, la téng ham lugng chat tan trong etanol, tinh bang %; X, 1a ham lugng muéi natri clorua tan trong etanol, tinh bang %; Xj [a ham lugng glyxerin, tinh bang %. 4.4.6 86 chum cla phuong phap 4.4.6.1 86 lip lai Chénh léch tuyét d6i giéta hai két qua xc dinh song song tién hanh trén cling mét mau thit hac duge thyc hién lién tiép, do cing mét ngudi thao tac, sit dung ciing loai thiét bi, khéng vust qua 0,3 % chat hoat dong bé mat. 4.4.6.2. 96 tai lap Chénh léch tuyét déi gitta hai két qua thu dugc tn cing mét mau thit & hai phong thi nghiém, khéng vuot qua 0,5 % chat hoat dong bé mat.TCVN 6972 : 2001 4.5 Xac dinh d6 pH Theo TCVN 5456 - 91. 4.6 X4c dinh ham lugng asen va kim loai ning 4.6.1 Chudn bi dung dich thir Can khoang 10 g mau (chinh xac dén 0,01 g) vao binh tam gidc chiu nhiét dung tich 250 ml, Tham 10 mi axit sunfuric dic va dun nhe trén bép én, sau dé tang dan nhiét do dé mau chay thanh dung dich sanh mau nau den, é ngudi dung dich va thém dan ting giot khoang 5 ml axit nitric dae va tiép tuc dun s6i nhe dén khi dung dich trd thanh trong suét. Bé ngudi dung dich va trang thanh binh bang khoang 20 mi nude cat, thém 5 mi dung dich axit axetic 30 %, dun séi lai dung dich mét lan nifa. Dung dich trong binh trong suét, khéng mdu la dat. 88 nguéi chuyén dung dich vao inh dinh mic dung tich 100 ml, dinh mac dén vach va ldc ky. Dung dich nay ding dé. xéc dinh asen va kim loai nang. 4.6.2. Xac dinh ham lugng kim loai néing, tinh theo chi. 4.6.2.1 Nguyén tac Cac ion kim loai nang tao voi dung dich natri sunfua két tia mau den hay nau trong méi truéng axit axetic pH= 3,5 - 4. So sanh mdu cla dung dich mau véi mau cia dung dich chuén ch 4.6.2.2 Hoa chat va thuée thir: = axit sunfuric, d= 1,84; - axit clohidric, d = 1,19: - axit nitric, d = 14,3; ~ axit axetic, dung dich 30 % va (1 + 15); - natri sunfua, dung dich 2 %; - amoniac, dung dich 25 % va (1+ 2); ~ dung dich chi tiéu chun A,1 mg/ml, chudn bi theo TCVN1056 - 86; ~ dung dich chi tigu chudn B, 0,010 mg/ml, Idy 10 mi dung dich A cho vao binh dinh mite 1000 mi, dinh mic tdi vach bang nuéc va lac ky; ~ dung dich chi tiéu chun C, 0,0001 mg/ml, ly 10 ml dung dich 8 cho vao binh dinh mute 1000 ml, dinh mie tdi vach bang nuéc va lac ky; - Dung dich 8 va C chi pha truéc khi ding.TCVN 6972 : 2001 4.6.2.3 Dung cu: — 6ng so mau Nessler 50 mi; = binh dinh mic dung tich 100 ml, 1000 mi. 4.6.2.4 Cach tién hanh Hit 10 ml dung dich mau 6 4.6.1 vao éng so mau Nessler. Déng thai ly 20 mi dung dich tisu chugn chi C vao 6ng so mau khac. Trung hoa dung dich mau va dung dich tiéu chudn bang dung dich amoniac (1 + 2) theo chi thi phenolphtalein dén phot héng. Thém vao méi dng thir 1 mi axit axetic va 0,5 ml dung dich natri sunfua. Day nut va lac déu. Sau 1 phit so sanh mau clla 6ng dung dich tht! khéng duoc d4m mau hen dung dich cia éng so sanh. Khi so sénh mau phai nhin tir tren xuéng dudi, trén nén trang. 4.6.3. Xdc dinh ham lugng asen 4.6.3.1 Nguyén tac Lay 10 ml dung dich & 4.6.1 va xac dinh asen theo TCVN 3778 - 82 So sanh mau gidy cla mau véi mau gidy cia dung dich téu chug cé 0,001 mg As. 4.7. Xac dinh mite d@ kich tmg da Xem phu luc A. Chi thich - Pha loang dung dich can thir 10 lan bang nuéc cét trong qua trinh chudn bj mau thi. 4.8 Xac dinh gidi han vi khuan va ndm méc Xem phy luc B. 5 Bao cao két qua Bao cdo két qua gém cac théng tin sau: théng tin nhan biét day dui vé mau thir, = cae phugng phap sif dung (theo tiéu chuan nay); = cac két qua va cach biéu thi cac két qua; = cdc chi tiét cta moi thao tac khéng qui dinh trong tiéu chudn nay hoae cac tiéu chuan khac, hoc bat ky thao tac tuy y nao cing nhu cae su cé xdy ra anh hudng dén két qua. 10TCVN 6972: 2001 § Bao géi, ghi nhan, van chuyén va bao quan 6.1 Bao géi Nu6e g6i dau duge déng trong cac hép bang nhua, hoac chai thuy tinh hoc bang cdc vat theo thoa thuan nhung dam bo chéc chan, an toan. qui dinh hién hanh. 6.2 Ghinhan Trén méi chai hoac hOp nude g6i déu c6 nhan ghi: ~ tén hang hoa: ~ tén va dia chico sd san xudt; ~ thanh phan va ham luong nguy€n ligu chinh; - dung tich thye: — huéng dan str dung; ~_ Ngay san xudt va han sit dung, Trén mai thing céc tong c6 nhan ghi: ~ tén hang hoa; ~ {én va ham lugng cae nguyén jigu chinh; ~ ten va dia chico sé san xuat; - 86 lugng chai, hép; ~ _huéng dan bao quan (ky higu che mua nang); han str dung. 6.3. Van chuyén va bao quan Nuéc g6i dau duge van chuyén bang moi Phuong tién théng dung, nhung khéng duce xép chéng qua cao trénh gay 46 vd, bep bao bi san phém va Phai duge che mua nang. Bao quan nuéc 96i dau trong kho khé mat,TCVN 6972 : 2001 Phu luc A (Qui dinh) Phuong phap tht kich img trén da (Ap dung cho cdc san phdm dung trong y té va my phdm theo Quyét dinh 86 3113/1999/QD-BYT ngay 11 thang 10 nam 1999 cia BO trudng B6 Y té) AA Nguyén tac = Thirkich ting trén da ¥a-mét phuong phap sinh hoc dua vao.mttc d> phan (ing cia da thé véi chat thd so véi phn da ké bén khéng dap chat thir. Phép thir khéng 4p dung cho cac chat axit hode kigm manh (pH < 2 hoac pH > 11,5) va cdc chat a bit 1a c6 kich Ging tn da. A.2 Dung.cy thi nghiém = téng do dién toac mét thiét bi thich hop 4é lam sach lng thé; kéo, panh. A3 Déng vat va digu kign thi nghigm Sit dung thé trang truging than, duc hodc cai (khng sf dung thé c6 chia hoae dang cho con bi), kho’ manh, can nag khéng dudi 2 kg. Thd duge nhét riéng tling con va nudi dung trong diéu kién thi ngt it nhat 5 ngay truéc khi tht. Thi nghiém tién hanh trong nhiét do phong 25 °C +3 °C, dé dm tuang déi 30 % - 70 %, anh sang bao dam 12 gid tdi, 12 gid sang hang ngay. A.4 Chuan bi mau thir Mau thir duoc chudn bi tuy theo tinh chat va cach sif dung trén ngudi cla timg loai san pham. = Chat léng: ding truc tiép hoc pha loang voi dung méi thich hop. — Chat rén: cé thé ding truc tiép hoac tan thanh bot dm véi dung méi thich hop dé dam bao chat thi? dug tiép xtc tét vai da. — Véi cae chat ran khdc khéng thé tan thanh bét, cn xt ly hoa chiét xuat theo phuong phap riéng truéc khi st dung.TCVN 6972 : 2001 - Néu san pham cudi cling é dang vé tring, chat thi sé dugc tiét tring vdi cling digu kién nhu trong qui trinh san xuat, Chi y véi san phdm tiét tring bang etylen dioxit vi etylen dioxit va san phdm phan huy cla né cé thé gay kich tng. Can cé danh gia day aii nhiing phan tng ciia loai san phdm nay truéc va sau khi tiét tring, - Dung mdi ding dé pha lodng, lam dm hoac chiét xuat la céc chat phan cuc (nuéc, nude mudi sinh ly) ho&c khéng phan cye (dau thyc vat, ddu khoang) khéng gay kich Ung. A.5 Cach tién hanh A5.1 Chuan bi stic vat Trude ngay thi nghigm, lam sach léng thé & ving lung déu vé hai bén cot séng mét khoang da rong dé dat céc mau thit va d6i chimg (khoaing 10 cm x 15 cm). Chi nhiing thé cé da khog manh, déng déu va lanh lin méi duge ding vao thi nghiém. A5.2. Dat mau thir Méi mau duge thir trén 3 thd. Ligu chat thir tren méi thd 1a 0,5 g hodc 0,5 mi. Dat mau thi da chudn bi 6 trén lén miéng gac khéng gay kich ting 2,5 om x 2,5 om c6 6 day thich hop réi dap én da. C6 dinh ming gac bang bang dinh khong gay kich Ung it nhat trong 4 gid. Sau dé bd gac va bang dinh, chat thir cdn lai duge lam sach bang dung mdi thich hgp khéng gay kich tng. Trong truéng hgp mau thir da duge pha loang hoac lam 2m bang dung mdi, tién hanh song song d&t mau déi ching la dung méi da ding 6 ché da bén canh. So dé dat mau thir c6 thé bé tri theo hinh A.1. Huéng dau tho Biém dat mu thir | Diém dat mau ther Diém dat mau déi ching | Dim dat mau déi ching Hinh A.1 - So dé dat mau therTCVN 6972 : 2001 A. Quan sat va ghi Quan sat va ghi dim phan tng trén ché da dat chat thi so véi da ké bén khéng dat chat thir 6 cde thai diém 1 gid, 24 gid, 48 gid va 72 gid sau khi lam sach mau thit. C6 thé kéo dai hon thdi gian quan sat khi cé tén thuong sau dé co thé danh gia day du hon vé kha nang héi phuc hoa khong héi phuc cla vét thueng nhung khéng nén qua 14 ngay. anh gia phan ting trén da 4 cac mc d6 gay ban dé, phi né theo qui dinh 6 bang A.1. Bang A.1 - Mufc dé phan tng trén da thd | Phan tmg piém danh gid Su tao vay va ben dd = Khéng ban 46 0 = Ban dé rat nhe (vita di nhan thay) : 4 — Ban dé nhan thay 13 2 = Ban dé vita phai dén nang | 3 — Ban 48 nghiém trong (dé t4y) dén tao thanh vay dé ngan ngtia | 4 sy tién trién cla ban dd ] Gay phi né = Khéng phi né 0 | Phu né rt nhe (vita di nhan thay) 1 — Phu né nhan thay ré (vién phi né phéng Ién 16) .2 Pha né vita phal (da phéng én khoang 1 mm) 3 = Phi né nghiém trong (da phéng [én trén 1 mm va cé lan réng 4 | ra ving xung quanh) | Téng sé diém kich img t6i da co thé | 8 Nhiing thay déi khac trén da can theo dai va ghi chép day du. A7 Danh gia két qua Trén mai thd, diém phan ting dude tinh bang téng s6 diém d hai mitc d6 ban dé va phil né chia cho sé lan quan sat. Diém kich (ng cia mau thir duge lay trung binh diém phan (mg ciia cdc tho da thu. 14TCVN 6972 : 2001 Trong truéng hgp c6 ding mau déi ching, diém phan tmg cla mau thit duge tri di sé diém cla mau di ching. ‘ Chi sit dung cae diém & nhing thdi gian quan sat 4 24 gid, 48 gid va 72 gid dé tinh két qua. Déi chiéu diém kich tmg voi cdc mite 46 qui dinh trén bang A.2 48 xac dinh kha nang gay kich dng trén da thé cla mau thi. Bang A.2 - Phan loai cac phan tmg thir trén da tho [ Loai phan ung Diém trung binh Kich tng khéng dang ké Tir 0 dén 0,5 Kich émg nhe lan hon 0,5 dén 2 Kich tng via phai lén hon 2,0 dén 5,0 Kich dng nghiém trong 16n hon 5,0 dén 8,0 A.B Bao cdo két qua Bao cdo kat qua cdn ghi day dU cdc théng tin vé mau thi, stic vat thi (loai, sé lugng). Ghi chi tiét cach chuan bi mau thit va cdch dat mau trén da, dlém cla cdc ldn quan sat, nhiing nhan xét thém néu cé va danh gia két qua. Chi thich: = Banh gid mite 49 kich ting trén da khéng nén chi dya vao sé dlém kich Gng ma con can ct vao nhimg mé ta sy thay di tinh trang da da quan sat dug. éc két ludn mau thir dat chat lugng vé chi tiéu kich (mg da hay khéng phat phy thudc vao yeu cu riéng cia timg san phdm. 15TCVN 6972 : 2001 Phy luc B (Qui dinh) Tigu chun gidi han vi khudn, nam méc trong my pham (Ap dung cho cac san phdm ding trong y té va my pham theo Quyét dinh 86 3113/ 1999/ QD-BYT ngay 11 thang 10 nam 1999 cia B6 trudng B6 Y té) Tiéu chudn gidi han vi khuan, ndm méc trong my pham la van ban qui dinh vé sé lugng tdi da vi khudn, ndm méc khéng dude vust qua trong my pham va phuong phap thi dé xac dinh vi khuan, ndm méc trong my phadm. B.1_ Gidi han vi khuan va nam méc B.1.1. Trong my phdm, khéng duge 06 cc vi khudn sau: - Staphylococcus aureus; - Candida albicans; - Pseudomonas aeruginosa. B.1.2 Téng sé vi khudn hiéu khi séng lai duge khéng duge lén hon 1000/1 g hoac 1 mi san pham. B.1.3 Téng sé ndm méc séng lai duge khéng duge lén hon 100/1 g hoae 1 mi san phdm. B.1.4 Sé lugng Enterobacteria va cac vi khudn Gram am khac khéng duge Ién hon 10/1 g hode 1 ml san phém. B.2 Phuong phap thir 8.2.1. Lay mu va chudn bi mau thi nghiém 8.2.1.1 Lay mau Theo tigu chudn ly mau kiém nghiém, mét mau dem thir phal lam it nhat trén 3 don vi dong géi nhé nhat. 16B.2.1.2. Pha ché mau thir nghiém TCVN 6972 : 2001 Tuy theo ting sn phdm, lay mét lugng sn pham dai dién ti cdc don vj déng géi (khoang tur 40 - 50 g hoac 10 - 50 mi san phdm) vao binh nén, thém dung mdi pha loang thich hop dé pha Jong san phdm thanh cdc néng dé dem thtt nghiém thich hgp nhu: 10"; 107; 10° hoa 1/2; 1/5; 1/20; 1/40 v. v... sa0 cho khi dém khudn lac trén dia Petri co dudng kinh 90 - 100 mm, sé lugng khuan lac khéng vugt qua 300 trong mét dia. 8.2.2 Thiét bi, dung cu Thit nghiém duge tién hanh trong cdc dléu kién v6 triing, dam bao khéng 06 su lay nhiém cac vi khuan tif ngoal vao mau thit. Cac phuang tién va dung cu can ding gdm: hép Petri thuy tinh c6 dudng kinh 90 - 100 mm; pipet chia vach cé thé tich 1; 5 va 10 ml; binh nén dung tich 100; 250 va 500 ml; ng nghiém cac loai 16 - 160 mm, 18 - 200 mm; néi cach thuy én dinh duge nhiét dé trong khodng 35 - 45 °C; t 4m diéu chinh nhiét d6 32°C + 1° C; td say; néi hap tiét tring; may do pH. B.2.3 Hoa chat, thudc thir thach ding cho vi sinh vat; pepton ding cho vi sinh vat; natri clorid tinh khiét (NaC! glucose tinh khiét; dinatri hydrophotsphat tinh khiét; natri dihydrophotsphat ; kali Dihydrophotsphat tinh khiét; dikali hydrophotsphat tinh khiét ; acid lactic: dung dich 20 % hoac 30 %; acid citric : dung dich 20 %; natri hydroxit tinh khigt (NaOH); dung dich natri hydroxit 0,1 N: 7TCVN 6972 : 2001 n-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid; magnesi clorid; cetrimid (Cetyl trimethyl amoni bromid); magnesi sulfat ngam nuéc; — glycerin; - tween 80; = dé trung tinh; — tim tinh thé; - xanh Brilliant. B.2.4 Méi truéng B.2.4.1 Cac méi trudng ding dé pha loang, dém cac vi khuan, ndém méc B.2.4.1.1 Nuéc Pepton Pepton 1g Natri clorid 859 Nuéc cat 1000 mi B.2.4.1.2 Nuée mudi sinh ly ‘ Natri clorid 8,59 Nuéc cat 1000 mi .3 MGi trudng thach Saboruaud Pepton 109 Glucose 409 Thach 15-209 Nuée cat 1000 mi pH sau khi tiét tring: 5,6 6 0,2 : Cach pha: Hoa tan cac chat trong nuéc, dun nhé lia, khudy déu cho tan hoan toan. Dong vao cac binh dung tich 250 mi, binh 150 mi. Hp tiét tring trong néi hdp 110° C trong théi gian 15 - 20 phut. Méi trudng cé thé bao quan 4° C va sit dung trong vong 30 ngay. 18B.2.4.1.4 Méi trudng thach thudng Pepton Natri clorid Thach Nude cat pH sau khi hdp tiét tring TCVN 6972 : 2001 109 5g 15-209 1000 mi 74-76 B.2.4.2 Cac méi trudng ding dé phan lap vi khudn, ndm méc B.2.4.2.1 Méi trudng thach Cetrimid Gelatin pancreatic Magnegi clorid Glycerin Cetrimid Thach Nuéc cat 13,69 1000 mt Cch pha: Hoa tan tat c& cdc chat ran trong nuéc, thém glycerin. Bun néng, khudy déu; dun sé! 4 phat cho tan hoan toan. pH sau khi tigt tring 7,2 + 0,2. B.2.4.2.2. Mdi trudng thach dé phat hién Fluorescin cia Pseudomonas Casein pancreatic Pepton Dikali hydrophotsphat khan Magnesi sulfat ngam nude Thach Glycerin Nuéc cat 10,09 10,09 159 159 15,0g 10,09 1000 mi Cach pha: Hoa tan tat ca cdc chat ran trong nude, thém glycerin. Dun néng, khudy déu; dun sél 1 phat cho tan hoan toan. pH sau khi tiét tring 7,2 + 0,2.TCVN 6972 : 2001 B.2.4.2.3 Méi truéng thach dé phat hién Pyocyanin cia Pseudomonas Gelatin pancreatic Magnesi clorid khan Kali sunfat khan Thach Glycerin Nuéc cat 20,09 149 100g 15,09 10,0 ml 1000 mi. Cach pha: Hoa tan tat cd cdc chat ran trong nude, thém glycerin. Dun néng, khudy déu, dun sél 1 phit cho tan hoan toan. pH sau khi tiét tring la 7,2 + 0,2. B.2.4.2.4 Mi truéng RAT Bat gao Tween 80 Thach Nuc cat pH sau khi tiét tring 15.09 10 ml 13,59 1000 mi 4,5-5,5 B.2.4.2.5 Mél truéng thach mudi mat cé lactose va glucose, chi thi tim tinh thé, do trung tinh Cao men bia Gelatin pancreatic Mui mat Lactose Natri clorid D-glucose monohydrat Thach 6 trung tinh Tim tinh thé Nuéc cat Diéu chinh pH sao cho sau khi dun a 7,4 + 0,2. Dun tdi s 20 3,99 7.09 1,59 10,09 5,09 10,09 : 15,09 30 mg 2mg 1000 mi nhung khéng dun trong néi hap.TCVN 6972 : 2001 B.2.4.2.6 Canh thang lam gidu Enterobacteriacease - Mossel Gelatin pancreatic 10g D-glucose monohydrat 50g Mat bo khé 20,09 Kali dihydrophosphat 2.09 , Di natri hydrophosphat 8,09 Xanh Briliant 15,0 mg Nuéc cat 4000 mi Biéu chinh pH sao cho sau khi dun la 7,2 + 0,2. Dun & 100°C trong 30 phtt va .am lanh ngay. B.2.4.2.7 Méi trudng thach Manitol-mudi Casein pancreatic 5,09 Pepton 5,09 Cao thit 1,09 . Natri clorid 75,09 D-manitol 10,09 8 phenol 25mg Thach 15,09 CAch pha: Trén, dun néng, khudy déu, sau d6 dun séi 1 phit dé hoa tan hoan toan. pH sau khi tiét tring: 7,4 + 0,2. C.2.4.2.8 Méi trudng lang Casein dau tuong Casein pancreatic 059 Bot dau tuong (thuy phan bdi papain) 30g Natri clorua 509 Dikali hydrophosphat 259 Glucosa 2.59 Nuée cat 4000 mi C&ch pha: Hoa tan cae chat ran vao nuéc, dun néng nhe cho tan hoan toan. Dé ngudi dung dich 6 nhiét d6 phéng, phan chia vao cac binh thich hgp, dem tiét tring, pH sau khi tiét tring 7,3 + 0,2. 2TCVN 6972 : 2001 8.2.5 Tién hanh nuél cy, xéc dinh va phan lap B.2.5.1 Bém téng sé vi khudn hiéu khi, ndm méc séng lai duge 8.2.5.1.1_ Pha loang san phdm: tién hanh theo diéu 2.1.2. . B.2.5.1.2 Cay truyén Trude tién cay kim tra pipet trén mot dia méi tru’ng phat hign vi khudn va mét dia mai truang ném méc. Dung pipet v6 tring cay vao méi hp Petri 1 ml sn phdm da pha loang, d6 pha loang cay vao 2 h6p a8 xde inh s6 lugng vi khudn hiéu khi séng lai duge va 2 hop dB xdc dinh sé lugng ném méc séng lai duge. C.2.5.1.3 6 dia Dun néng chay hoan toan cac loai méi trudng ding dé dém vi khudn, ném méc,,dé nguéi dén 48°C, rét vao cac hdp Petri (44 cay sn trong méi hép 1 ml ciia mét d6 pha loang cla san phdm) méi h6p 15 - 20 ml méi trudng; tron déu sn phdm da Pha lodng véi méi truéng bang cach xoay hop Petri qua phai va qua trai méi chiéu 2 - 3 ldn. B8 dia thach dong ty nhién trén mat phéng ngang. Thudng ding mdi truéng thach thuéng dé dém vi khudn hidu khi, Thuéng dung méi truéng Sabouraud dé dém n&m méc. B.2.5.1.4 Udm Sau khi cae dia thach da déng ty nhién & nhiét d6 phang, lat ngugc dia thach va dem &. Nhiing dia thach ding dé dém vi khuan dugc u & 32 - 35 °C, dém khuan lac moc trén dia sau khi & 48 - 72 gid. Nhiing dia thach ding dé dém ndm méc 6 256 2°C, dém khudn lac moc trén dia sau khi & tir 3-5 ngay. B.2.5.1.5 Tinh két qua 6 lugng vi khudn hiéu khi, ném méc séng lai duge ¢6 trong 1 g ho&e 1 mi sén phém duge tinh theo céng thite sau: 22TCVN 6972 : 2001 trong d6: . M [a sé lugng vi khudn, nam méc séng lai dude c6 trong 1g hoac 1 ml san phdm; © la téng sé khudn lac dém dude 6 cdc dia Petri cling mét d6 pha loang; 1 [a'sd dia trong mét dé pha loang; d_ a d6 pha loang; N la s6 dé pha long (thi dy dém hai dé pha loang 10' va 10? : N loang 2,5 va 10 thiN = 3 vv...). dém & nhiing 46 pha B. .2. Phan lap vi khudn B.2.5.2.1 Tim Staphylococcus aureus Cho ché pham vao 100 ml méi trudng léng casein dau tung, & 4m 35°C trong khoang 24 - 48 gid, Quan sat mél trudng, néu thay vi khudn moc, ding que cdy léy mot quai cay, cdy lén mot dia thach Mannitol- mudi. Day dia, lat ngugc hép Petri, dem & dm & 35°C trong 24 gid. Sau khi & 4m, kiém tra néu thay: Trén dia thach Mannitol- muéi_ cé thay nhing khudn lac mau vang cing véi mét ving mau vang xung quanh, ding que cay lay khuan lac dlén hinh, dem nhuém Gram, soi kinh thay tu cdu khuan hinh chim nho, bat mau gram dung, duéng kinh khodng 0,8 - ium; tiép tuc lam cdc phan tng sinh vat hoa hoc cla Staphylococcus aureus. Chuyén mét lac khugn nghi ngé dac trung vao éng nghiém nhé, sach vé tring, thém vao dng 0,5 ml huyét tuong thd. Dem u 4m cach thuy 37°C; sau 3 gid G dm, kiém tra cac Sng thi, tip tuc & 4m thém 24 gid. Néu thay c6 hién tugng dong huyét tuong 6 bat ky mie d6 nao- san phdm cé Staphylococcus aureus. - B.2.5.2.2 Tim Pseudomonas aeruginosa Cho ché phdm vao 100 mi mél trudng Iéng casein dau tuong, U 4m 6 35°C trong 24 - 48 gid. Quan sat méi trudng, néu thay vi khan moc, diing ding que cy Idy mét quai cdy, cdy lén mét dia thach Cetrimid. day dia, lat ngugc hdp Petri va dem u 4m 4 35°C trong 24 gid. sau khi d dm, kiém tra néu thay: ‘Trén méi truéng thach Cetrimid cé khudn lac mau luc nhat, cé anh huynh quang mau luc, thi ly khudn lac, nhuém gram va soi kinh. Néu thay tryc khuan Gram am va phan tng oxydaza duong tinh thi tiép tuc cy truyén trén mat mdi truéng thach Pseudomonas dé phat hién fluorescin va mél truéng thach Pseudomonas dé phat hién pyocyamin trong hp Petri. Day va [at nguoc hop méi trudng da cay truyén, dem u 4m 4 35 + 2°C trong it nhat 3 ngay, dem kiém tra cac dia thach dudi anh dén tir ngoai, néy thay: 23TCVN 6972 : 2001 ‘Trén dia thach Pseudomonas dé phat hién fluorescin cé khuan lac khéng mau dén mau vang, co huynh quang hei vang. Trén dia thach Pseudomonas dé phat hién pyocyamin cé khuén lac mau vang nhat, cé huynh quang mau xanh nuéc bién. Tiép tuc nhuém gram, soi kinh va lam phan ing oxydaza thay tryc khudn gram 4m, phan ing oxydaza duong tinh, c6 thé két luan cé Pseudomonas aeruginosa.Néu chua chac chan co thé tiép tuc kiém tra bang cdc phép thir sinh hoa khac. Tht phan Ung oxydaza: Chuyén khudn lac vao mau gidy da tam truéc N-dimethy! phenylen diamin dihydrociorid, néu thay hién mau dé héng, chuyén sang mau tim: phan dng oxydaza dugng tinh. B.2.5.2.3 Enterobacteriaceae va cac vi khuén gam am khac Lam déng nhat ché phdm dem kiém tra bang cach xif ly mét lung thich hgp nhu da mé ta 6 trén va U m 6 35 - 37°C trong mét thdi gian thich hgp dé phuc hdi lai vi khuan, nhung khéng phal lam tang vi khudn (thudng tir 2 - 5 h). Lac binh’ chita va chuyén mot lugng ché phdm da déng nhat tuong duong véi khodng 1g hodc 1 mi ché phm vao 100 mi méi truéng canh thang lam gidu Enterobacteriaceae - Mosel va & 4m 6 35 - 37 °C trong 18 - 24 h.C4y lén dia thach muéi mat c6 lactose, glucose, chi thi tim tinh thé va d@ trung tinh, dam 6 35 - 37°C trong 18 - 48 h. Ché phém khéng cé Enterobacteriaceae néu khéng thay moc nhiing khuan lac vi khudn gram am trén thach dia. Banh gia s6 luang: U am mét lugng thich hgp méi truéng canh thang lam gidu Enterobacteriaceae ~ Mosel véi nhiinglugng ché phdm dem kiém tra da duge lam giau déng nhat chita 1,0 g; 0,1 g; va 0,01 g hodc 1,0 ml; 0,1 mi va 0,01 m. Ché pham cé thé duge pha lodng khi can. & dn 6 35°- 37°C trong 24 dén 48 gid. Su moc cla cdc khuan lac da phat trign tét thudng dé hoac dia dé, vi khuan gram am ching t6 két qua duong tinh. Ghi lygng nhé nhat cla ché phdm ma 4 dé cho két qua dutong tinh va lugng Ién nhdt cla ché phdm ma d a6 cho két qua m tinh, Xdc dinh theo bang sau 6 luong Bacteria, Bang B.1- Tinh lugng Bacteria trong ché pham Két qua déi véi méi lugng san pham | $6 bacteria cé trong 1,0. g hoac 1,0 ml | 0,1 g hodc 0,1 mi | 0,04 g hoac 0,01 mi 119 san phim + + + Lén hon 10? | + + - ft hon 10 ? nhung lén hon 10 + - a it hon 10 nhung !én hon 1 e - I - | fthon 1 24TCVN 6972 : 2001 B.2.5.2.4 Tim Candida albicans Tién hanh trén mél truéng thach Sabouraud. Vao cudi giai doan & 4m, kiém tra bang kinh hién vi xem cé ndm moc hay khéng. Kiém tra su co Khun lac nghi ngd Candida albicans. Lay khudn lac.dlén hinh dem nhudm gram, soi kinl Candida albicans cé hinh tron, bau duc dudng kinh 6 - 9 um, bat mau gram duong. Thi nghiém mam gid dau: Lay mét giot huyén dich nam da nuél cy sau 24 h vao 6ng nghiém nhé cé chita 1 mi huyét thanh thé, U 4m 6 37°C trong 3 h, sau dé lay ra soi giifa ban va ld kinh, Néu la n&ém Candida albicans thi gan nhu toan bé sé té bao sé ndy mam giéng nhw hinh - gid dau. Tim té bao vach day: Cho méi trudng RAT lén ban kinh vé khuan, nhé vao mét giot huyén dich nm, day Id kinh, doc két qua sau 24 - 48 gid d 4m 4 30°C.TCVN 6972 : 2001 a] (2) 26 Tiéu chuan gidi han vi khudn, ném méc va phuong phap thi clla bd Y Té quy dinh cho my pham sé 3113/1999/Q8-BYT ngay 11/10/1999. : Tiéu chudn 46 kich img da va phuong phép thi ciia b6 Y Té quy dinh cho my phdm sé 3113/1999/QD-BYT ngay 11/10/1999.