Professional Documents
Culture Documents
Tống Khánh Linh-B1203579
Tống Khánh Linh-B1203579
Tống Khánh Linh-B1203579
----------------
2015
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA HỌC
----------------
2015
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ Môn Hóa Học
Lê Thị Bạch
i
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ Môn Hóa Học
ii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
LỜI CẢM ƠN
iii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết
quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng
cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.
iv
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
TÓM TẮT
Từ khóa: Psidium guajava L., DPPH, kháng oxy hóa, kháng khuẩn.
v
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
MỤC LỤC
vi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
vii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
viii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Bảng 3.1: Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ....................... 34
Bảng 3.2: Dãy nồng độ, thể tích Vitamin C ............................................ 42
Bảng 3.3: Dãy nồng độ, thể tích cao Et ................................................... 43
Bảng 3.4: Dãy nồng độ, thể tích cao Hex ................................................ 43
Bảng 3.5: Dãy nồng độ, thể tích cao C .................................................... 43
Bảng 3.6: Dãy nồng độ, thể tích cao Ea và cao Nước ............................. 44
Bảng 3.7: Môi trường LB ........................................................................ 45
Bảng 4.1: Kết quả đặc điểm, khối lượng, hiệu suất của các cao ............. 47
Bảng 4.2: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Ethanol
tổng ..................................................................................................... 47
Bảng 4.3: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Hexane
............................................................................................................ 48
Bảng 4.4: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao
Chloroform ......................................................................................... 49
Bảng 4.5: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Ethyl
acetate ................................................................................................. 50
Bảng 4.6: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Ethyl
acetate ................................................................................................. 50
Bảng 4.7: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của Vitamin C . 51
Bảng 4.8: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Et ........ 52
Bảng 4.9: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Hex ..... 53
Bảng 4.10: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao C ....... 54
Bảng 4.11: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Ea ..... 55
Bảng 4.12: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Nước 56
Bảng 4.13: Hoạt tính kháng E. coli ở các nồng độ khác nhau của các cao
............................................................................................................ 59
Bảng 4.14: Hoạt tính kháng S. aureus ở các nồng độ khác nhau của các
cao ...................................................................................................... 60
Bảng 5.1: Giá trị MIC của từng cao ........................................................ 62
ix
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
x
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.5: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao C .................. 55
Hình 4.6: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Ea ................ 56
Hình 4.7: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Nước ............ 57
Hình 4.8: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của Vitamin C với các cao .............. 57
Hình 4.9: Khả năng kháng E. coli và S. aureus của methanol .................... 58
xi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
xii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với hệ thực vật
phong phú và đa dạng. Có khoảng 3200 loài được sử dụng trong y học dân
tộc vì các hợp chất trong cây có khả năng trị bệnh mang lại hiệu quả cao,
không gây tác dụng phụ.
Cây Ổi có tên khoa học Psidium guajava L. là loài cây ăn quả mọc
hoang khắp nơi và thường được người dân trồng để lấy quả bán. Người Ấn
Độ có câu “Vài trái Ổi trong mùa sẽ không cần gặp bác sĩ nguyên năm”.
Đúng vậy, theo học cổ truyền nước ta cây Ổi được sử dụng để chữa bệnh
tiêu chảy, ho, cảm và các bệnh về da,... Theo nghiên cứu hóa thực vật trong
Ổi chứa beta-sitosterol, quercetin, guaijaverin, leucocyanidin và
avicularin,... Các hợp chất này đều có tính kháng khuẩn, làm se niêm mạc
và cầm đi lỏng; đặc biệt Quercetin là một chất chống oxy hóa mạnh, có khả
năng điều chỉnh sự biểu hiện enzyme, giúp giảm các triệu chứng của bệnh
tiểu đường, cải thiện chức năng phổi, giảm nguy cơ mắc các bệnh đường hô
hấp, giảm huyết áp, giảm nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt, buồng trứng, dạ
dày, ung thư vú và tế bào ruột.
Hiện nay trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về
cây Ổi trong ngành công nghiệp thực phẩm, về tinh dầu và lá trưởng thành
nhưng chưa đi sâu tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
lá Ổi non trong cao chiết.
Nhận thấy cây Ổi có chứa nhiều hợp chất quý có khả năng trị được
nhiều bệnh, lá non là bộ phận vừa mới sinh trưởng, sức sống tốt, nhiều tiềm
năng. Do đó, đề tài “ Khảo sát định tính thành phần hóa học, hoạt tính
kháng oxy hóa, kháng khuẩn của các cao chiết lá Ổi non (Psidium guajava
L.) được thực hiện nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chúng trong
y học hiện đại.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài là bước đầu tìm hiểu sơ bộ thành phần hóa học cũng như hoạt
tính sinh học của lá Ổi non với các mục tiêu sau:
+ Định tính các nhóm hợp chất có trong lá Ổi non.
+ Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của các cao
chiết.
+ Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết.
1
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
2
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây Ổi
2.1.1 Giới thiệu về họ Myrtaceae [1,2]
Họ Myrtaceae còn gọi là họ Sim hay họ Đào Kim Nương, là họ thực
vật hai lá mầm được đặt trong bộ Myrtales. Họ này là một họ lớn chứa từ
130-150 chi với khoảng 3000 loài. Chúng phân bố chủ yếu ở các khu vực
trong vùng nhiệt đới và Australia. Ở Việt Nam đến nay đã biết họ Myrtaeae
có khoảng 15 chi với 108 loài và 2 thứ. Trong đó có 16 loài đặc thù.
Các loài trong họ Myrtaceae thường là cây thân gỗ, chứa tinh dầu.
Một trong những đặc trưng nổi bật cúa họ này là li be nằm cả hai bên của
xylem (chất gỗ). Cành non thường vuông. Lá cúa chúng thuộc loại thường
xanh, mọc so le hay mọc đối, lá đơn và mép lá nhẵn. Hoa lưỡng tính, mọc
thành cụm từ 4-5 hoa đơn, các thùy đài xếp lợp, luôn có cánh hoa, nhị nhiều
rời hoặc có khi mọc thành nhóm có màu sáng và đối diện với cánh hoa,
không có triền, bầu có khi nhiều ô.
1 1 2 3
3
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Tên đồng nghĩa: Psidium guajava var pyriferum L., Psidium guajava
var pomiferum L..
Tên gọi khác: phan thạch lựu, thu quả, kê thi quả, phan nhẫm, bạt tử,
lãm bạt,...
Tên nước ngoài: Commom guava (Anh), goyavier hoặc goyave
(Pháp), guayabo (Tây Ban Nha), guave hoặc goejaba (Hà Lan), goiaba hoặc
goaibeira (Bồ Đào Nha).
4
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
5
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
6
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Trạng thái vật lý: là chất bột màu trắng, chất sáp có mùi đặc trưng.
Nhiệt độ nóng chảy: 136-140OC
Khả năng hòa tan: thuộc nhóm kỵ nước, tan tốt trong rượu.
Flavonoid
Quercetin
Công thức phân tử: C15H10O7
Khối lượng phân tử: 302,236 g/mol
Công thức cấu tạo:
7
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Guajaverin
Công thức phân tử: C20H18O11
Khối lượng phân tử: 434,35g/mol
Công thức cấu tạo:
8
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
chặn các ion calcium và ức chế các enzyme liên hệ đến sự tổng hợp
prostaglandins giúp giảm những cơn đau bụng do cơ trơn của ruột co thắt.
Ngoài ra lá Ổi còn tác động vào sự tái hấp thu nước nơi ruột. Các
lectins trong lá Ổi có thể gắn vào E.Coli ngăn chặn vi khuẩn hấp thu vào
vách trong của ruột và do đó ngăn ngừa được sự nhiễm trùng ruột.
Tác dụng kháng sinh, kháng siêu vi và diệt nấm gây bệnh
Dịch chiết từ lá và vỏ thân có tác dụng sát trùng trên các vi khuẩn như
Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E.coli, Clostridium và
Pseudomonas.
Dịch chiết từ lá bằng nước muối 1: 40 có tác dụng diệt trùng trên
Staphylococcus aureus.
Nước ép tươi từ lá ở nồng độ 66% có hoạt tính diệt siêu vi Tobacco
mosaic.
Nước chiết từ lá ngăn chặn sự tăng trưởng của các nấm Trichophyton
rubrum, T.mentagrophytes và Microsporum gypseum.
Tác dụng trên hệ tim mạch
Nghiên cứu của Đại học Universidade Federal de Sergipe, Sao
Cristovao (Ba Tây) ghi nhận dịch chiết từ lá Ổi có nhiều hoạt tính trên tim
mạch và có thể dùng để trị các trường hợp tim loạn nhịp.
Ổi có tác dụng kháng oxy hóa có lợi cho tim, bảo vệ tim và cải thiện
cải thiện các chức năng của tim.
Tác dụng hạ đường trong máu
Nghiên cứu tại Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology, Daejeon (Nam Triều Tiên) ghi nhận hoạt tính ức chế men
protein tyrosine phosphatase 1B của dịch chiết từ lá Ổi có tác dụng trị tiểu
đường loại 2.
Nghiên cứu tại Taiwan trên chuột cho thấy nước ép từ quả tươi chích
qua màng phúc toan với liều 1,0g/kg giúp làm hạ đường trong máu tạo ra
bởi alloxan.
Theo Y học dân gian
Ổi có vị chát, hơi ngọt, tính bình. Các bộ phận dùng làm thuốc gồm
búp non, lá non, quả, vỏ rễ và vỏ thân. Ổi có tác dụng thu liễu (làm săn
da), cầm tiêu chảy, chống sưng tấy và cầm máu nên được dùng để điều trị
9
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
chứng đau bụng, tiêu chảy do tiêu hóa yếu, sưng ruột, kiết lỵ do nhiễm
trùng. Ngoài ra, Ổi còn được dùng để trị chấn thương, ngứa ngoài da.
2.1.2.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước [6,9,10-16]
Trong nước:
Theo Đỗ Huy Bích (2008), đã có một số ứng dụng lá Ổi vào việc điều
trị trong y học dân tộc như:
- Nước sắc lá Ổi 1/1 – 2/1 được dùng rửa đắp vết thương phần mềm,
làm sạch mủ, mất mùi hôi.
- Cao đặc lá Ổi với tỷ lệ 6/1 – 10/1 bôi lên các vết bỏng độ II, III có
tác dụng nhanh chóng tạo màng che phủ, làm se khô vết thương. Thời gian
bong màng thuốc và khỏi cũng tương tự như các thuốc chữa bỏng tạo màng
thuốc thường dùng khác.
- Chữa tiêu chảy:
Búp Ổi 12g, vỏ thân Ổi 8 (g), tô mộc 8 (g), gừng 2 (g). Sắc uống
ngày 1 tháng
Búp Ổi 20 (g), gừng sống 8 (g). Băm nhỏ, sắc uống ngày 2 lần
trong ngày.
Lá Ổi 20 (g) , vỏ quả bòng khô 20 (g), lá trà tươi 10 (g), gừng tươi
2 lát. Sắc uống trong ngày.
Đái Thị Xuân Trang và cộng sự (2012) đã khảo sát hoạt động kháng
lại sự tăng đường huyết sau bữa ăn in vivo và intro của cao chiết lá Ổi. Kết
quả nghiên cứu này cho thấy các hợp chất trong lá Ổi có khả năng ức chế
enzyme -amylase và -glucosidase in vitro một cách có ý nghĩa. Kế đến
các con chuột được gây bệnh alloxan monohydrate và nhóm chuột bình
thường được thử nghiệm bằng cao lá Ổi chiết suất bằng ethanol với liều 400
mg/kg trọng lượng cơ thể. Các tác giả đã nhận thấy rằng cao lá Ổi có thể
kiểm soát tình trạng tăng đường huyết sau bữa ăn ở chuột bệnh tiểu đường.
Từ các kết quả được trình bày ở trên cho thấy lá Ổi có thề được sử dụng để
kiểm soát bệnh tiểu đường.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hạnh Dung tại trường Đại học Cần Thơ
cho thấy cao thô methanol của lá trưởng thành cây Ổi có tác dụng kháng
khuẩn rộng ức chế đươc các chủng vi khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu
bao gổm: Staphylococcus aureus (128 μg/ml), Streptococcus faecalis (256
μg/ml), Aeromonas hydrophilla (256 μg/ml), Salmonella spp. (2048 μg/ml),
10
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
11
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
albicans. Theo các tác giả này, tinh dầu Ổi có khả năng tác động vào màng
tế bào vi sinh vật, làm cho màng tế bào thấm nhiều hơn hoạt chất kháng
khuẩn. Một số công trình nghiên cứu khác cũng cho thấy tinh dầu Ổi có
tính đề kháng mạnh mẽ chống lại Yarrowia lipolytica (nấm men gây bệnh),
ngoài ra chúng còn có khả năng chống lại Staphylococcus aureus,
Salmonella và Escherichia coli được phân lập từ tôm.
Gần đây, tinh dầu Ổi được chứng minh có tác dụng ức chế, chống lại
vi khuẩn Bacillus cereus, Enterobactor aerogenes và Pseudomonas
fluorescens.
Theo Yoriko Deguchi và Kouji Miyazaki(2010), lá Ổi có khả năng
chống lại các vi sinh vật kể trên là do chứa nhiều flavonoid, đặc biệt là
quercetin. Phần lớn hoạt tính sinh học của lá Ổi là do quercetin có hoạt tính
kháng khuẩn cao.
Adeyemi và cộng sự (2009), đã nhận thấy trong dịch chiết từ lá Ổi có
chứa các flavonoid, tanin, saponin, các steroid, và terpenoid. Các tác giả
này đã tiến hành thử nghiệm trên chuột và kết quả cho thấy ký sinh trùng
trong máu của chúng giảm đi khi sử dụng chất chiết xuất từ lá Ổi. Nghiên
cứu này cũng đã chứng minh khả năng làm tăng tuổi thọ của tất cả các con
chuột bị nhiễm bệnh khi được điều trị với dịch chiết từ lá Ổi. Thời gian
sống của chuột được kéo dài hơn từ 30 ngày đến 32 ngày so với chuột sau
khi bị nhiễm ký sinh trùng mà không dùng dịch chiết từ lá Ổi, chúng bị chết
chỉ sau 8 ngày.
Tác dụng chống oxy hoá
Witayapan và cộng sự (2010) đã cho thấy khả năng chống oxy hóa của
các hợp chất phenol trong lá Ổi non cao gấp 1,88 và 8,72 lần so với các chất
chống oxy hóa tổng hợp butylated hydroxy toluene (BHT) và 1,75 lần cao
hơn so với vitamin E.
Theo Qian và Nihorimbere (2004) các chất chiết xuất từ lá Ổi có tính
chất chống oxy hóa bằng cách trung hòa các gốc tự do. Hầu hết hoạt tính
này đều có liên quan đến các polyphenol và flavonoid, tuy nhiên các chất
chiết xuất từ lá Ổi cũng chứa một số chất chống oxy hóa khác như acid
ascorbic và carotenoids.
Các nhà khoa học Thái Lan (Witayapan và Songwut Yotsawimonwat,
2010) đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxy hóa của
các hợp chất phenol chiết xuất từ lá Ổi. Các tác giả này đã chỉ ra rằng quá
trình tiền xử lý mẫu lá trước khi chiết xuất, phương pháp chiết xuất, và độ
12
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
tuổi của lá Ổi ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất phenol và khả năng
chống oxy hóa của chúng.
Các hợp chất chống oxy hóa của lá Ổi trồng tại Thái Lan đã được
Suganya Tachakittirungrod và cộng sự (2007) phân lập dựa trên phương
pháp phân tích quang phổ và chiết xuất bằng methanol. Các hợp chất này đã
được thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro. Kết quả cho thấy ba hợp
chất flavonoid, quan trọng đối với hoạt tính chống oxy hóa của lá Ổi là
quercetin-3-O-glucopyranoside. Kết quả này có thể được xem là cơ sở khoa
học cho các phương pháp điều trị trong y học cổ truyền.
Tác dụng phòng ngừa ung thư
Dịch chiết từ lá, hạt Ổi đã được xem có tiềm năng ứng dụng trong các
biện pháp ngăn ngừa sự phát triển của các khối u nhời có chứa các hợp chất
polyphenol và isoflavonoid. Manosroi và cộng sự (2005) cho rằng các hợp
chất chiết xuất từ Ổi có khả năng ngăn chặn các dòng tế bào ung thư khác
nhau của con người bao gồm cả tuyến tiền liệt, ruột kết, ung thư biểu bì,
cũng như bệnh bạch cầu và u ác tính từ trong cơ thể động vật khác. Một
nghiên cứu khác của Kawakami và cộng sự (2010) cũng chỉ ra rằng dịch
chiết xuất từ lá Ổi non (búp Ổi) có khả năng điều trị ung thư tuyến tiền liệt.
Các nghiên cứu gần đây của Joseph và Priya (2011) đã chứng minh
trong tinh dầu lá Ổi chứa hợp chất polyphenol có tác dụng làm giảm thể
tích khối u, tác động đến các dòng tế bào ung thư cổ tử cung của người như
KB và P388, các dòng tế bào tế bào ung thư này được đặc trưng bởi những
thay đổi nghiêm trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng.
Tác dụng chống tiêu chảy
Joseph và Priya (2011) cho rằng dịch chiết xuất từ lá ổi chứa
quercetin có thể ức chế phóng thích acetylcholine để điều trị bệnh tiêu chảy
cấp tính. Tinh dầu chiết xuất từ lá Ổi cũng đã được thử nghiệm và cho thấy
có thể ức chế bệnh tiêu chảy gây ra do vi khuẩn Staphylococcus aureus,
Salmonella spp. và Escherichia coli. Vì vậy đa số các công trình nghiên cứu
đều chỉ ra rằng dịch chiết xuất từ lá Ổi có thể được sử dụng trong phương
pháp điều trị các trường hợp tiêu chảy không tác dụng với thuốc kháng
sinh.
Beckstrom Sternberg và cộng sự (1994) cho rằng Quercetin thành
phần tác dụng chống tiêu chảy, nó có thể tăng cường hoạt động của cơ trơn
đường ruột và ức chế nhu động ruột. Ngoài ra, các flavonoid và triterpene
trong lá Ổi cũng có tác dụng chống co thắt ruột.
13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
14
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
15
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
thường được gọi là C6-C3-C6. Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở.
Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen
mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3
hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
16
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
2.2.3 Terpenoid
Terpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên mà cấu trúc hóa học dựa trên cơ
sở các phân tử isoprene liên kết lại với nhau, có công thức tổng quát
(C5H8)n vời n ≥ 2. Tuy là dẫn xuất của isoprene nhưng isoprene lại không
phải là tiền chất của quá trình sinh tổng hợp terpenoid. Chất liệu cơ bản để
sinh tổng hợp terpenoid là pharnesyl pyrophosphate.
Dựa vào số đơn vị isoprene, người ta phân chia thành: monoterpene
(C10H16), sesquiterpene (C15H24), diterpene (C20H32), sesterterpene (C25H40),
triterpene (C30H48), tetraterpene (C40H64), polyterpene (C5H8)n.
Monoterpene (C10H16) là thành phần chính của tinh dầu, hiện diện
trong khoảng 60 họ thực vật, nhưng chủ yếu trong 10 họ. Hàm lượng tinh
dầu trong cây thường thấp, khoảng 1%, ngoại trừ nụ hoa cây Đinh hương
Syzygium aromaticum (L.) có hàm lượng tinh dầu chiếm 15-20%. Cấu trúc
hóa học của các monoterpene có thể là mạch hở 1, 2 hoặc 3 vòng với
khoảng 10 khung sườn carbon cơ bản chính.
Sesquiterpene (C15H24): tinh dầu cũng chứa những hợp chất loại
sesquiterpene, thường gặp các sesquiterpene lacton trong các cây họ Cúc.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên sesquiterpene có thể là mạch
hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với khung sườn carbon cơ bản chính.
Diterpene (C20H32): trong tự nhiên, diterpene không vòng là hợp chất
phytol, diterpene đơn vòng là vitamin A. Diterpene bốn vòng có khung cơ
bản là gibberelan với ví dụ là gibberilin, chất tăng trưởng thực vật. Cấu trúc
hóa học của các hợp chất tự nhiên diterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc
4 vòng với 70 khung sườn carbon cơ bản chính.
Sesterterpene (C25H40): trong tự nhiên, các hợp chất loại sesterterpene
hiện diện với số lượng nhỏ. Cấu trúc hóa học của các sesterterpene có thể là
mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 6 khung sường carbon cơ bản chính.
Triterpene (C30H48) được phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực
vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside. Cấu trúc hóa học của các
triterpene có thề là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn carbon cơ
bản chính.
Tetraterpene (C40H64) còn được gọi là carotenoid. Các hợp chất này
thường có cấu trúc hóa học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chất
có màu từ vàng, cam đến đỏ tạo nên màu sắc cho hoa và trái cây. Cấu trúc
hóa họ của các tetraterpene có thể là mạch hở, 1 hoặc 2 vòng.
17
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Polyterpene (C5H8)n: các polyterpene luôn có cấu trúc mạch hở, thẳng.
Các polyterpene tự nhiên với độ polymer hóa cao ( từ 500 đến 5000 đơn vị
isoprene) là những hợp chất nhựa cây hiện diện trong khoảng 300 loài thực
vật.
Hầu hết hợp chất terpenoid có cấu trúc vòng với một số nhóm chức
như –OH, >CO, –CHO, –O–. Đặc tính chung của chúng là ít tan trong
nước, tan trong chất béo ngoại trừ các glycoside ( tạo thành khi chúng kết
hợp với oza) thì tan trong nước.
2.2.4 Steroid
Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động
vật và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng
cyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong một vài trường hợp hiếm gặp
là sự biến đổi của hệ thống vòng nói trên.
18
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
19
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Tannin hiện diện với trọng lượng cao trong thực vật, muốn chiết lấy
tannin có thể sử dụng dung môi là nước. Làm tủa tannin bằng gelatin mặn,
bằng cách rót dung dịch gelatin mặn vào dịch chiết, khuấy nhẹ, đều rồi để
yên ở nhiệt độ phòng, tanin sẽ tủa. Do dung dịch gelatin mặn có độ nhớt
cao nên có thể thay thế bằng dung dịch polyvinylpyrolidon.
2.2.6 Saponin
Saponin là một glycoside phân bố khá rộng trong thực vật. Người ta
đã tìm thấy khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có chứa saponin, ngoài ra
saponin còn được tìm thấy ở một số động vật như: hải sâm, cá sao,...
Người ta dựa theo cấu trúc hóa học mà chia hợp chất saponin ra thành
hai loại: saponin steroid và saponin triterpenoid.
- Saponin triterpenoid: phần genin loại này có 30C, gồm saponin
triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic.
- Saponin steroid: phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn xuất
của khung cholestan, gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm
saponin steroid alkaloid.
Saponin là các chất phân cực mạnh nên tan nhiều trong nước và các
alcol bậc thấp, rất ít tan trong acetone, không tan trong ether và hexane. Do
đó, có thể dùng 3 dung môi này để tủa saponin trong quá trình chiết xuất.
Saponin có thể được tủa bởi (CH3COO)2Pb, Ba(OH)2, (NH4)2SO4. Có
thể dùng tính tạo tủa này để phân lập saponin.
2.2.7 Glycoside
Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ
phận của cây: lá, vỏ, hạt,...Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị
đắng. Trong cây, chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tantrong các dịch tế
bào.
Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần
aglycone và phần đường.
Phần aglycone cấu tạo bởi một khung steroid, gắn với C17 là vòng
lactone, dựa vào vòng lactone, người ta chia chúng thành 2 nhóm lớn:
- Cardenoid: vòng lactone 5 cạnh, có 1 nối đôi.
- Bufadienolid: vòng lactone 6 cạnh, có 2 nối đôi.
20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Phần đường được gắn vào C3 trên khung steroid. Cho đến nay, người
ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau. Ngoài những đường thông thường
như glucose, rhamnose, xylose, fucose còn có những đường là 2,6-desoxy.
Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong
petroleum ether, hexane, benzene nhưng tan được trong chloroform, diethyl
ether, tan tốt trong alcol, nước.
21
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
chiết tách đặc trưng, vì vậy, khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ
các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được
quy trình phù hợp.
Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử
dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết
Soxhlet,... Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ,
dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ
thấp khoảng 40 – 50oC vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một
vài hợp chất kém bền nhiệt.
2.3.1.2 Lựa chọn dung môi chiết tách
Chọn dung môi phải trung tính không độc, không quá dễ cháy, hòa tan
được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể
được loại bỏ dễ dàng. Cần tránh các dung môi độc như benzene hoặc dễ
cháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetraclorua,...
Dung môi dùng để chiết tách cần phải thỏa một số điều kiện sau:
Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì dung môi dễ hao hụt
do bay hơi và dễ dẫn đến cháy nổ.
Không tác dụng hóa học với các chất có trong nguyên liệu và không bị
thay đổi tính chất khi sử dụng lại.
Nhiệt hóa hơi thấp để tránh tiêu hao nhiều nhiệt.
Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán.
Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất.
Không tạo hỗn hợp nổ đối với không khí, không được có những tạp
chất không bay hơi và khi bay hơi không được để lại các tạp chất có mùi lạ.
Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị. Không gây mùi lạ đối với sản
phẩm và không độc hại với người sử dụng.
Dể tìm và rẻ tiền.
2.3.1.3 Một số điều cần lưu ý khi sử dụng dung môi để chiết tách
Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy
tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp chất bẩn mà thường gặp
nhất là chất dẻo hóa. Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường
chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo.
22
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
23
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
2.3.1.5 Một số thủ thuật khi cô lập các hợp chất hữu cơ
Làm khô mẫu chất
Sau khi chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi có được
cao. Cao chiết này cần được làm khô vì các lý do sau:
+ Các hợp chất trong cao sẽ ổn định bền nếu chúng hiện diện ở trạng
thái khô hơn trạng thái lỏng.
+ Để tính đúng hiệu suất của cao chiết đối với lượng cao thô ban đầu.
+ Để tiếp tục tinh chế cao bằng sắc ký cột: biết lượng cao để lấy lượng
silicagel cần thiết cho sắc kí cột.
Nếu mẫu là hợp chất tinh khiết muốn đo các số liệu phổ thì mẫu cần
được sấy khô, nếu còn lẫn vết nước, trên phổ đồ xuất hiện tính hiệu của
nước gây khó khăn trong việc giải đoán cấu trúc
Các phương pháp làm khô mẫu
Sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không: khi cô quay chân
không đến lúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ đi vào máy, đi
nhè nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên của máy, chỗ đóng mở áp
suất để tạo chân không cho máy, có một ống để châm dung dịch vào bình
cô quay mà không cần tắt ngưng máy; cho khí vào bằng ngõ này).
Sấy khô bằng bình hút ẩm: mẫu cần làm khô được đặt trong một
becher, miệng của becher được đậy bằng một tờ giấy lọc tạo một số lỗ nhỏ.
Đặt becher vào bình hút ẩm đậy nắp bình lại. Cho máy bơm hút hoạt động
cho đến khi mẫu chất khô thì ngưng lại.
2.3.2 Phương pháp chiết tách hợp chất ra khỏi cây
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các
phương pháp đều xoay quay quanh hai phương pháp chính là chiết rắn-lỏng
và chiết lỏng-lỏng.
2.3.2.1 Phương pháp chiết rắn – lỏng
Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng,
có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa
tan một ít nhựa gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây.
Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt trong bình, Rót dung môi
tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ
phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu
24
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch
chiết được lọc ngang qua tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao
chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá
trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia
tăng hiệu quả của sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột
cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm
dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là
đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào
dung môi đến khi đạt mức bão hòa. Dung môi sau khi thu hồi được làm
khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần
sau.
2.3.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Phương pháp chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol
thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau (yếu, trung bình,
mạnh) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó. Đây
là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha lỏng và hai
pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện
bằng bình lóng. Trong đó, cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ
phân cực tăng dần. Với mỗi loại dung môi, việc chiết được thực hiện nhiều
lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới
chuyển sang dung môi khác.
25
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
26
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
O2●−, từ đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm
nhập vào cơ thể. Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể còn có thể tham
gia vào các phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân hủy lipid
hydroperoxide tạo gốc tự do peroxide, sau đó gốc tự do này tham gia vào
phản ứng dây chuyền peroxide hóa lipid gây hại cho cơ thể. Ngoài ra, việc
vận động gắng sức cũng phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim.
Gốc tự do có nguốn gốc ngoại sinh
Gốc tự do ngoại sinh hình thành do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm
môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng Mặt Trời, thuốc lá,
rượu bia, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thức ăn,...
Việc sử dụng nhiều loại thuốc trị bệnh củng có thể tạo ra các gốc tự
do, như các kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung thư như
bleomycin và các loại thuốc cản trở sự phát triển của tế bào,... Xạ trị điều trị
ung thư cũng là một nguyên nhân sinh ra gốc tự do, các bức xạ được sử
dụng trong xạ trị tác động và truyền năng lượng cho các thành phần của tế
bào, sinh ra các gốc tự do, các gốc tự do này tiếp tục phản ứng với oxy hòa
tan trong dịch tế bào sinh ra các ROS, tiếp tục gây ra các dây chuyền phản
ứng khác gây tổn thương tế bào, bất lợi cho cơ thể. Hút thuốc cũng như hít
phải khói thuốc lá gây ra những tổn thương cho đường hô hấp, mà nguyên
nhân một phần là do lượng lớn các gốc tự do bền trong nhự thuốc như
semiquinon có dẫn xuất từ quinon và hydroquinon có trong khối thuốc lá
gây ra những tổn thương cho phế nang,...
2.4.1.3 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Khi số lượng gốc tự do nằm trong khả năng kiểm soát của cơ thể,
chúng đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống của cơ thể.
Chẳng hạn như quá trình hô hấp tế bào nhằm tạo năng lượng cho các
hoạt động sống, có bản chất là chuỗi phản ứng oxy hóa-khử và các gốc tự
do là sản phẩm ttrung gian của chuỗi phản ứng này. Gốc tự do còn có vai
trò khá lớn trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, góp phần tiêu diệt các sinh
vật có hại xâm nhập vào cơ thể, đồng thời quét dọn các tế bào già cõi, tế
bào chết trong cơ thể, tạo điều kiện ch ocac1 tế bào mới, khỏe mạnh sinh
sôi và phát triển. Ngoài ra, gốc tự do còn góp phần ức chế, tiêu diệt các tế
bào bất thường như tế bào ung thư.
2.4.1.4 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Khi cơ thể ở trạng thái khỏe mạnh, cơ thể có khả năng sinh ra các chất
chống oxy hóa giúp trung hòa lượng gốc tự do sinh ra torng các quá trình
27
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
chuyển hóa của cơ thể củng như các gốc tự do ngoại sinh. Thế nhưng khi
bước sang tuổi trung niên hay khi cơ thể không đạt trạng thái khỏe mạnh,
cân bằng vốn có giữa gốc tự do và chất chống oxy hóa bị phá vỡ, kéo theo
đó là hàng loạt chuỗi phản ứng bất lợi lên các phân tử lipid, protein, acid
nucleic của tế bào, dẫn đến hàng loạt các tổn thương và kết quả là sự hoạt
động bất thường của các cơ quan.
Các gốc tự do tấn công lên màng tế bào, làm màng tế bào mất dần
chức năng sinh học, quá trình trao đổi chất từ đó bị cản trở, các mô dần bị
thoái hóa và sau cùng dẫn đến sự chết của tế bào. Hậu quả của sự tấn côn
đó là hàng loạt các bệnh như Parkinson, Alzheimer, các bệnh về thần kinh,
tim mạch, đái tháo đường, suy giảm hệ thốn miễn dịch, ung thư,... Ngoài ra,
khi cơ thể bị yếu đi, hiệu suất làm việc của hệ thống enzyme sửa sai với
nhiệm vụ loại đi những điểm bị hỏng trên ADN củng giảm đi, khi đó gốc tự
do dễ dàng tấn công vào nhóm đường deoxyribose và base nitơ của nhóm
purin, pirimidin của ADN, sinh ra các thể độc biến gây hại cho cơ thể.
2.4.2 Chất chống oxy hóa
2.4.2.1 Khái niệm về chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là chất trực tiếp hay gián tiếp ngăn cản, trung hòa
hay loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do với cơ thể. Chúng có thể trực
tiếp phản ứng với các gốc tự do, tạo nên sản phẩn mới kém hoạt động hơn
nhằm ngăn phản ứng dây chuyền do gốc tự do gây ra. Cũng có thể gián tiếp
tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp hoặc ức chế các enzyme xúc tác
cho quá trình hình thành gốc tự do, giúp ngăn cản sự hình thành của gốc tự
do.
2.4.2.2 Phân loại chất chống oxy hóa
Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu
trúc của chất chống oxy hóa. Cũng có thể phân loại gốc tự do dựa trên bản
chất enzyme hoặc không có bản chất enzyme của gốc tự do.
Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme
Đây là hệ thống các chất chống oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế
bào, nhằm duy trì căn bằng giữa lượng gốc tự do và chất chống oxy hóa
trong cơ thể, giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công do các gốc tự do gây ra
trong suốt các quá trình sinh lý và bệnh lý. Hệ thống này gồm các enzyme
như: superoxide dismutase, glutathion peroxidase, catalase.
Chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme
28
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Bên cạnh các chất chống oxy hóa có bản chất enzyme có nguồn gốc
nội sinh, cơ thể còn có các chất chống oxy hóa không mang bản chất
enzyme củng có nguồn gốc nội sinh như Vitamin A, glutathione, glycin,
methionine,... và các chất chống oxy hóa ngoại sinh có trong thực phẩm
như Vitamin C, vitamin E, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpene,
carotenoid,...
2.4.2.3 Nguyên tắc hoạt động
Các chất chống oxy hóa hoạt động theo phương thức sau:
Phá vỡ chuỗi phản ứng (ví dụ: -tocopherol sẽ hoạt động trong pha
lipid đễ giữ lại gốc tự do)
Bằng cách làm giảm nồng độ của loại phản ứng có oxy ( ví dụ:
Glutathione).
Bằng cách làm sạch gốc tự do khởi tạo ( ví dụ: Superoxide dimustase
hoạt động trong pha lipid để giữ lại các gốc tự do superoxide).
Bằng cách tạo phức càng với kim loại chuyển tiếp: một nhóm các hợp
chất hoạt động bằng cách cô lập các kim loại chuyển tiếp.
2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng sử
dụng gốc tự do DPPH
DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) là một gốc tự do ổn định và có
thể nhận một electron hoặc gốc hydro để trở thành một phân tử có tính chất
nghịch từ ổn định. Chất chống oxy hóa tương tác với DPPH để chuyển cả
electron và nguyên tử hydro đến DPPH, vì vậy nó vô hiệu hóa tính chất của
gốc tự do, dựa vào mức độ thay đổi màu sắc ta xác định được khả năng loại
bỏ gốc tự do của thuốc. Vì sự dễ dàng và tiện lợi của sự tương tác này nên
hiện nay nó được sử dụng rộng rãi trong việc sàng lọc hoạt tính của gốc tự
do.
Để đánh giá khả năng kháng oxi hóa của một hợp chất cụ thể hoặc cao
chiết, ta cho hợp chất/cao chiết đó phản ứng với gốc tự do ổn định DPPH
trong MeOH. Khảo sát sự làm giảm độ hấp thụ của DPPH bởi các hợp
chất/cao chiết sẽ đánh giá được khả năng loại bỏ gốc tự do của chúng. Gốc
tự do DPPH hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm. Nhưng khi tương tác với
các chất có tính oxy hóa, độ hấp thụ sẽ giảm hoặc biến mất.
Độ hấp thụ của DPPH ttrong dung dịch đệm của MeOH cao nhất, tiếp
đó là trong MeOH, dung dịch đệm của EtOH. Vì vậy khi pha DPPH trong
dung dịch đệm của MeOH sẽ nhạy hơn EtOH khi đo quang phổ hấp thụ.
29
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
2.5 Tổng quan về một số loại vi khuẩn gây hại phổ biến và các
phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn.
2.5.1 Một số loại vi khuẩn phổ biến
2.5.1.1 Vi khuẩn Escherichia coli [23,24]
Đặc điểm hình thái:
E. coli là một trực khuẩn hình que ngắn, dài khoảng 6 µm và rộng 2-3
µm, tròn ở hai đầu, tế bào thường đứng riêng lẽ nhưng đôi khi cũng xếp
thành chuỗi ngắn, có tiêm mao quanh thân nên có thể di động, rất ít chủng
E. coli có vỏ. Vi khuẩn không có khả năng sinh nha bào, có thể có giáp mô.
30
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
3 chủng thuộc về serotype O26, O55, O157 có thể gây nguy hiểm cho sức
khỏe người tiêu dùng.
2.5.1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus [25-29]
Đặc điểm hình thái
S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính khoảng 0,5-
1,5 µm, có thể đứng riêng lẽ, từng đôi, từng chuỗi ngắn hoặc từng chùm
không đều nhau dạng chùm nho. Vi khuẩn không di động và không sinh
bào tử, cư trú trên da, màng nhày trong các cơ quan của con người và động
vật máu nóng.
31
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
thực phẩm do S. aureus ký sinh trong cá, tôm, cua hoặc ghẹ và 3,5% số vụ
ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh trong trứng.
2.5.2 Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn [30,31]
2.5.2.1 Phương pháp khoanh giấy
Nguyên tắc: Xác định khả năng của dịch trích được tẩm vào khoanh
giấy, khuếch tán vào lớp thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung
quanh giấy tẩm dịch trích. Vùng ức chế càng lớn tác dụng kháng khuẩn của
dịch trích càng mạnh.
Cũng giống như phương pháp ống trụ chỉ khác là thay ống trụ bằng
các khoanh giấy thấm đường kính khoảng 6 mm. Các khoanh giấy thấm sau
khi đã khử trùng đem đặt lên các đĩa thạch (đã cấy vi khuẩn) rồi nhỏ 1 đến
2 giọt dung dịch thử. Có thể nhúng khoanh giấy vào dung dịch dược liệu rồi
đặt lên đầu mũi kim cho khô trước khi đặt lên thạch.
2.5.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [32]
MIC (minium inhibitory concentration) là thuật ngữ chỉ nồng độ tối
thiểu của dung dịch thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn. MIC được sử
dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của dịch thử.
Phương pháp môi trường đặc
Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ
nhỏ nhất của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng
vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
Nguyên lý: Dung dịch thử được pha loãng trong môi trường thạch
theo cấp độ giảm ½. Vi khuẩn được cấy trên đĩa kháng sinh và được ủ ấm
cho phát triển. Nồng độ thấp nhất khi quan sát bằng mắt thường với khuẩn
lạc ≤ 3 được xác định là giá trị MIC.
Hình 2.17: Phương pháp pha loãng trong thạch (môi trường đặc)
32
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Hóa Lý, Khoa Khoa học Tự
nhiên - Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2015 đến tháng 11/2015.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dung cụ và thiết bị
Tủ sấy: dùng để sấy nguyên liệu và các dụng cụ thủy tinh
Tủ cấy vô trùng (Laminar, Việt Nam)
Nồi khử trùng nhiệt ướt (Hirayama, Nhật Bản)
Máy cô quay chân không
Bếp điện
Cân điện tử
Máy soi quang phổ UV
Bình lóng
Bình cầu
Phễu chiết: 500 ml, 1000 ml
Becher 100 ml, 500 ml
Micro pipet 10 μl, 100 μl, 1000 μl
Ống nghiệm
Ống đong 10 ml, 100 ml, 250 ml
Ống nhỏ giọt, Pasteur pipet
Ống mao quản
Giấy lọc
Đĩa petri
Que cấy
33
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
34
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
thu hồi dung môi. Dung môi thu hồi được trong quá trình cô quay sẽ được
cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết, tiếp tục thực hiện quá trình
như thế vài lần cho đến khi chiết kiệt các chất từ mẫu bột nguyên liệu. Phần
dịch chiết được cô quay đuổi dung môi, thu được cao Ethanol tổng.
Hiệu suất trích cao Ethanol tổng từ nguyên liệu ban đầu:
Hình 3.1: Ngâm dầm mẫu bột khô Hình 3.2: Cô quay chân không
lá Ổi non
35
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
lượng Hexane khoảng 100 – 200 ml, lắc mạnh nhiều lần. Sau khi lắc, để
yên bình lóng trên giá đỡ khoảng 15 phút để hỗn hợp trong bình lóng tách
thành hai pha, pha hữu cơ có tỉ trọng thấp hơn chứa các chất tan trong
Hexane nằm phía trên, phần phía dưới là pha nước. Mở van bình lóng, hứng
riêng pha hữu cơ và pha nước. Pha nước được chiết tiếp với dung môi cho
đến khi chấm SKLM trên pha hữu cơ không còn chất nữa thì dừng lại (
hoặc nhỏ một giọt pha hữu cơ trên tấm kính sạch, nếu dung môi bay hơi hết
không để lại chất gì thì xem như việc chiết đã hoàn thành). Tiến hành chiết
cho đến hết lượng cao Ethanol ban đầu. Dịch chiết Hexane từ các lần chiết
được gom lại, làm khan với Na2SO4, đuổi dung môi thu được cao Hexane.
36
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
37
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Quy trình điều chế cao tổng và cao thành phần được tóm tắt trong sơ
đồ sau:
38
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
3.2.3 Phương pháp định tính thành phần hóa học các loại cao
Sử dụng một số thuốc thử đặc trưng để định tính các nhóm hợp chất
hữu cơ có trong cao tổng và các cao thành phần.
3.2.3.1 Định tính sự hiện diện của Alkaloid
Thuốc thử Dragendorff (Potassium bismuth iodide)
Công thức:
Dung dịch A: 8 g Bi(NO3)3.H2O +25 mL HNO3 30% (d=1,18).
Dung dịch B: 28 g KI + 1ml HCl 6N + 5mL nước cất.
Hỗn hợp hai dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5oC cho tủa màu
nâu sậm và tan trở lại, lọc, thêm nước cất đủ 100 mL được thuốc thử
Dragendorff.
Hiện tượng: nếu có Alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa vàng cam_ đỏ nâu.
Thuốc thử Wagner
Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 mL nước cất, thêm nước cho đủ
100mL.
Hiện tượng: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu (nâu sáng_ nâu
đen).
3.2.3.2 Định tính sự hiện diện của Flavonoid
Thuốc thử FeCl3 5%
Hiện tượng: nếu có Flavonoid sẽ xuất hiên kết tủa màu xanh đen.
Phản ứng dương tính.
Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Hiện tượng: Nếu có Flavon và Flavonol cho màu vàng đậm đến màu
cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc
xanh dương-đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
Thuốc thử 1% NaOH/ethanol
Nhỏ dung dịch NaOH vào dịch cao được hòa tan trong ethanol.
Hiện tượng: nếu có Flavonoid sẽ cho màu từ vàng đến cam-đỏ.
3.2.3.3 Định tính sự hiện diện của Steroid và Triterpenoid
Thuốc thử Liebermann-Burchard
39
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
40
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
41
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Thường được sử dụng trong khảo sát, sàng lọc các chất chống oxy
hóa.
3.2.4.4 Chuẩn bị hóa chất
Chuẩn bị dung dịch DPPH: cân chính xác 5 mg DPPH và định mức
thành 5 mL với methanol thu được dung dịch DPPH có nồng độ 1000
μg/ml, bảo quản ở -4OC trong bóng tối. Cố định nồng độ dung dịch DPPH
là 40 μg/mL (tương đương 100 μM).
Chuẩn bị dung dịch Vitamin C: cân chính xác 10 mg Vitamin C và
định mức thành 10 mL với methanol thu được dung dịch Vitamin C có
nồng độ 1000 μg/mL.
Hút 100 μL dung dịch Vitamin C nồng độ 1000 μg/mL, thêm 900 μL
methanol thu được dung dịch Vitamin C có nồng độ 100 μg/mL, được dùng
để pha thành dãy nồng độ khác nhau như bảng sau:
Bảng 3.2: Dãy nồng độ, thể tích Vitamin C
CVitamin C VVitamin C VDPPH Vcần pha
(μg/mL) (μL) (μL) (mL)
1 10
2 20
4 40
40 1
6 60
8 80
10 100
Chuẩn bị mẫu phân tích: cân chính xác 10 mg cao và định mức thành
10 mL với methanol thu được dung dịch cao có nồng độ 1000 μg/mL, được
dùng để pha thành dãy nồng độ khác nhau như bảng sau:
42
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
43
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Bảng 3.6: Dãy nồng độ, thể tích cao Ea và cao Nước
Ccao Ea, Nước Vcao Ea, Nước VDPPH Vcần pha
(μg/mL) (μL) (μL) (mL)
1 1
2 2
4 4
40 1
6 6
8 8
10 10
Trong đó:
IC (%): phần trăm ức chế của mẫu đối với DPPH
ODA: giá trị mật độ quang của DPPH
ODS: giá trị mật độ quang của hỗn hợp DPPH và cao chiết trừ đi giá
trị mật độ quang của cao chiết.
3.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
44
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Môi trường LB là môi trường thuận lợi cho 2 loài vi khuẩn E. coli và
S. Aureus phát triển.
Cách pha môi trường LB đặc:
Bảng 3.7: Môi trường LB
Nguyên liệu Khối lượng (thể tích)
Meat Extract Powder BactoGrade
3g
(for bacteriology)
Yeast Extract 1,5 g
Agar 3,9 g
NaCl 3g
Nước cất 300 ml
Hấp khử trùng trong lò hấp ở 121OC trong 30 phút trước khi sử dụng.
Sau đó cho vào đĩa petri khoảng 10 mL môi trường, để nguội.
Chuẩn bị cao chiết: cao chiết được pha loãng trong methanol theo cấp
số nhân 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml và 128 µg/ml, 256 µg/ml,
512 µg/ml, 1024 µg/ml, 2048 µg/ml, 4096 µg/ml, 8192 µg/ml.
Chuẩn bị vi khuẩn: vi khuẩn được nhân mật số trong môi trường LB
trong 24 giờ. Dịch nuôi được pha loãng với dung dịch NaCl 0,9% cho đến
khi có độ đục tương đương với độ đục chuẩn 0,5 McFarland. Nếu dịch vi
khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều
chỉnh độ đục bằng cách cho thêm dung dịch NaCl 0,9% hoặc cho thêm vi
khuẩn. Dịch vi khuẩn có độ đục tương đương độ đục McFaland được pha
loãng 100 lần để được dịch vi khuẩn có nồng độ 106 vi khuẩn/ml và được
sử dụng cho thí nghiệm khuếch tán trên thạch.
Cách tiến hành: Dịch nuôi vi khuẩn đã được pha loãng trong nước
muối sinh lý được trãi đều trên môi trường LB đặc. Đĩa thạch được để khô
trong 15 phút trước khi đặt khoanh giấy tẩm cao chiết.
Khoanh giấy (đường kính 6 mm) được cho ngấm 100 µl cao chiết ở
các nồng độ đã pha và để khô. Sau đó, khoanh giấy được đặt lên bề mặt môi
trường đã trải vi khuẩn. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần và thí nghiệm được
lặp lại 3 lần. Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho cao chiết
từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
45
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Mẫu vi khuẩn được ủ ở 32C trong 24 giờ. Đường kính vùng ức chế
được đo bằng thước mm. Đường kính vùng ức chế bao gồm đường kính
khoanh giấy. Ranh giới vùng ức chế được xác định bằng một vùng không
có bất kỳ khuẩn lạc nào được phát hiện bằng mắt thường, bỏ qua các khuẩn
lạc li ti ở mép mà chỉ có thể phát hiện dưới kính hiển vi.
Từ đó xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC của từng loại cao
chiết và kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm minitab 16.
46
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả điều chế các loại cao
Bảng 4.1: Kết quả đặc điểm, khối lượng, hiệu suất của các cao
47
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Kết luận: Thành phần của cao Ethanol tổng gồm có các loại hợp chất:
Alkaloid, Flavonoid, Steroid & Triterpenoid, Tannin, Saponin, Glycoside.
4.2.2 Định tính cao Hexane
Bảng 4.3: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Hexane
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết luận
48
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Kết luận: Thành phần của cao Hexane gồm có các loại hợp chất: Alkaloid,
Flavonoid, Steroid & Triterpenoid, Tannin.
4.2.3 Định tính cao Chloroform
Bảng 4.4: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao
Chloroform
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết luận
Kết luận: Thành phần của cao Chloroform gồm có các loại hợp chất:
Alkaloid, Flavonoid, Steroid & Triterpenoid, Tannin, Saponin, Glycoside.
49
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Kết luận: Thành phần của cao Ethyl acetate gồm có các loại hợp chất:
Alkaloid, Flavonoid, Tannin, Saponin, Glycoside.
4.2.5 Định tính cao Nước
Bảng 4.6: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao Ethyl
acetate
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết luận
50
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Kết luận: Thành phần của cao Nước gồm có các loại hợp chất: Alkaloid,
Flavonoid, Tannin, Saponin, Glycoside.
4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp
DPPH
4.3.1 Vitamin C
Bảng 4.7: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của Vitamin C
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,031 0
1 0,913 11,44
2 0,813 21,14
4 0,593 42,48
6 0,376 63,53
8 0,126 87,78
10 0,041 96,02
51
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.2: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ Vitamin C
Từ đồ thị, suy ra IC50 của Vitamin C: 4,79 μg/mL.
4.3.2 Cao Et tổng
Bảng 4.8: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Et
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,030 0
1 0,700 32,04
2 0,683 33,69
5 0,611 40,68
10 0,530 48,54
20 0,326 68,35
30 0,114 88,93
52
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.3: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Et
Từ đồ thị, suy ra IC50 của cao Et: 10,29 μg/mL.
4.3.3 Cao Hex
Bảng 4.9: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Hex
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,028 0
10 0,839 18,39
20 0,755 26,56
30 0,673 34,53
40 0,574 44,16
50 0,460 55.25
60 0,354 65.56
53
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.4: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Hex
Từ đồ thị, suy ra IC50 của cao Hex: 44,77 μg/mL.
4.3.4 Cao C
Bảng 4.10: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao C
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,024 0
5 0,737 28,03
10 0,678 33,79
20 0,530 48,24
30 0,426 58,40
40 0,337 67,09
50 0,220 78,52
54
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.5: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao C
Từ đồ thị, suy ra IC50 của cao C: 23,72 μg/mL.
4.3.5 Cao Ea
Bảng 4.11: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao Ea
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,023 0
1 0,944 7,72
2 0,818 20,04
4 0,594 41,94
6 0,458 55,23
8 0,260 74,58
10 0,055 94,62
55
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.6: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Ea
Từ đồ thị, suy ra IC50 của cao Ea: 5,27 μg/mL.
4.3.6 Cao Nước
Bảng 4.12: Nồng độ, mật độ quang và phần trăm ức chế của cao
Nước
Nồng độ Mật độ quang Phần trăm ức chế
(µg/mL) (%)
0 1,027 0
1 0,925 9,93
2 0,850 17,23
4 0,625 39,14
6 0,426 58,52
8 0,311 69,72
10 0,144 85,98
56
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 4.7: Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ cao Nước
Từ đồ thị, suy ra IC50 của cao Nước: 5,55 μg/mL.
IC50 (µg/mL)
Hình 4.8: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của Vitamin C với các cao
Từ biểu đồ trên cho thấy khả năng kháng oxy hóa của cao Ea và cao
Nước tương đương Vitamin C.
Cao Et có IC50 gấp 2,15 lần IC50 của Vitamin C.
Cao C có IC50 gấp 5 lần IC50 của Vitamin C.
Cao Hex có IC50 gấp 9,35 lần IC50 của Vitamin C.
57
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Kết luận:
Cao Ea và cao Nước có hoạt tính chống gốc tự do mạnh nhất, kế
đến là cao Et tổng, cao C và cuối cùng là cao Hex.
Nhìn chung khả năng kháng oxy hóa của lá Ổi non là rất cao,
nguyên nhân là trong lá Ổi non có chứa nhiều chất chống oxy hóa như
Polyphenol, Flavonoid, Acid ascorbic và Carotenoids (theo Qian và
Nihorimbere, 2004).
4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch (Phụ lục B)
Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi methanol đối với sự phát
triển của vi khuẩn là không đáng kể, dung môi không tạo được vòng vô
khuẩn đối với tất cả các dòng vi khuẩn. Điều này có thể liên quan đến tốc
độ bay hơi của methanol. Methanol được sử dụng trong thí nghiệm có nồng
độ 99%, do đó tốc độ bay hơi rất nhanh, không đủ thời gian ức chế sự phát
triển của vi khuẩn. Như vậy, việc sử dụng methanol làm dung môi để pha
loãng cao chiết là thích hợp.
58
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Bảng 4.13: Hoạt tính kháng E. coli ở các nồng độ khác nhau của các
cao 1 4 2 5 3
(Ghi chú: (-): không kháng khuẩn, các giá trị có chữa cái theo sau trong cùng một cột
khác nhau sẽ khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%)
Từ bảng kết quả trên cho thấy, khả năng kháng E. coli ở các nồng độ
thử đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Xét về mặt lý thuyết, vòng vô khuẩn tạo bởi các cao sẽ có sự gia tăng
về mặt kích thước theo chiều tỉ lệ thuận với nồng độ. Tuy nhiên, trên thực
tế, sự kháng khuẩn của các cao lá Ổi non không ổn định, ở nồng độ lớn hơn
đường kính vòng vô khuẩn có thể nhỏ hơn giá trị MIC, nguyên nhân có thể
là do vi khuẩn đã đột biến kháng thuốc hoặc do trong cao chiết không chỉ
chứa những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mà có chứa các chất dinh
dưỡng, vì thế xung quanh mép rìa vòng vô khuẩn thường có mật độ vi
khuẩn cao hơn.
Cao Et và cao Hex có MIC đều là 4096 μg/mL với đường kính vòng
vô khuẩn của cao Et là 38,50±0,50a mm và của cao Hex là 38,00±1,00a mm,
cho thấy khả năng kháng khuẩn E. coli của hai cao là tương đương nhau.
Cao C và cao Ea có MIC đều là 2048 μg/mL với đường kính vòng vô
khuẩn của cao C là 34,00±1,00a mm và của cao Ea là 34,17±0,29a mm, cho
thấy khả năng kháng khuẩn E. coli của hai cao là tương đương nhau.
Khả năng kháng khuẩn E. coli của cao nước thấp nhất với MIC là
8192 μg/mL và đường kính vòng vô khuẩn 38,00±1,00 mm.
4.4.2 Khả năng kháng khuẩn Gram (+) S. aureus của các cao chiết lá
Ổi non
Đối với khuẩn S. aureus, khảo sát trên dãy nồng độ 8 μg/mL, 16
μg/mL, 32 μg/mL, 64 μg/mL, 128 μg/mL, 256 μg/mL cho kết quả không
kháng. Do đó tiến hành tăng nồng độ theo cấp số nhân để tìm ra giá trị MIC
của từng loại cao.
59
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Bảng 4.14: Hoạt tính kháng S. aureus ở các nồng độ khác nhau của
các cao1 2 3
(Ghi chú: (-): không kháng khuẩn, các giá trị có chữa cái theo sau trong cùng một cột
khác nhau sẽ khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%)
Từ bảng kết quả trên cho thấy, khả năng kháng S. aureus ở các nồng
độ thử đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Cao Et và cao Hex có MIC đều là 512 μg/mL với đường kính vòng vô
khuẩn của cao Et là 39,67±1,53a mm và của cao Hex là 39,00±0,50a mm,
cho thấy khả năng kháng khuẩn của hai cao là tương đương nhau.
Cao C và cao Nước có MIC đều là 1024 μg/mL với đường kính vòng
vô khuẩn của cao C là 30,67±2,08b mm và của cao Nước là 40,67±1,16a
mm, cho thấy khả năng kháng khuẩn S. aureus của cao Nước mạnh hơn cao
C.
Khả năng kháng khuẩn S. aureus của cao Ea là thấp nhất với MIC ở
4096 μg/mL và đường kính vòng vô khuẩn 41,67±1,53 mm.
Kết luận:
Cao chiết từ lá Ổi non có khả năng ức chế sự phát triển của vi
khuẩn Gram (+) và Gram (-).
Khả năng kháng khuẩn của từng loại cao đối với từng loại vi
khuẩn là khác nhau do tác nhân kháng khuẩn hiện diện trong từng cao tác
động lên các chủng vi khuẩn khác nhau.
Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của cao Et tổng và cao Hex
cao hơn cao C, Ea, Nước.
Nwinyi và cộng sự (2008) đã nghiên cứu dịch chiết lá Ổi bằng
ethanol có khả năng ức chế Escherichia coli.
60
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
61
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua quá trình thực hiện đề tài “Khảo sát định tính thành phần hóa học,
hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của các cao chiết lá Ổi non (Psidium
Guajava L.)”, đã thu được một số kết quả sau:
(i) Điều chế được 230,63 g cao Et tổng; 30,30 g cao Hex; 30,89 g cao
C; 11,90 g cao Ea và 89,84 g cao Nước từ 10 kg nguyên liệu tươi.
(ii) Định tính thành phần hóa học cho kết quả: trong cao Et và cao C
chứa Alkaloid, Flavonoid, Steroid và Triterpenoid, Tannin, Saponin,
Glycoside. Cao Hex chứa Alkaloid, Flavonoid, Steroid và Triterpenoid,
Tannin. Trong cao Ea và cao Nước chứa Alkaloid, Flavonoid, Tannin,
Saponin, Glycoside.
(iii) Khảo sát khả năng kháng oxy hóa tìm được giá trị IC50 của cao
Et tồng, cao Hex, cao C, cao Ea, cao Nước lần lượt là: 10,29 μg/mL, 44,77
μg/mL, 23,72 μg/mL, 5,27 μg/mL, 5,55 μg/mL.
(iv) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn E. coli và S. aureus cho giá trị
MIC của từng cao như bảng sau:
Bảng 5.1: Giá trị MIC của từng cao
62
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
[1] Hoàng Thị Ngọc, 2007. Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh
dầu lá Ổi (Psidium guajava L.) ở Nghệ An. Luận văn tốt nghiệp. Trường
Đại học Vinh.
[2] http://vi.wikipedia.org/wiki/Họ_Đào_Kim_Nương.
[3] Đỗ Tất Lợi, 1999. Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB y học,
trang 431 – 432.
[4] http://vi.wikipedia.org/wiki/Ổi
[5] Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1978. Phân loại thực vật. Thực vật
bậc cao. NXB ĐH và THCN.
[6] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn
Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy
Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập và Trần Toàn, 2008.
Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam Tập II. Nhà xuất bản Khoa
học và Kỹ thuật. Hà Nội, trang 499 – 504.
[7] Adeyemi, Stephen 0., Akanji M.A. and Oguntoye S.A., 2009.
Ethanolic leaf extract of Psidium guajava: Phytochemical and
trypanocidal activity in rats infected with Trypanosoma brucei brucei.
Journal of Medicinal Plants, Research Vol. 3(5). Available online at
ISSN 1996 – 0875, Academic Journal, pp.420 – 423.
[8] Baby Joseph, 2011. Review on nutritionnal, medicinal and
pharmacological properties of guava (Psidium Guajava Linn).
Internationnal Journal of Pharma and Bio Sciences, ISSN 0975 – 6299,
pp. 53 – 64.
[9] Đái Thị Xuân Trang, Phạm Thị Lan Anh, Trần Thanh Mến và Bùi
Tấn Anh, 2012. Khảo sát khả năng điều trị bệnh tiểu đường của cao chiết
lá Ổi (Psidium guajava L.). Tạp chí khoa học, 2012:22b 163-171, trang
163 – 170.
[10] Nguyễn Thị Hạnh Dung, 2009. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
của cây Ổi (Psidium guajava L.), cây Dâu Tằm (Morus acidosa Griff) và
cây Khổ Qua ( Momordica charantia L.). Luận văn tốt nghiệp. Đại học
Cần Thơ.
[11] Hui – Yin Chen and Gow – Chin Yen, 2006. Antioxidant activity
and free radical-scavenging capacity of extracts from guava (Psidium
guajava L.) leaves. Food Science, 02.047, pp. 686 – 694.
63
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
64
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
65
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
PHỤ LỤC A
1. Định tính Alkaloid
Thuốc thử Dragendroff
66
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
67
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 9: Dịch cao sau khi thêm thuốc thử Pb(CH3COO)2 bão hòa
5. Định tính Saponin (Căn cứ chỉ số tạo bọt)
Tạo bọt với NaOH 0,1N
68
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Hình 12: Dịch cao sau khi thêm thuốc thử Tollens
Thuốc thử Fehling (Tác dụng lên phần đường)
Hình 13: Dịch cao sau khi thêm thuốc thử Fehling
(Ghi chú: các ống nghiệm từ hình 1 đến hình 13 lần lượt là cao Et, Hex, C, Ea, Nước
sau khi thêm thuốc thử).
69
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
PHỤ LỤC B
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Gram (-) E. coli ở các nồng độ
khác nhau của các cao chiết lá Ổi non
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Et tổng ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 2 2678.389 1339.194 6887.29 0.000
Error 6 1.167 0.194
Total 8 2679.556
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Hex ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 2 3104.89 1552.44 1397.20 0.000
Error 6 6.67 1.11
Total 8 3111.56
70
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Nước ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 2 2888.000 1444.000 4332.00 0.000
Error 6 2.000 0.333
Total 8 2890.000
71
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Anova so sánh khả năng kháng khuẩn E. coli của các cao dựa trên
nồng độ MIC và đường kính vòng vô khuẩn
Anova so sánh khả năng kháng khuẩn của cao Et và cao Hex
Source DF SS MS F P
Loại cao 1 0.375 0.375 0.60 0.482
Error 4 2.500 0.625
Total 5 2.875
72
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
C2048 3 34.0000 A
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Gram (-) S. aureus ở các nồng độ
khác nhau của các cao chiết lá Ổi non
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Et tổng ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 4 41.73 10.43 7.11 0.006
Error 10 14.67 1.47
Total 14 56.40
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Hex tổng ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 4 44.267 11.067 21.42 0.000
Error 10 5.167 0.517
Total 14 49.433
73
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
74
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
Anova đường kính vòng vô khuẩn của cao Nước ở các nồng độ
Source DF SS MS F P
Nồng độ 4 3544.93 886.23 699.66 0.000
Error 10 12.67 1.27
Total 14 3557.60
Anova so sánh khả năng kháng khuẩn S. aureus của các cao dựa
trên nồng độ MIC và đường kính vòng vô khuẩn
Anova so sánh khả năng kháng khuẩn của cao Et và cao Hex
Source DF SS MS F P
Nồng độ 1 0.67 0.67 0.52 0.512
Error 4 5.17 1.29
Total 5 5.83
Anova so sánh khả năng kháng khuẩn của cao C và cao Nước
Source DF SS MS F P
Loại cao 1 150.00 150.00 52.94 0.002
75
Luận văn tốt nghiệp Đại học Tống Khánh Linh
76