Carbohydrate Analysis

(Phân tích carbohydrate)

GVHD: Phạm Thị Hoàn

Email: hoanpt@hcmute.edu.vn
1
 CONTENTS
1. Definitions & classification
2. Carbohydrate Contents in Foods and
Importance of Carbohydrate analysis
3. Sample preparation
4. Methods of Carbohydrate analysis
5. Comparison of methods

2
Definition & classification
Definition:
Cm(H2O)n
CxHyOz

Classification:
 Digestible carbohydrates: Starch
(C → monosaccharides)
 Nondigestible polysaccharides: fiber

3
 Classification
Loại Nguồn gốc – công Monomer
Carbohydrate dụng

Monsaccharide
D - Glucose Có trong mật ong, trái
(Dextrose) cây, syrup, sản phẩm
thủy phân của đường
sucrose…

D - Fructose Có trong mật ong, trái

cây, high-fructose syrup,
sản phẩm thủy phân của
đường sucrose…
4
 Classification
Sugar – alcohol Sản phẩm hydro hóa của
(Sorbitol & xylitol) đường đơn, cho vào thực
phẩm làm chất giữ ẩm,
tạo ngọt,…

Disaccharides
Sucrose Có trong mật ong, trái D-Glucose
cây, tế bào rau quả,… &D-
Fructose
Lactose Có trong sữa & các sản D-Glucose
phẩm từ sữa & D-
Galactose
Maltose Có trong malt và các loại D-Glucose
syrup, maltodetrin,..
5
6
 Classification
Oligosaccharides (U3-U10)
Maltooligosaccharide Maltodextrin, glucose D-Glucose
syrup &D-Fructose
Raffinose Chiếm tỷ lệ thấp trong D-Glucose ,
đậu D-Fructose
&
D-Galactose
Stachyose Chiếm tỷ lệ thấp trong D-Glucose ,
đậu D-Fructose
&
D-Galactose
Polysaccharides (90%: U30-U60000)
Tinh bột Có nhiều trong ngũ D-Glucose
cốc,.. 7
 Classification
Hợp chất keo
Carboxylmethyl Phụ gia thực phẩm
-cellulose (CMC)
Carragenan Phụ gia thực phẩm
Gellan Phụ gia thực phẩm
Gum arabic Phụ gia thực phẩm
Pectin Phụ gia thực phẩm
Polymer thành tế bào
Pectin (tan)
Cellulose
Hemi-cellulose
8
Carbohydrate Contents in Foods
Loại thực phẩm Phần trăm (%)
Ngũ cốc-Bánh mì
Ngũ cốc 80,4
Bánh mì 50,6
Sữa & các sản phẩm từ sữa
Kem 28,2
Sữa lỏng 4,7
Yagurt 7,0
9
Carbohydrate Contents in Foods
Loại thực phẩm Phần trăm (%)
Trái cây – Rau quả
Nho 17,2
Táo 13,8
Carrot 9,6
Cà chua 4,2
Thịt - Cá
Cá phi lê 17,0
Thị bò 4,0
Thịt gà 0,0
10
 Importance of
Carbohydrate analysis
1. Quản lý chất lượng sản phẩm hoặc trong
nghiên cứu: Kiểm tra độ chính xác của
thành phần nguyên liệu hoặc thành phần
một chất phân tích nào đó (β-glucan).

2. Tính toán giá trị dinh dưỡng của sản phẩm

3. Kiểm định chất lượng sản phẩm: Kiểm tra độ

chính xác của thành phần nguyên liệu so với
thông tin trên bao bì sản phẩm.

C tổng = M (bđ) – Pr – F – Moisture - Ash 12

 Sample preparation
- Sấy

- Nghiền

- Trích ly loại chất béo

- Trích ly mono-oligo saccharide bằng cồn 80o

13
Trích ly đường từ nguyên liệu
- Nguyên liệu Không chứa nhiều tinh bột,
inulin (trái cây, rau) → trích ly với nước nóng
nhiều lần
- Nguyên liệu giàu protein (thịt, đậu) → Kết tủa
protein bằng tricloacetic 10%, sau đó trung
hòa bằng NaOH 5% → lấy dịch lọc chứa
đường
- Nguyên liệu giàu tinh bột ( khoai, sắn) →
Trích ly đường bằng cồn 70-80 độ
- Nguyên liệu giàu acid hữu cơ ( cà chua,
dứa...) → cần trung hòa acid hữu cơ bằng
NaOH 5%, vì acid hữu cơ có thể thủy phân
Sucrose thành đường khử.
14
Methods of Carbohydrate analysis
1. Định lượng mono & oligosaccharides:

- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid

Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method;

PP khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

1. Định lượng tinh bột

2. Định lượng chất xơ

15
Methods of Carbohydrate analysis
 Định lượng mono & oligosaccharides:
- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method; PP

khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

 Định lượng tinh bột

 Định lượng chất xơ

16
For determination of any mono- (glucose,
fructose), di- (sucrose, lactose, maltose), tri-
(raffinose), tetra- (stachyose), or other
oligo- (maltodextrins) saccharides present,
the dried, lipid-free sample is extracted with
hot 80% ethanol (final concentration) in
the presence of precipitated calcium
carbonate to neutralize any acidity (AOAC
Method 922.02, 925.05).

17
Methods of Carbohydrate analysis
 Định lượng mono & oligosaccharides:
- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method; DNS,

Munson–Walker, ….);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

 Định lượng tinh bột

 Định lượng chất xơ
18
1.1. Phenol-Sulfuric Acid (Total
Carbohydrate)
- Principle
+/ Carbohydrates are destroyed by strong
acids and/or high temperatures.

19
+/ These products then condense with
themselves and other products to produce
brown and black substances.

They will condense with various phenolic

compounds, such as phenol, resorcinol, orcinol, α-naphthol,
and napthoresorcinol, and with various aromatic
amines, such as aniline and o-toluidine, to produce
colored compounds
20
 Procedure
1. A clear, aqueous solution of carbohydrate(s) is
transferred using a pipette into a small tube.
A blank of water also is prepared.

2. An aqueous solution of phenol is added, and

the contents are mixed.

3. Concentrated sulfuric acid is added rapidly to

the tube so that the stream produces good mixing.
A yellow-orange color results.

4. Absorbance is measured at 490 nm.

5. The average absorbance of the blanks is

subtracted, and the amount of sugar is determined
by reference to a standard curve (the same sugars/
D-glucose). 21
1.1. Phenol-Sulfuric Acid
- Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện, chính xác;
hóa chất không đắt, luôn sẵn có và bền.

- Nhược điểm: sử dụng hóa chất độc hại,

Cần phải xây dựng đường chuẩn

22
Methods of Carbohydrate analysis
1. Định lượng mono & oligosaccharides:

- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid

Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method;

PP khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

1. Định lượng tinh bột

2. Định lượng chất xơ

23
 1.2. Total Reducing Sugar
(Định lượng đường khử)
 PP Somogyi–Nelson

 PP quang phổ so màu với thuốc thử DNS

 PP Munson–Walker

 PP chuẩn độ oxy hóa khử với kali

ferrycyanure

24
Reducing sugars
Reducing sugars are those mono- and
oligosaccharides that contain a free
carbonyl (aldehydo or keto) group and,
therefore, can act as reducing agents.

25
 Đường khử
 Đường có chứa nhóm chức aldehydo
(CHO) có khả năng cho electron
 Đường có chứa nhóm chức keto (CO)
trong môi trường kiềm cũng có tính khử.
 Các oligosaccharide và Polysaccharide dễ
dàng bị thủy phân tạo ra các
monosaccharide.

26
2.1. Somogyi–Nelson method
- Nguyên tắc: đường khử khử Cu2+ thành
Cu+, Cu+ tạo phức có màu (blue) với hỗn
hợp ammonium molybdate (NH4)6Mo7O24
& sodium arsenate Na2HAsO7 và màu hỗn
hợp này được xác định bằng cách đo A ở
bước sóng 520 nm

27
- Tiến hành (Procedure):
1. A solution of copper(II) sulfate and an alkaline buffer
are added by pipettes to a solution of reducing sugars(s)
and a water blank.

2. The resulting solution is heated in a boiling water bath.

3. A reagent prepared by mixing solutions of acidic

ammonium molybdate and sodium arsenate is added.

4. After mixing, dilution, and remixing, absorbance is

measured at 520 nm.
5. After subtracting the absorbance of the reagent
blank, the A250 is converted into glucose equivalents using
a standard plot of micrograms of glucose vs. absorbance. 28
2.2 PP quang phổ so màu với thuốc thử
DNS (dinitrosalicylic acid method)
- Nguyên tắc: đường khử phản ứng và tạo
màu (reddish) với thuốc thử DNS. Cường
độ màu của phức này được xác định bằng
cách đo A ở bước sóng 540 nm. Dựa vào
phương trình đường chuẩn sẽ xác định được
hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm.
- Tiến hành:
▪ Hoa chất: Nước, NaOH, DNS, Natrikali tartrat
▪ Màu sản phẩm phản ứng: vàng cam
▪ Bước sóng hấp thu: 540 nm
29
2.3. The Munson–Walker method
- Nguyên tắc: the reduction of Cu(II) ions in alkaline
solution to Cu(I) ions that precipitate as the brick-red
oxide Cu2O which can be determined:
+ gravimetrically (AOAC Method 31.039)
+ by titration with sodium thiosulfate (Na2S2O3)
(AOAC Method 31.040)
+ by titration with potassium permanganate
(KMnO4) (AOAC Method 31.042)
+ by titration in the presence of methylene blue (the
Lane–Eynon method AOAC Method 923.09, 920.183b),
+ and electrolytically (AOAC Method 31.044).
...must be used with standard curves
30
2.4. PP chuẩn độ oxy hóa khử với kali
ferrycyanure
- Nguyên tắc: Khi cho ferrycyanure
K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, sản
phẩm thu được là ferrocyanure.
- Tiến hành:
 Hóa chất: K3Fe(CN)6 1%, Đường glucose
0,5% (w/v), NaOH 5%; 2,5N, HCl 5%,
CCl3COOH 10%, Methyl red 1% , Methylen
blue 0,04%
 Màu sản phẩm phản ứng: Vàng chanh → mất
màu (30 giây) → vàng rơm nhạt
31
Phương trình phản ứng:
CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 +
2NaOH →
CH2OH-(CHOH)4-COONa +
NaK3Fe(CN)6 + H2O

32
Methods of Carbohydrate analysis
1. Định lượng mono & oligosaccharides:

- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid

Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method;

PP khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

1. Định lượng tinh bột

2. Định lượng chất xơ

33
High-performance liquid chromatography
Ion-exchange HPLC
Reversed-phase HPLC

37
sugars must be converted into
volatile derivatives
Methods of Carbohydrate analysis
 Định lượng mono & oligosaccharides:
- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method; PP

khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

 Định lượng tinh bột

 Định lượng chất xơ

49
51
52
53
54
55
56
57
Some information about modification

Enzymic methods
 Enzymic Methods
(Định lượng tinh bột)
- Nguyên tắc: thủy phân hoàn toàn tinh bột
thành glucose, sau đó xác định hàm lượng
glucose bằng phương pháp enzyme. Glucose
(sau thủy phân) sẽ phản ứng với oxidase-
peroxidase tạo thành hợp chất có màu và được
đo độ hấp thu.
- Hóa chất: α-amylase, Glucoamylase, glucose
oxidase-peroxidase

59
Colorless compound
leuco dye
spectrophotometrically
 Enzymic Methods
- Tiến hành:
▪ Bổ sung amylase chịu nhiệt, lắc đều & đun nóng
▪ Sau 5 phút, giàm nhiệt độ mẫu về 50oC, bổ sung
đệm sodium acetac 4,5 và glucoamylase; hỗn
hợp được ủ ở 50oC
▪ Pha loãng mẫu, bổ sung oxidase-peroxidase
▪ Đo độ hấp thu

62
65
Methods of Carbohydrate analysis
 Định lượng mono & oligosaccharides:
- Total Carbohydrate: Phenol-Sulfuric Acid Method;

- Total Reducing Sugar (Somogyi–Nelson Method; PP

khác);

- Specific Analysis of Mono- and Oligosaccharides

(Chromatographic methods)

 Định lượng tinh bột (starch)

 Định lượng chất xơ (Nonstarch)

66
 Định lượng chất xơ
- Nguyên tắc: 1/ tinh bột và protein được loại
bỏ bởi α-amylase, protease, glucoamylase. 2/
Sau đó, hỗn hợp được rửa sạch ta thu được
chất xơ không hòa tan. 3/ Chất xơ hòa tan
trong phần dịch rửa được kết tủa bằng
ethanol.
- Nếu muốn thu chất xơ tổng thì ethanol được
bổ sung vào dung dịch sau khi bổ sung
glucoamylase.
67
 Sample preparation
• % lipid trong mẫu < 10%, If the sample contains
more than 10% lipid, the lipid is removed by
extraction with 25 parts (vol/wt) of petroleum
ether or hexane
• Sấy khô (Mẫu lỏng có % chất xơ < 10% nên sấy
thăng hoa để loại ẩm)
• Nghiền mẫu
• Trích ly với ethanol 80% (soluble sugar )

68
 Định lượng chất xơ
- Enzymes: α-amylase, protease, glucoamylase
- Tiến hành:
▪ Loại bỏ chất béo (trích ly)
▪ Nung nóng hỗn hợp đến 95 – 100oC, bổ sung
enzyme amylase.
▪ Làm nguội hỗn hợp về 60oC, bổ sung protease và ủ
trong 35 phút.
▪ Chỉnh pH về 4.1 – 4.8, bổ sung glucoamylase và ủ
ở 60oC trong 30 phút
70
 Định lượng chất xơ
- Tiến hành:
▪ Bổ sung cồn 95%, phần kết tủa được thu nhận và
rửa nhiều lần với cồn, aceton. Sau đó đem sấy và
cân khối lượng.
▪ Trong phần kết tủa có lẫn protein và tro nên cần
xác định protein và tro trong mẫu rồi trừ ra.

71
THANKS FOR LISTENING

72
73