KAS – stari kolokviji, finalna verzija

A – UVOD, UVJETI, KRIVULJA RASTA

1. Što je histotipska kultura?

To je 3D kultura jednog tipa stanica.

2. Koja je razlika između organotipske kulture i kulture organa? Koje su prednosti organotipske?
Organotipska kultura – različiti tipovi stanica se uzgajaju u 3D strukturi ekstracelularnog matriksa, stanice su
reagregirane u zajedničku strukturu koja nalikuje tkivu ili organu
- jednostavnija i održivija
Kultura organa – 3D kultura cjelovitog tkiva sa svim ili nekim histološkim osobinama istog tkiva in vivo
- kompliciraniji uzgoj (moguće samo privremeno)

3. Navedi 4 primjene kulture u biomedicini i biotehnologiji.

Razvoj lijekova, vakcina, proizvodnja faktora rasta i hormona, genska terapija, proizvodnja umjetnih tkiva (kože) ili
organa (jetre), …

4. Koji su nedostatci kulture in vitro?

Ne postoje tkivni i sistemski odgovor (npr. upala), teško je pratiti utjecaj lijekova (farmakokinetiku) – nemoguće
pratiti metabolizam, prodor u tkivo i izlučivanje, nije moguće oponašati složene organske sustave poput
imunološkog, ne može se potpuno zamijeniti eksperimentima in vivo.

5. Kako se steriliziraju…
a) medij DMEM – sterilni filtri veličine pora 0,22 mikrometra (organske otopine i mediji za uzgoj stanica ne
mogu se autoklavirati jer su termolabilni)
b) staklene pipete – suha sterilizacija (staklo i metal)
c) ependorf epruvete – autoklaviranje
d) fiziološka otopina – autoklaviranje (sve otopine, većina plastike)
e) tikvice – suha sterilizacija ili autoklaviranje
f) tipsevi - autoklaviranje

6. Navedi jedan primjer kako se u biotehnologiji može povećati prinos stanica i njihovih produkata.
Korištenjem bioreaktora sa sustavom cjevčica. Stanice se nalaze između sustava cjevčica kroz koji cirkulira medij.
Preko polupropusne membrane se uklanjaju otpadne molekule iz stanične okoline, a unose se svježi nutrijenti, a u
prostoru između cijevčica se koncentrira stanični produkt.
Ili korištenjem roller boca, CELLline, mikronosača stanica…
 7. Zašto je važan pH, kako ga mjerimo i kako ga održavamo?
Obično iznosi 7,2-7,4 što je izotonično sa stanicama. Kiselost se održava puferima kao što su natrijev
hidrogenkarbonat ili HEPES. Mjeri se pH-metrom.

8. Što koristimo za regulaciju pH u osnovnom mediju?

NaHCO3 (želimo postići pH =7,2-7,4) ili HEPES.

9. Kako djeluje pufer soda bikarbona?

CO2 + voda -> HCO3- + H+ (a u inkubatoru je 5% CO2 koji je u ravnoteži s vodom iz podloge, princip slabe kiseline i
njezine soli)

10. Što je serum, a što plazma?

Serum je tekući dio krvi koji ostane nakon zgrušavanja. Ne sadrži stanice, fibrinogen niti trombocite, ali je bogat
proteinima.
Plazma je serum s faktorima za koagulaciju.

11. Koja je uloga seruma u mediju?

Sadrži faktore rasta, hormone, tvari potrebne za metabolizam stanica (šećeri, ak, lipidi), elemente u tragovima,
tvari za stabilizaciju i detoksifikaciju kulture (albumin, inhibitori proteaza), proteine potrebne za adheziju
(fibronektin) i proteine za prijenos tvari iz okoline u stanicu (albumin, transferin).

12. Zašto mediju dodajemo 5-20% seruma za rast stanične kulture?

Serum je jeftiniji izvor faktora rasta, tvari za stabilizaciju i detoksifikaciju, tvari za transport, primanje za podlogu te
elemenata u tragovima.

13. Komponente seruma – ne brojati detaljno, samo osnovne skupine.

Za rast stanica, za pričvršćivanje na podlogu, elementi u tragovima, za prijenos molekula iz okoline u stanicu, za
detoksifikaciju i stabilizaciju
Tj. ak, proteini, lipidi, šećeri, anorganske soli, vitamini, hormoni, faktori rasta…

14. Komponenta seruma koja služi za prihvaćanje stanica za podlogu je…

Fibronektin.

15. Navedi spoj u nedefiniranom mediju koji služi za prihvaćanje stanica na podlogu.
Glikoproteini (fibronektin). Proteini integrini omogućavanju prihvaćanje za fibronektine.
 16. Kakav je to definirani stanični medij? Navedi 3 razloga zašto ga koristimo?
Definirani stanični medij je medij čije su sve komponente i sastav poznati. Nadomješćuje serum dodavanjem nekih
tvari nužnih za rast: hormoni i faktori rasta (hormoni hipofize, inzulin, steroli, …), peptidni faktori rasta, albumin,
izvor lipida (masne kiseline i kolesterol), elementi u tragovima (željezo, cink, magnezij, …), transferin, faktori za
prihvaćanje na podlogu (fibronektin, kolagen, …), ekstrakt hipofize.
Koristimo ga jer je definiran pa može služiti za proučavanje uloga pojedinih komponenti, sa sigurnošću znamo da
ne sadrži patogene jer su svi sastojci sterilni, nije citotoksičan ili inhibitoran za neke tipove stanica za koje
nedefinirani jest (komplement kao dio imunosnog odgovora).

17. Kako detektiramo da je kultura kontaminirama s mikoplazmama?

Jako se teško detektiraju jer se ne vide svjetlosnim mikroskopom, ali mogu se detektirati bojanjem stanica
Hoechtovom bojom (boja DNA), PCR-om (vide se vrpce i njihovog genetičkog materijala) ili posebnim
mikrobiološkim podlogama za uzgoj mikoplazmi.

18. Kako bi se prepoznala kontaminacija sa svakim patogenom?

a) virusi – citotoksični efekt, stanice ugibaju pa nastaju plakovi u kulturi; PCR-om sa početnicama specifičnima
za sekvencu virusnog genoma, detekcijom antitijelima
b) bakterije – mutno i žuto, prerasle stanice, na mikroskopu specifične sitne čestice prisutne
c) kvascima – bijele nakupine prerasle kulturu, detektiraju se pupovi bojanjem (?)
d) plijesnima – specifičan izgled (zelena boja, tepih)
e) mikoplazmama – Hoectovo bojanje, PCR-om, podlogama za uzgoj mikoplazmi

19. Kako možemo prepoznati kulturu zagađenu bakterijama? Što radimo s njom?
Te kulture su mutne, žute i kisele. Imaju male pokretljive čestice koje se fizički vide u diobi (i brzo rastu). Tu kulturu
bacamo, a ako je zagađena vrlo malo i ukoliko je važno da ju spasimo možemo probati spasiti korištenjem
antibiotika.

20. Što su stanice hranidbenog sloja? Navedi primjer.

To su metabolički aktivne stanice koje se ne dijele, čine podlogu za rast drugih stanica, luče faktore rasta koje
koriste stanice u uzgoju (za proliferaciju i diferencijaciju). Mogu biti homologne ili heterologne stanicama u uzgoju.
Npr. glija za neurone, makrofagi za hibridome za antitijela, fibroblasti za keratinocite.

21. Što je stanična linija?

To je definirana homogena stanična populacija dobivena iz početne kulture ili neke koja je od nje nastala i
prilagođena je rastu u kulturi.

22. Koje su karakteristike normalne stanične linije?

a) nastala diobom iz jednog klona – ne, to je kultura!
b) uniformno okarakterizirane
 c) imortalna – ne, to je tumorska!
d) mora se nasaditi iz primarne kulture ili neke koja je nastala od primarne

23. Stanične linije mogu biti…

Konačne (mortalne) ili beskonačne (kontinuirane)

24. Nabroji 4 stanične linije.

Konačne/mortalne (MRC-5); transformirane (HeLa, 293); leukemijske/tumorske (HL-60).

25. Efikasnost nasađivanja stanica. Kad se koristi u kulturi stanica?

PE – plating efficiency, koliko stanica se prihvatilo na podlogu u odnosu na broj stanica koje smo nasadili. Ne
miješati s CPE (efikasnost nasađivanja kolonija). Određuje se 1-2 h nakon nasađivanja (procjenjuje se da su se tad
stanice adherirale, ali nisu započele diobe).
Koristi se u proučavanju utjecaja citostatika na rast kolonija (imaju manji PE od običnih stanica).

26. Što je PBS, za što se koristi?

PBS je fosfatni pufer koji se koristi za ispiranje stanica prije dodatka tripsina za odljepljvanje stanica od podloge. To
je važno da se uklone svi ostatci medija jer medij sadrži inhibitore tripsina pa neće doći do odljepljivanja od
podloge. Umjesto PBS može se koristiti fiziološka otopina.

27. Što je konfluentnost?

Kažemo da je sloj stanica konfluentan kad stanice prekriju cijelu površinu petrijevke.

28. Što je to kontaktna inhibicija i u kojoj su fazi staničnog ciklusa te stanice? Kod kojeg tipa stanica je nalazimo,
a kod kojih ne?
Pojava da se stanice prestaju dijeliti kad popune cijelu površinu petrijevke (zbog nedostatka prostora). Te stanice
nalaze se u G0 fazi. Kod normalnih stanica nalazimo kontaktnu inhibiciju, ali kod tumorskih ne (rastu u više
slojeva).

29. Što je točno za tumorske stanice:

a) rastu u većoj gustoći od normalnih stanica
b) imaju poremećene kontrolne mehanizme rasta
c) imaju kontaktnu inhibiciju
d) imaju veću potrebu za faktorima rasta
e) mogle bi neograničeno rasti kad dosegnu stacionarnu fazu u kulturi
f) ne stvaraju fokuse

30. Nabroji barem četiri svojstva rasta kulture tumorskih stanica?

Imortalne (beskonačne), rastu u više slojeva, ne nalazimo kontaktnu inhibiciju, mogu rasti u mekom agaru (bez
adheriranja za površinu), rastu u većoj gustoći od normalnih, nemaju mehanizme kontrole rasta.

31. Krivulja rasta tumorskih stanica od normalnih se razlikuje u:

a) lag fazi – ne!
b) log fazi – da, strmija je tumorska!
c) stacionarnoj fazi – da, veće je zasićenje kod tumorskih!
d) uopće se ne razlikuju

32. Za tumorske stanice vrijedi:

a) ostare
b) rastu višeslojno i prestanu s rastom u stacionarnoj fazi
c) ulaze u G0 fazu
d) rastu višeslojno i odlijepe se kad potroše svu podlogu te umru

33. Normalni humani fibroblasti u konfluentnoj kulturi:

a) rastu u više slojeva
b) zaustave se i uđu u G0 fazu
c) ostare
d) ulaze u apoptozu nakon nekoliko dana

34. Koje su razlike u stacionarnoj fazi između normalnih i tumorskih stanica?

Tumorske stanice kasnije dostižu stacionarnu fazu (jer nemaju kontaktnu inhibiciju pa rastu u slojevima – veća im
je gustoća zasićenja).

35. Zašto i kako se mijenja boja standardnog medija u kojem ubrzano rastu stanice?
Medij je obično crven jer sadrži fenolno crvenilo kao indikator kiselosti. Mijenja boju prema ljubičastom u bazičnim
uvjetima (npr. kad izvadimo iz inkubatora).
B – PRIMARNA KULTURA, KARAKTERIZACIJA I KVANTIZACIJA

1. Što je primarna (početna) kultura i kako se može dobiti?

To je kultura koju nasađujemo koristeći uzorak organa, tkiva ili stanica dobivenih direktno iz organizma.
Može se dobiti iz embrionalnog tkiva, normalnog tkiva ili tumorskog tkiva pomoću eksplantata (nasađeni komadići
tkiva) ili nasađivanjem stanica u suspenziji.

2. Koje su osnovne tehnike dobivanja početne kulture?

Iz suspenzije (djelovanje proteolitičkim enzimima) ili iz eksplantata tako da kidamo komadiće.

3. Nabroji barem 3 enzima koja se koriste kod pripreme početne kulture stanica.
tripsin, elastaza, kolagenaza, papain, kimotriosin  razgradnja tkiva

4. Izopikničko centrifugiranje stanica krvi.

Izopikničko centrifugiranje je razdvajanje stanica po gustoći. Tako se mogu odijeliti leukociti – krv se nadsloji
fikolom, a onda se slojevi razdvoje centrifugiranjem tako da na dnu budu crvene krvne stanice, zatim fikol, zatim
bijele krvne stanice i na vrhu plazma.

5. Opiši MACS.
Metoda razdvajanja stanica na temelju staničnih antigena. Na magnetskim zrncima nalaze se specifična antitijela. U
magnetskom polju zadržavaju se stanice obilježene antitijelom – pozitivna i negativna selekcija antitijelima. Na ovaj
način možemo odvojiti B i T limfocite (jer svaki ima karakteristična antitijela).

6. Navedi barem dvije metode razdvajanja stanica antitijelima i objasni njihov princip.
MACS – magnetne kuglice s antitijelima vežu stanične antigene.
panning – podloga ima antitijela i veže stanične antigene

7. Definiraj pojmove:
stanična linija – homogena okarakterizirana populacija stanica prilagođena rastu u kulturi
stanična kolonija – klonovi, stanice nastale iz jedne zajedničke majčinske stanice
stanični soj – dio stanica iz primarne kulture ili stanične linije koje sadrže nekakav specifični marker
primarna kultura stanica – kultura nasađena iz uzorka organa, tkiva ili stanica dobivenih direktno iz organizma

8. Što je pasaža?
Pasaža stanica je proces prijenosa stanica (presađivanje) iz jedne posude kulture u drugu kako bi se održala ili
proširila stanična populacija.

9. Što je PD (population doubling)? Gdje se koristi u kulturi stanica?

PD označava broj populacijskih dioba. Koristi se kod određivanja starosti neke kulture.
Računa se kao logN/No : log2 pri čemu je N = broj stanica nakon određenog vremena, a N0 = broj nasađenih stanica
(početni broj stanica).

10. Zaokruži točno:

a) broj presađivanja je jednak broju dioba
b) broj dioba se može izračunati iz omjera presađivanja i razrjeđenja
c) brzina udvostručenja populacije ne ovisi o fazi u kojoj se nalazi populacija

11. Ljudski fibroblasti nakon 60-90 dioba…

ostare i uđu u G0 fazu; prestanu se dijeliti

12. Koliki je PD ili broj udvostručenja populacije ako je konfluentna kultura presađena 4 puta u omjeru 1:4?
8, jer se populacija mora dva puta podijeliti da bi opet bila konfluentna kultura i onda 2 * 4 pasaže = 8

13. Ako je omjer nasađivanja ¼, a rade se 4 pasaže, koliki je broj dioba?

2*4=8

14. Ako je omjer nasađivanja 1:4, a presadili ste kulturu 5 puta, koliko je dioba prošla populacija?
2*5=10

15. Na brojaču smo izbrojali 80000 stanica/mL. Imamo 10 mL stanične suspenzije. Koliko smo imali ukupno
stanica u petrijevki koju smo tripsinizirali? Kako bismo nasadili 5 malih petrijevki sa po 1*10 5 stanica u
ukupno 2 mL?
U petrijevki tj. u suspenziji je ukupno 800 000 stanica.
Pet malih petrijevki nasađujemo tako da u svaku stavimo 1,25 mL ove stanične suspenzije i onda do 2 mL
nadodamo običnog seruma (0,75 mL). Količina od 1,25 mL ove suspenzije odgovara traženom broju stanica.

16. Ako je broj stanica matične kulture 5*10 4, a njezin volumen 5 mL, kako biste pripremili otopinu za
rasađivanje na 6 petrijevki od 2 mL, tako da na svakoj bude 2*103 stanica?
Na svaku petrijevku dodamo 0,2 mL matične kulture i onda još 1,8 mL seruma.
 17. Kako bi selektirali jednu vrstu stanica pri pripremi početne kulture? Navedi primjer. Opiši jednu metodu
koja koristi antitijela kod selekcije stanica pri pripremi početne kulture.
Može se na više načina: koristeći magnetska zrnca s obilježenim protutijelima za izolaciju jednog tipa stanica (npr.
razdvajanje T od B limfocita) u magnetskom polju jer obilježene stanice zaostaju u kolumni; fluorescentnim
obilježavanjem protutijelima (na temelju naboja se odvajaju stanice u uređaju) ili selektivnim podlogama.
Selekcija se provodi ili koristeći selektivni medij ili podlogu, ili dodavanjem specifičnih faktora rasta ili antibiotika.
U specifične medije mogu se dodati npr. desne aminokiseline ili deoksiglukoza što su molekule koje su toksične za
neke tipove stanica.

18. Kako se može provesti selekcija jednog tipa stanica u kulturi?

Selekcijom antitijelima koja mogu biti u podlozi ili mediju, antibioticima ako se desila transformacija plazmidom, ili
protočnim citometrom.

19. Što je karakterizacija stanica i kako je i zašto radimo?

To je metoda utvrđivanja osnovnih svojstava stanične linije u svrhu identifikacije.
Kriteriji po kojima se stanice karakteriziraju: morfologija, brzina rasta stanica, karakteristike rasta, specifični
markeri, kariogram, tipizacija (autentizacija).
Autentizacija su metode identifikacije, provjera kontaminacije drugom staničnom linijom.

20. Navedi barem 4 metode autentizacije, princip njihova rada i za koji tip autentizacije služe.
RFLP – restriction fragment length polymorphism, analiza minisatelita (20-100 pb), tandemska ponavljanja
minisatelita cijepaju se restrikcijskim endonukleazama i dobivaju se fragmenti različite duljine (restrikcijski
obrasci), za raspoznavanje stanica unutar vrste
PCR – umnažanje mikrosatelita s posebnim početnicama pri čemu dobivamo „profil“ ili „otisak“ DNA, jedinke
unutar vrste imaju različit broj ponavljanja na različitim mjestima u genomu što možemo detektirati
elektroforezom PCR produkata, raspoznavanje jedinki unutar vrste
elektroforeza izoenzima – mogu biti iz različitih tkiva ili organizama, različite su duljine fragmenata na gelu (ali
imaju istu funkciju), usporedba stanica između različitih vrsta
citogenetika (kariotip) – Giemsa bojanje, različite vrste imaju različite uzorke G vrpca na kromosomima, za
usporedbu stanica između različitih vrsta

21. Analiza izoenzima:

a) radi se pomoću PCR
b) pomoću specifičnog cijepanja restrikcijskim enzimima
c) usporedbom molekulske težine enzima proteolitičkom reakcijom
d) služi za usporedbu stanica porijeklom iz različitih vrsta
e) različita tkiva iste jedinke
f) različite jedinke iste vrste

22. Navedi barem 4 metode uporabe antitijela u analizi stanica.

MACS – sortiranje stanica, antitijela vezana za magnetska zrnca, specifična za površinu molekule npr. limfocita T, u
magnetskom polju mogu se razdvojiti od npr. limfocita B koji su neobilježeni
„panning“ – razdvajanje stanica pomoću specifičnih antitijela na petrijevki, vežu se samo stanice s tim antigenima
prepoznavanje apoptoze fluorescentno obilježenim antitijelom aneksinom (prepoznaje fosfatidil-serin, što je
fosfolipid koji na početku apoptoze prelazi iz unutarnje strane membrane na vanjsku)
za karakterizaciju i autentizaciju stanica možemo koristiti fluorescentno obilježena antitijela specifična za
površinske antigene na stanicama određenog podrijetla koje ćemo zatim razdvojiti pomoću protočnog citometra

23. Što su mini i mikrosateliti? Kako se mogu analizirati i za što se upotrebljavaju?

To su tandemske ponavljajuće sekvence, minisateliti su veliki 20 do 100 pb, a ponavljaju se 1000x i ukupne su
veličine 0,5 do 200 kb. Detektiraju se RFLP, hibridizacijom.
Mikrosateliti su tandemske ponavljajuće sekvence od 1 do 3 pb koje se ponavljaju 15 do 100x ukupne veličine 100
do 500 pb. Služe u forenzici, utvrđivanju očinstva, linkage mappingu (detektiraju se PCR-om). Ovisni su o jedinki pa
je moguće uspoređivati samo unutar vrste.

24. Kako bi razdvojili stanice različitih životinja, a kako bi utvrdili da se radi o stanicama iste životinjske vrste?
različite životinje: elektroforeza izoenzima, Giemsa bojanje
iste životinje: fluorescentni PCR mikrosatelita, RFLP analizom minisatelita

25. Što je i kako funkcionira Coulter counter? Koje su prednosti i nedostatci ove metode pred hemocitometrom?
To je brojač stanica koji određuje broj stanica u suspenziji mjerenjem promjene otpora tekućine pri prolasku
stanica između dviju elektroda. Hemocitometrom možemo raditi testove vijabilnosti pomoću bojanja stanica
bojama koje specifično bojaju žive ili mrtve stanice što Coulter counterom ne možemo. Ipak Coulter counter je
točniji način brojanja stanica jer broj mjeri uređaj, a stanice na hemocitometru broji čovjek.

26. Što je proliferacijski indeks?

Indeks proliferacije izračunava se kao zbroj stanica u svim generacijama uključujući roditeljsku podijeljen s
početnim brojem stanica. To je mjera višestrukog povećanja broja stanica u kulturi tijekom eksperimenta.

27. Koji testovi vijabilnosti detektiraju žive stanice?

a) tripansko modrilo
b) propidij jodid
c) MTT
d) fluorescein diacetat
e) LDH

28. Dvije boje za detekciju živih i mrtvih stanica.

Fluorescein diacetat – esteraza unutar živih stanica cijepa diacetat pa se vidi zelena fluorescencija
Hoecht – boji žive stanice
Propidij jodid – ulazi u mrtve stanice koje ga ne mogu ispumpavati pa se vidi crvena fluorescencija
Tripansko modrilo – boji mrtve stanice

29. Kako se razlikuju žive i mrtve stanice u suspenziji?

Možemo napraviti test isključivanja (ekskluzije) boje pri čemu će se mrtve stanice obojiti ili centrifugirati
suspenziju pri čemu će mrtve stanice formirati talog dok će žive stanice biti iznad njih.

30. Kako laktat dehidrogenaza služi u mjerenju vijabilnosti stanica? Opiši.

Nekrotične stanice (kad im je oštećena membrana) ispuštaju u okolinu enzim laktat dehidrogenazu (piruvat +
NADH + H+ -> laktat + NAD+). Spektrofotometrijski (pri 340 nm) mjerimo aktivnost LDH odnosno potrošnju NADH.
Veći pad A znači i veći pad NADH što znači da su stanice ispustile više LDH u okolinu što znači da je udio mrtvih
stanica veći. Kao kontrola se koriste ploče sa živim i mrtvim stanicama.

31. Objasni princip metaboličkih testova i navedi primjer.

To su testovi kojima se utvrđuje razina metabolizma, odnosno funkcionalnost odabranog metaboličkog puta u
nekoj kulturi, a time i vijabilnost stanica. Stanicama se dodaje supstrat koji enzimi živih stanica pretvaraju u
produkt drugačije boje ili apsorbancije od supstrata. Prema intenzitetu apsorbancije dobiva se informacija o broju
živih stanica. Npr. MTT, neutralno crvenilo.

32. MTT test:

a) boji sve stanice
b) boji žive
c) boji mrtve
d) ovisi o mitohondrijskom enzimu
e) ovisi o otpuštanju LDH
f) mjeri se spektrofotometrijski

33. Usporedite MTT i testove preživljavanja te navedite prednosti i mane.

MTT je test vijabilnosti stanica koji je kratkoročan za razliku od testova preživljenja stanica koji su dugoročni. Kod
testova vijabilnosti se mjeri broj živih stanica, ali se ne uzima u obzir mogućnost da su neke stanice oštećene i
nemaju sposobnost diobe, dok se kod testova preživljenja gleda i sposobnost regeneracije stanica, mogućnost da su
oštećene, ugl. preživljenje kroz duži period.
Prednosti MTT su što je metoda brza, jednostavna, jeftina i što se može analizirati veliki broj uzoraka malog
volumena. Mane MTT su što je to test vijabilnosti. Testovi preživljenja zahtijevaju više vremena, ali su rezultati
točniji.

34. Usporedi pozitivna i negativna svojstva metoda kočenja rasta stanica i kočenja rasta kolonija.
Kod kočenja rasta stanica dobiva se kratkoročni odgovor, ali su metode brže, potrebna je manja količina uzorka.
Kod kočenja rasta kolonija dobiva se dugoročni odgovor i može se vidjeti ne samo da li su stanice vijabilne nego i da
li su sposobne za diobu i proliferaciju.
35. Efikasnost nasađivanja stanica i kolonija – koje je bolje promatrati?
Efikasnost nasađivanja stanica = PE, efikasnost nasađivanja kolonija = CPE. Bolje je promatrati CPE jer tako
možemo izračunati preživljenje stanica brojanjem kolonija koje su nastale iz tih stanica.

36. Objasni princip metode praćenja preživljenja stanica brojanjem kolonija. Koje su prednosti, a koji nedostatci
ove metode?
Preživljenje se može izračunati kao omjer efikasnosti nasađivanja kolonija tretirane kulture i efikasnosti
nasađivanja kolonija kontrolne kulture.
Prednosti ove metode su što je praćenje preživljenja stanica pouzdanije od testova vijabilnosti i što njime možemo
usporediti sposobnost proliferacije stanica dok sa testovima vijailnosti možemo samo vidjeti koliko su stanice
otporne na neku tvar. Daje dugoročne informacije o kulturi, imaju mogućnost pretpostavke da su neke stanice
oštećene, nemaju mogućnost diobe itd.
Nedostaci su što ova metoda zahtijeva više vremena od testova vijabilnosti.

37. Kako se mogu izolirati kolonije stanica na dva načina?

Selektivnim prstenom i tripsinizacijom stanica, selektivnim ubijanjem (radioaktivnost, zračenje), razrjeđivanjem
suspenzije toliko da dobijemo jednu stanicu koju dalje nasađujemo i uzgajamo koloniju.

38. Opiši eksperiment u kojem bi se proučavao učinak citostatika na preživljenje stanica.

U jednoj petrijevki bi se uzgajala kontrolna kultura koja se ne tretira citostatikom, a u ostalim petrijevkama bi se
uzgajale stanice u prisustvu različitih koncentracija citostatika.

39. Opiši cijeli pokus počevši od nasađivanja i tretiranja s adriamicinom. Nacrtaj graf preživljenja i odredi
volumene/koncentracije adriamicina koje koristimo ako je stock 2 mM.
C – SINKRONIZACIJA I FUZIJA
1. Nacrtaj shemu staničnog ciklusa i okvirno trajanje pojedinih faza.
G1 – 10 h (označi R točku pri kraju ove faze!), S – 9 h, G2 – 4 h, M – 1 h
Shema je ona pita koja ima na prezentaciji.

2. Kako možemo sinkronizirati stanice (2 načina)?

Selekcija stanica u pojedinoj fazi ciklusa – samo s mitotskim stanicama jer se jedine mogu razlikovati (odvajanje
potresanjem).
Zaustavljanjem progresije (inhibicija ciklusa korištenjem citostatika) – inhibitor zaustavlja stanice u određenoj fazi
dok ostale stanice nastavljaju ciklus dok ne dođu u tu istu fazu, kad maknemo inhibitor (citostatik) sve stanice
kreću od iste faze u kojoj ih je inhibitor zaustavio.

3. U kojoj se fazi staničnog ciklusa stanice mogu fizički odvojiti i analizirati? Može li se to napraviti sa svim
tipovima stanica i zašto?
U mitozi. Tad su stanice slabije vezane za podlogu. Ne može se napraviti sa svim tipovima stanica jer su neke jače
vezane proteinima za podlogu, a ne može ni sa stanicama u suspenziji.

4. Ako smo stanice (vrijeme duplikacije 24h) sinkronizirali pomoću visoke koncentracije timidina, 16 sati
nakon ispiranja te tvari i dodavanja normalnog medija sa serumom, većina će se stanica nalaziti u:
a) G2
b) G2+M
c) G1
d) G0

5. Ako smo stanice sinkronizirali pomoću visoke koncentracije timidina i zatim im promijenili medij, nakon 5
h će se nalaziti u:
a) G1
b) G2
c) S
d) M
e) G0

6. Koliko vremena treba stanici da bude u mitotskoj fazi ako se doda hidroksiurea?
13nakon uklanjanja hidroksiuree ili manje (ovisi o tome gdje se zaustavila S faza).

7. Nakon koliko će sati stanica biti u G1 fazi ako se na nju djeluje hidroksiureom?
9h + 4 h + 1 h = 14 h ili manje (ovisi o tome gdje se zaustavila S faza).

8. Asinkrone stanice imaju postotak stanica u mitozi…

1-5 %

9. Koji su inhibitori svake pojedine faze?

G1 – restrikcijska točka, metabolički inhibitori ili nepovoljni uvjeti za proliferaciju (nedostatak faktora rasta,
medija, aminokiselina, kontaktna inhibicija)
S – visoka koncentracija timidina, fluordeoksiuridin, hidroksiurea, ametopterin, afidikolin
G2/M – nokodazol
M – inhibitori polimerizacije mikrotubula (kolhicin i kolcemid, vinblastin i vinkristin, nokodazol)

10. Što je restrikcijska točka?

R točka, kontrolna točka u G1 fazi u kojoj će se stanice zaustaviti i otići u fazu mirovanja G0 ukoliko uvjeti nisu
povoljni za proliferaciju – kontaktna inhibicija, nedostatak aminokiselina ili faktora rasta.

11. Iz koje faze možemo ući u fazu mirovanja i kako se opet možemo vratiti u ciklus?
Iz G1 možemo ući u fazu mirovanja ukoliko nisu povoljni uvjeti rasta – nema faktora rasta, aminokiselina ili seruma
u mediju. To prepoznaje R točka.
Možemo se opet vratiti u ciklus kad se nadoda to što je nedostajalo ili dodavanjem ciklina D.

12. Koja molekula potiče prelazak preko R točke?

Ciklin D.

13. Čime sve inhibiramo stanice u S fazi?

visoka koncentracija timidina – zaustavlja sintezu nukleotida mehanizmom povratne sprege
fluordeoksiuridin – inhibira timidilat sintazu
hidroksiurea – inhibira ribonukleotid reduktazu
ametopterin (metotreksat) – inhibira dihidrofolat reduktazu
afidikolin – inhibira DNA polimerazu alfa

14. Citostatici koji zaustavljaju stanični ciklus u S fazi temelje se na:

a) inhibiraju sintezu ribonukleotida
b) inhibiraju sintezu deoksiribonukleotida
c) …

15. Kako djeluju hidroksiurea i adriamicin i gdje se koriste?

hidroksiurea – inhibira ribonukleotid reduktazu, adriamicin – inhibira DNA polimerazu I i topoizomerazu II
Koriste se u inhibiciji S faze ciklusa.

16. Adriamicin:
a) koristi se u kulturi za sinkronizaciju stanica
b) inhibira diobeno vreteno
c) inhibira DNA polimerizaciju
d) inhibira topoizomerazu
e) interkalira se u DNA

17. Ametopterin (metotreksat):

a) inhibira dihidrofolat reduktazu
b) inhibira de novo sintezu deoksinukleotida
c) inhibira puteve spašavanja
d) inhibira ribonukleotid reduktazu
e) a+b
f) d+c
g) a+c

18. Kako djeluje metotreksat na stanice i kada se on koristi?

Citostatik. Inaktivira glavni put de novo sinteze deoksiribonukleotida jer inaktivira dihidrofolat reduktazu koja
pretvara dihidrofolat u tetrahidrofolat koji je glavni prenositelj metilnih skupina na nukleotide. Dodaje se kada se
radi selekcija na HAT mediju za fuzioniranje stanica ili proizvodnju monoklonskih protutijela.

19. Navedi dva načina kojima možemo pratiti sinkronizaciju stanica. Kako sve možemo odrediti postotak
proliferirajućih stanica u kulturi? (2 verzije istog pitanja)
praćenjem mitotskog indeksa
imunobojanjem sa fluorescentno obilježenim antitijelima na cikline (postoje ciklini karakteristični za svaku fazu
ciklusa)
pulsnom ugradnjom H3-timidina ili BrdU – praćenje sinteze DNA
protočni citometar (fluorescencijski razvrstavač stanica)

20. Načini praćenja DNA sinteze.

Pulsna ugradnja radioaktivno označenog timidina u DNA – radiografija
Pulsna ugradnja BrdU u DNA i detekcija s posebno fluorescentno označenim protutijelima
Specifično imunobojanje molekula Ki67 i PCNA (DNA markeri za sintezu).
Protočna citometrija.

21. Objasni princip praćenja staničnog ciklusa pomoću protočnog citometra u dvije rečenice.
Stanice se boje propidij jodidom ili Hoechtom (bojaju DNA) te se intenzitet boje mjeri protočnim citometrom. Iz
podataka se može napraviti graf ovisnosti broja stanica o intenzitetu obojenja (pri čemu je poznato koje obojenje
odgovara kolikoj DNA) pa će površina ispod grafa odgovara broju stanica u toj fazi.

22. 2 uloge protočnog citometra

odvajanje stanica, provjeravanje sinkronosti

23. Objasni metodu pulsnog obilježavanja DNA – kako se sve može raditi, koji je cilj?
Cilj je odrediti postotak stanica koje su u fazi sinteze – koristi se za praćenje sinkronizacije. Radi se na dva načina:
dodatkom radioaktivnog timidina (kojeg detektiramo autoradiografijom) ili dodatkom BrdU koji je analog timidina
i onda ga detektiramo fluorescentno obilježenim specifičnim antitijelima. Dobije se trenutna ugradnja, tj. udio
stanica u sintezi.

24. Kada se koristi dvostruka inhibicija?

Kako bi povećali udio sinkronih stanica u S fazi (S faza je jako duga pa je sinkronost teže postići). Stanice koje su u S
dodatkom citostatika će se zaustaviti momentalno, a one koje nisu u S zaustavit će se kad dođu na početak S faze.
Zbog dugog trajanja te faze imat ćemo nedovoljno sinkronizirane stanice – neke su na početku S faze, neke na kraju
itd. Zato se onda uklanja citostatik, i to na vrijeme dulje od trajanja S faze (kako bi sve sigurno izašle iz te faze).
Onda se opet dodaje citostatik i stanice se zaustavljaju kad opet uđu u S fazu.

25. Što znači „postotak obilježenih mitoza“? Kako se dobiva i za što služi?
Postotak stanica koje su u G2 fazi. Služi za određivanje relativnog vremena pojedine faze staničnog ciklusa
(određivanje duljine G2 faze).
Pulsno obilježavamo DNA s radioaktivnim H3-timidinom ili BrdU (svako sat vremena obilježavamo na pola h) i
onda dobijemo stanice označene u S fazi. Praćenjem omjera pojedinih stanica u pojedinoj fazi u odnosu na ukupni
broj stanica, dobiva se relativno vrijeme trajanja te faze u odnosu na ciklus. G1 je jedina faza koja se ne može
odrediti pomoću grafa pa se računa oduzimanjem vremena trajanja ostalih faza od ukupnog vremena trajanja
ciklusa.

26. Koja je razlika između prolazne i trajne transfekcije stanica? Kako se uzgajaju trajno transficirane?
Prolazno transficirane stanice dobile su gen kojim mogu sintetizirati neki protein, ali on nije trajno integriran u
kromosomsku DNA – promjena nije trajna. Nakon nekog vremena genetički materijal koji je ovako ušao u stanicu se
izgubi (razgradi u stanici).
Trajno transficirane stanice imaju gen od interesa ugrađen u DNA trajno.
Trajna transfekcija detektira se tako što se nakon 48 h počne dodavati antibiotik (npr. geneticin) pa umiru sve
stanice osim onih koje su primile i ugradile plazmid koji ima gen od interesa i gen za rezistenciju na antibiotik
(selektivni marker koji najčešće također uvodimo u genom domaćina ovom metodom).

27. Navedi neke primjere staničnih fuzija u organizmu.

Oplodnja jajne stanice, nastanak sinciciotrofoblasta, sparivanje kvasaca, fuzija mišićnih stanica, fuzija stanica leće.

28. Objasni pojmove:

sinkarion – stanica nastala fuzioniranjem dvije stanice, pri čemu se dogodila fuzija jezgri
heterokarion – stanica nastala fuzioniranjem dviju različitih stanica (različiti stanični tipovi), pri čemu se dogodila
fuzija citoplazmi, ali ne i jezgri
homokarion - stanica nastala fuzioniranjem dviju istovrsnih stanica (isti stanični tipovi), pri čemu se dogodila fuzija
citoplazmi, ali ne i jezgri

29. Sinkarion je stanica sa spojenim jezgrama, a prethodi mu nastanak heterokariona ili homokariona.

30. Što su i za što služe putevi spašavanja?

Alternativni putevi sinteze nukleotida (sinteza iz metaboličkog otpada) iz već stvorenih prekursora kako stanica ne
bi umrla ako je blokiran de novo put sinteze preko nekih citostatika.

31. Što znači HAT i čemu služe njegove komponente?

HAT je selektivna podloga koja sadrži hipoksantin, timidin i metotreksat. To je selektivni medij za hibridne stanice -
fuzionirale dvije stanice koje su TK- i HGPRT-. Metotreksat u podlozi inhibira de novo sintezu nukleotida zbog čega
na podlozi mogu preživjeti samo stanice koje mogu koristiti puteve spašavanja odnosno fuzionirane stanice (jer
dođe do komplementacije) dok TK- i HGPRT- mutanti ne mogu.
Ovako se selektiraju hibridomi, tj. stanice mijeloma miša (imortalne) fuzionirane sa B limfocitima miša (proizvode
antitijela).

32. TK- i HGPRT- selekcija.

TK- i HGPRT- mutanti ne mogu rasti na HAT mediju (sadrži metotreksat), ali njihovi hibridi mogu rasti, dakle
fuzionirana stanica koja je TK- i HGPRT-.

33. Nacrtaj/opiši produkciju monoklonskih antitijela. Razlika humanih i mišjih stanica.

Hibridomi su stanice nastale fuzijom stanica mijeloma miša (TK-, imortalne) i B limfocita miša (imunizirane na neki
protein, ne stvaraju antitijela). Fuzijom dobivamo imortalne hibridne stanice koje proizvode monoklonska
antitijela.
Slika skripta str. 29. ili 31.

34. Primjena HAT medija.

Za proizvodnju monoklonskih protutijela selekcijom hibridoma stanica ili općenito za selekciju fuzioniranih
stanica.
D – DIFERENCIJACIJA
1. Navedi 4 tvari koje mogu u kulturi diferencirati stanice.
Natrijev butirat, DMSO, faktori rasta (TGF), steroidni hormoni, vitamini D i E.

2. Što je rast u mekom agaru?

Rast na mekom agaru karakterističan je za tumorske stanice. One su neovisne o usidrenju – za razliku od normalnih
stanica, ne zahtijevaju podlogu (normalne rastu adherentno i ugibaju bez podloge). Tumorske stanice mogu rasti u
mekom agaru bez podloge gdje stvaraju nakupine, agar ih samo pridržava kako bi bile imobilizirane u prostoru.
One to mogu jer su izgubile neke mehanizme kontrole rasta.

3. Karakteristike starih stanica. Koje se promjene događaju kod starenja kulture?

Veći omjer citoplazme i jezgre, velika vakuola, nakupljaju markere kao što je beta galaktozidaza, p16 i p21
(inhibitori staničnog ciklusa), porast broja proteaza.

4. U starenju se povećava količina…

p16 i p21, proteaza.

5. Što je stanični fokus?

To je nakupina tumorskih stanica koja je vidljiva golim okom jer one nemaju kontaktnu inhibiciju pa rastu u više od
jednog sloja (rastu jedna preko druge).

6. Telomeraza je:
a) DNA ovisna DNA pol
b) RNA ovisna DNA pol
c) DNA ovisna RNA pol
d) terminalna transferaza
e) reverzna transkriptaza
f) egzonukleaza

7. Pokus razlikovanja mortalnih i imortalnih stanica.

8. Navedi primjer i čitav pokus diferencijacije neke stanice po želji. Što ste dodali? Što je nastalo?
F9 teratokarcinom. Opisano kasnije.

9. Navedi tvari koje mogu diferencirati stanice u kulturi.

Planarno-polarni spojevi, citotoksične tvari, modifikatori prijenosa signala, steroidi, peptidni hormoni, citokini i
faktori rasta, vitamini, minerali.
 10. Što je transformacija stanica?
Transformacija je spontana ili inducirana trajna fenotipska promjena koja se događa kao posljedica nasljednih
promjena u DNA i genskoj ekspresiji. Povezana je s genetskom nestabilnošću, a fenotipske promjene do kojih dolazi
najčešće su imortalizacija, poremećaj u kontroli rasta ili malignost (tumorigeničnost).

11. Objasni pojmove:

Transformirane stanice – stanice kod kojih se dogodila spontana ili inducirana trajna fenotipska promjena kao
posljedica promjena u DNA i genskoj ekspresiji
Afidikolin – citostatik koji inhibira DNA polimerazu alfa i zaustavlja stanični ciklus u S fazi.

12. Koja je razlika procesa starenja i terminalne diferencijacije?

Terminalno diferencirane stanice ne diferenciraju se dalje i ne dijele, već obavljaju neku funkciju (npr. srčane
mišićne, živčane stanice). Starenje je ireverzibilni zastoj proliferacije kad stanica dosegne Haylickov limit –
maksimalan broj dioba koliko može proći. Te stanice obično su zakočene u G1 fazi. Terminalno diferencirane
stanice će također stariti.

13. Indukcija diferencijacije F9 stanica.

Induciramo diferencijaciju stanica mišjeg teratokarcinoma F9 tako da ih izlažemo retinoičnoj kiselini i cAMP
(pojačava djelovanje retinoične kiseline). Stanice prolaze kroz diferencijaciju – početni fenotip je primitivnog
endoderma, a konačni parijetalni endoderm. Prestaju lučiti alkalnu fosfatazu i laktat dehidrogenazu. Počinju
proizvoditi neke komponente ekstracelularnog matriksa kao što su laminin i kolagen te proizvode tkivni
plazminogenski aktivator (enzim koji aktivira plazminogen koji postaje plazmin, proteaza koja cijepa
ekstracelularni matriks).

14. Uzgoj keratinocita.

Uzgajamo ih na fibroblastima koji se nasade na matriks nalik ekstracelularnom (posebna želatinozna tvar) –
nastaje struktura slična splavi. Keratinociti s gornje strane imaju zračnu fazu, a s donje dobivaju hranu, baš kao i u
organizmu. U mediju se nalazi i keratinocitni faktor rasta. Nastaje višeslojna struktura nalik pločastom epitelu
Ako bi keratinocite uzgajali na plastičnoj podlozi i bez KGF (keratinocitni faktor rasta), onda ne bi došlo do
diferencijacije i ostale bi u jednom sloju.

15. Kako se na tri načina dokazuje tumorigeničnost stanica? Tri eksperimenta dokazivanja.
Rast u mekom agaru, rast fokusa (gubitak kontaktne inhibicije), rast tumora u imunosuprimiranom mišu in vivo.

16. Što znači pojam imortalizacija?

Genetička ili epigenetička promjena u stanicama u kulturi koja rezultira time da te stanice više nemaju Haylickov
limit (limit koliko puta se mogu podijeliti) – dakle, te se stanice u kulturi dijele neograničeno, bez ulaska u
stacionarnu fazu. Nastaje beskonačna linija.