Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...

Vol. 4 No. 30 Juni 2022

e-ISSN : 2442-5257

Research Article

Ekspresi Connexin-36 pada Kultur Monolayer Sel Insulin-Gaussie

Luciferase (iGL).
Expression in Monolayer Culture of Insulin-Gaussie Luciferase (iGl) cells.

Novi Putri Ayu1, Rizkyana Avissa1, Zahra Nurusshofa1, Sri Suciati Ningsih1,
Wawang S. Sukarya1.
1
Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Jl. Raden Patah No.01, RT.002/RW.006, Parung Serab, Kec. Ciledug, Kota Tangerang,
Banten 13460.
*Corresponding author
Email: Rizkyana.avissa@uhamka.ac.id

Received:
Accepted:

Abstract
Diabetes Mellitus a metabolic disease caused by abnormalities of insulin secretion indicated by
Hyperglycemia sign. Diabetes Mellitus type 2 has a high prevalence up to 90% from the total
Diabetes Mellitus cases. Molecular mechanisms of diabetes mellitus have been studied using in
vitro models, one of which is using insulin-Gaussie Luciferase (iGL) cells. iGL cell is a type of
cell line derived from pancreatic beta cells that modified so that they are able to express human
insulin-bound to Gaussia Luciferase. Escalation of insulin secretion and oscillatory coordination
of insulin secretion are influenced by connexin-36 gap junction expressed by pancreatic cells.
Experimental analysis of the expression of Connexin-36 in monolayer culture of iGL cell was
carried out to determine the effect of incubation time on the expression of connexin-36 in
monolayer culture of IGL cells. Cells were grown with initial concentration of 100 cells/μL and
then incubated for 0, 12, 18, 30, 54 hours in cell culture plates. After each incubation time, cells
were collected and the mRNA were isolated and then carried out the PCR process. Gene
expression analysis were done using Livak method to measure gene expression levels between
groups. The result show that Connexin-36 were expressed by iGL cells with the highest expression
were at incubation time of 30 hours. However, statistical analysis showed no significant
difference among the incubation period related to connexin-36 gene expression.

Keywords: Connexin-36; Monolayer Culture; iGL

Abstrak
Diabetes mellitus merupakan salah satu penyakit metabolik karena kelainan sekresi insulin yang
ditandai dengan hiperglikemia. Diabetes mellitus tipe 2 memiliki prevalensi cukup tinggi hingga
90% dari kasus diabetes mellitus total. Mekanisme molekuler dari diabetes mellitus banyak diteliti
menggunakan model in vitro, salah satu dengan menggunakan sel insulin-Gaussie Luciferase
J Med Health.2022;4(2):1-5

1
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

(iGL). Sel iGL merupakan sel yang berasal dari sel β pankreas tikus yang dimodifikasi sehingga
mampu mengekspresikan insulin-GLase. Peningkatan sekresi insulin dan koordinasi osilatori saat
sekresi insulin yang terjadi dipengaruhi oleh rangkaian gap junction connexin-36 yang diketahui
diekspresikan oleh sel β pankreas. Penelitian ini dilakukan analisis eksperimental pengujian
ekspresi Connexin-36 pada kultur monolayer sel iGL untuk mengetahui pengaruh waktu inkubasi
terhadap ekspresi connexin-36 pada kultur monolayer sel iGL. Sel ditanam dengan konsentrasi
awal 100 sel/μL kemudian diinkubasi selama 0, 12, 18, 30, 54 jam pada cawan kultur sel.
Selanjutnya, sel diambil dan diisolasi mRNA-nya lalu dilakukan proses PCR. Analisis ekspresi
gen dilakukan dengan metode Livak untuk pengukuran tingkat ekspresi gen antar kelompok. Dari
hasil analisis ekspresi sel iGL pada kultur monolayer diketahui Connexin-36 dapat terekspresi
dengan hasil tertinggi berada pada waktu inkubasi 30 jam. Selanjutnya, dari analisis statistik tidak
menunjukkan perbedaan signifikan antar waktu perlakuan.

Kata kunci: Connexin-36; kultur Monolayer; sel iGL

Pendahuluan
Diabetes mellitus (DM) merupakan salah satu penyakit metabolik karena kelainan sekresi
insulin yang ditandai dengan hiperglikemia. Berdasarkan hasil Riset Kesehatan Dasar tahun 2018,
pada tahun 2017 Indonesia menduduki peringkat ke-6 dunia dengan jumlah penderita DM
terbesar yaitu sebanyak 10,3 juta. Diabetes mellitus tipe 2 memiliki prevalensi cukup tinggi
hingga 90% dari kasus diabetes mellitus total (1).
Salah satu proses patogenik dari diabetes mellitus adalah terjadi kerusakan sel β pankreas
sehingga terjadi gangguan fungsi dan sekresi insulin yang mengakibatkan defisiensi insulin. Pada
awalnya, defisiensi insulin belum menyebabkan diabetes klinis tetapi apabila sel  tidak lagi dapat
menghasilkan sekresi insulin yang cukup maka akan terjadi hiperglikemia dan diabetes (2).
Connexin-36 (Cx36) merupakan protein gap junction yang diekspresikan oleh sel penghasil
insulin. Gap junction merupakan penghubung antar sel sehingga molekul dapat berpindah dari
satu sel ke sel lainnya. Cx36 secara khusus diekspresikan dalam sel saraf dan sel beta pankreas.
Cx-36 dalam sel β pankreas berfungsi sebagai pengatur penting sekresi dan kadar insulin. Apabila
ekspresi pada connexin-36 tinggi maka kandungan pada insulin pun meningkat (3).
Mekanisme molekuler banyak diteliti menggunakan model in vitro salah satunya sel iGL. Sel
iGL merupakan sel yang berasal dari sel β pankreas tikus yang dimodifikasi sehingga mampu

J Med Health.2022;4(2):1-5

2
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

mengekspresikan insulin-GLase. Insulin-Glase merupakan penggabungan antara protein insulin

manusia dan protein Glase yang berfungsi sebagai protein reporter untuk memonitor sekresi
insulin pada sel iGL (4). Sel iGL merupakan cell line yang tergolong baru sehingga belum banyak
yang melakukan penelitian tentang karakteristik sel iGL yang berkaitan dengan fungsi sel β
pankreas dalam sekresi insulin.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah connexin-36 terekspresi pada sel
iGL yang dikultur dengan teknik kultur monolayer.

Metode
Analisis eksperimental pengujian ekspresi Connexin-36 pada kultur monolayer sel iGL
dilakukan dengan teknik PCR yang menggunakan prinsip twostep qRT-PCR. Sampel yang
digunakan dalam penelitian adalah sel iGL dengan konsentrasi 100 sel/µL
1. Kultur sel
Kultur sel dilakukan pada medium sel iGL yang mengandung (RPM11640, 1 mM pyruvic
acid, 5% fetal bovine serum, 500 mM monothioglycerol, dan 200 Mg/mL G-418. Selanjutnya,
Sel iGL dikultur secara 2D atau teknik kultur monolayer kemudian ditrypsin dan dikumpulkan.
Lalu, dihitung menggunakan Luna Automated Cell Counter II dengan konsentrasi 100 sel/µL
pada treated 24 well-plate sebanyak 500 µL.
2. Isolasi RNA
Setelah itu, sel iGL yang sudah dikultur dinkubasi pada suhu 37°C dengan CO2 5%.
Selanjutnya diamati dibawah mikroskop dan sel dikumpulkan untuk dilakukan isolasi RNA
menggunakan kit SV Total RNA Isolation System-Promega. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam
pada suhu -70°C sebelum dilakukan perhitungan konsentrasi mRNA dengan Thermo Scientific-
VARIOSKAN LUX dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm.
3. PCR
Tahap qRT-PCR dilakukan dengan 2 tahap yaitu yang pertama pembuatan cDNA kit yang
dipakai adalah ReverTra AceTM qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (5) dan tahap kedua
yakni pengukuran PCR menggunakan SYBR green dengan menggunakan kit THUNDERBIRDTM
SYBRTM qPCR Mix (6). pengukuran PCR ini menggunakan alat Veriti 96 Well Thermal Cycler
(Applied Biosystems).
J Med Health.2022;4(2):1-5

3
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

Hasil
Kultur sel iGL.
Sel yang sudah diinkubasi selanjutnya dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan
perlakuan waktu 0 jam, 12 jam, 18, jam, 30 jam.

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 1. Hasil Pengamatan Kultur Sel iGL 100 Sel/µL

Waktu inkubasi 0 jam, well plate 3, perbesaran 4x. (b) Waktu inkubasi 12 jam, well plate 3, perbesaran 4x. (c) Waktu inkubasi 18
jam, well plate 3, perbesaran 4x. (d) Waktu inkubasi 30 jam, well plate 3, perbesaran 4x.

J Med Health.2022;4(2):1-5

4
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

PCR
Hasil yang diperoleh pada proses PCR dianalisis dengan metode Livak, yang dapat dilihat pada
grafik dibawah ini.

EKSPRESI
2
1.8
1.6
Ekspresi Connexin-36

1.4
1.2
1
0.8 1.66
0.6
1
0.4
0.58
0.2 0.002 0.33
0
0 12 18 30 54
Perlakuan Waktu

Gambar 2. Grafik Ekspresi Relatif.

Berdasarkan grafik batang diatas terdapat perbedaan ekspresi relatif disetiap perlakuan waktu.
Namun, tidak signifikan yang dibuktikan melalui uji statistik dengan nilai p > 0,05.

Diskusi
Hasil dari pengamatan 0 jam dapat dilihat bentuk sel yang masih bulat dan penyebarannya
merata. Pengamatan berikutnya setelah diinkubasi 12 jam didapatkan bentuk sel yang mulai
padat dari yang sebelumnya, penyebarannya merata dan telihat kepadatannya. Selanjutnya,
pengamatan dilakukkan setelah diinkubasi selama 18 jam dan telihat sel yang memadat,
konfluensinya 50%, dan sudah mulai membentuk saluran antar-sel yang membentuk seperti
“tangan” yang berfungsi sebagai penghubung sel.

J Med Health.2022;4(2):1-5

5
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

Pengamatan setelah diinkubasi 30 jam didapatkan bentuk sel yang semakin memadat dari
sebelumnya, dapat dilihat bentuk sel yang sudah tidak beraturan dan menyebar menyerupai
fibroblast yang semakin banyak dari sebelumnya fungsinya sebagai penghubung antar-sel.
Terakhir pada waktu pengamatan 54 jam yang mana sel tidak lagi dibutuhkan lagi sehingga
menyebabkan kepadatannya menurun.
Peningkatan kepadatan jumlah sel yang sebanding dengan penambahan waktu inkubasi. Dari
hasil pengamatan didapatkan umur sel terbaik pada inkubasi 30 jam.
Setelah di Isolasi RNA selanjutnya dilakukan tahap PCR yang menggunakan β-actin yang
berfungsi sebagai housekeeping gene. Housekeeping gene merupakan gen yang pasti terekspresi
didalam sel target yang dimana menjadi kontrol sel itu sendiri.
Pada proses inkubasi dengan perlakuan waktu 12 jam terjadi penurunan dibandingkan 0 jam
dengan nilai ekspresi 0,58 dan terjadi penurunan kembali pada waktu inkubasi 18 jam senilai
0,002 yang dimana diasumsikan connexin-36 belum terekspresi sepenuhnya. Selain itu, hasil
dari konsentrasi mRNA yang kecil mempengaruhi pada tahap PCR sehingga nilai ekspresinya
menjadi rendah.
Nilai ekspresi tertinggi terjadi pada waktu inkubasi 30 jam yaitu sebesar 1,66, hal tersebut
menandakan connexin-36 sudah terekspresi secara maksimal yang dimana fungsi dari connexin-
36 sendiri sebagai pengatur dari sekresi insulin sehingga apabila insulinnya banyak maka
ekspresi cx-36 semakin tinggi (7).
Pada waktu inkubasi 30 jam sudah terekspresi secara maksimal, hal itu menyebabkan waktu
inkubasi 54 jam terjadi penurunan, sehingga gap junction pada cx-36 tidak lagi dibutuhkan untuk
menghubungkan antar-sel, kemudian menyebabkan ekspresi cx-36 pada waktu inkubasi 54 jam
terjadi penurunan karena sudah tidak lagi mengekspresi secara maksimal (8).
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini belum optimal, dikarenakan terdapat berbagai
keterbatasan seperti jumlah sel yang terisolasi sedikit sehingga jumlah mRNA yang berhasil
diisolasi menjadi sedikit. Oleh karena itu, pengukuran ekspresi gen belum dapat diukur dengan
tepat.

Simpulan

J Med Health.2022;4(2):1-5

6
Journal of Medicine and Health Expression in Monolayer Culture...
Vol. 4 No. 30 Juni 2022
e-ISSN : 2442-5257

Research Article

Berdasarkan hasil penelitian tentang pengaruh waktu inkubasi terhadap ekspresi connexin-36
pada kultur monolayer sel iGL dapat ditarik kesimpulan nilai ekspresi tertinggi berada pada waktu
inkubasi 30 jam dan terendah pada waktu inkubasi 18 jam. Berdasarkan hasil penelitian maka
didapatkan pengaruh waktu inkubasi terhadap ekspresi connexin-36, namun perbedaannya tidak
signifikan dengan nilai p > 0,05.

Daftar Pustaka
1. Ramadhan MA. Patient Empowerment Dan Self-Management Pada Pasien Diabetes Mellitus Tipe 2. J Ilm
Kesehat Sandi Husada. 2019;10(2):331–5.
2. Zhang XF, Tan BKH. Effects of an ethanollic extract of Gynura procumbens on serum glucose, cholesterol
and triglyceride levels in normal and streptozotocin-induced diabetic rats. Singapore Med J. 2000;41(1):9–13.
3. Le Gurun S, Martin D, Formenton A, Maechler P, Caille D, Waeber G, et al. Connexin-36 contributes to
control function of insulin-producing cells. J Biol Chem. 2003;278(39):37690–7.
4. Suzuki T, Kanamori T, Inouye S. Biochemical and Biophysical Research Communications Quantitative
visualization of synchronized insulin secretion from. Biochem Biophys Res Commun [Internet].
2017;486(4):886–92. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.03.105
5. Toyobo. ReverTra Ace TM qPCR RT Master Mix with gDNA remover2004 ReverTra Ace TM qPCR RT
Master Mix with gDNA Remover. 2004; Available from: www.toyobo.co.jp/e/biotech_osaka@toyobo.jp
6. Toyobo. qPCR Mix. 2004;
7. Head WS, Orseth ML, Nunemaker CS, Satin LS, Piston DW, Benninger RKP. Connexin-36 gap junctions
regulate in vivo first- and second-phase insulin secretion dynamics and glucose tolerance in the conscious
mouse. Diabetes. 2012;61(7):1700–7.
8. Cruz-miguel L, Pe EM, Coronel-cruz C, Esparza-aguilar M, Pinzon-estrada E, Rancan E, et al. Connexin 36
is Expressed in Beta and Connexins 26 and 32 in Acinar Cells at the End of the Secondary Transition of Mouse
Pancreatic Development and Increase During Fetal and Perinatal Life. 2012;990:980–90.

J Med Health.2022;4(2):1-5