Пољопривредни факулет- Лешак

Универзитет у Приштини

Семинарски рад
Предмет: Дијагноза биљних патогена

Тема: Поступак изолације гљива рода Venturia Inaequalis

Предметни наставник: Студент:

Проф.др Славиша Гуџић Бојана Станојевић

Лешак,2024
 САДРЖАЈ

Увод .......................................................................................................3

1. Инфекције V.Inaequalis и њихово спречавање..................................4

2. Пораст и спорулисање колонија V. inaequalis..................................6

3. Резултат развоја колонија….............................................................7

4. Дејство pH подлоге на пораст колонија и спорулацију V.inaequalis

................................................................................................................9

5. Утицај светлости на развој и спорулацију патогена V. inaequalis...9

Закључак..............................................................................................11

Литература...........................................................................................12
 УВОД
Фитопатогена гљива Venturia Inaequalis је проузроковач чађаве пегавости лишћа и краста-
вости плодова јабуке.

V. inaequalis је космополитна врста, присутна у свим воћнацима и рејонима, посебно у

онима са хладнијим и хумиднијим климатима. То је европски патоген, где је познат од
давнина, одакле се проширио у многе крајеве света. Болест је присутна и код нас и сваке
године причињава велике штете. У запуштеним засадима, где се примењују никакве мере
заштите, штете, нарочито на осетљивим сортама, могу бити потпуне – 100% ( Ивановић и
Ивановић,2005 ). Штете од V. inaequalis могу бити директне и индиректне. Директне се
огледају у томе што патоген поред смањења родности проузрокује и погоршавање
квалитета плода, смањујући на тај начин и његову тржишну вредност. Индиректне штете
настају услед дефолијације, што утиче негативно на формирање цветних пупољака за
наредну вегетацију. Штете се огледају у смањењу приноса, смањењу квалитета плодова и
смањењу родности у наредној години. Савремена производња јабуке подразумева приме-
ну хемијских мера контроле, а највећи број третмана односи се на заштиту јабука од овог
патогена. Да би заштита била правовремена и успешна неопходно је познавање биологије
ове гљиве. V. inaequalis има две фазе у развоју, сапрофитну и паразитну фазу.
Сапрофитна фаза почиње са опадањем лишћа у јесен када и отпочиње процес
формирања псеудотеција. Дозревање псеудотеција тј. формирање аскуса са аскоспорама
зависи од температуре. У свакој псеудотецији формира се од 50 до 100 аскуса. У сваком
аскусу формира се по 8 аскоспора.Паразитна фаза почиње клијањем аскоспора и
остварењем инфекције. Ова фаза траје током целе вегетације јабука.
 1. Инфекције V. Inaequalis и њихово спречавање
Инфекције могу да се остваре на листу, цвету и плоду. Патоген нарушава квалитет плода,
а тиме и тржишну вредност, проузрокује опадање несазрелих плодова, дефолијацију и
слабо формирање цветних пупољака за наредну годину. Највише третмана заштите јабуке
је управо са циљем да се спречи појава ове болести. На инфекције Venturia Inaequalis ли-
шће је осетљиво одмах по отварању лисних пупољака, а плод током целокупног периода
развића. Гљива се током зиме одржава у перитецијама на опалом лишћу, зараженом у пре-
тходној години. Аскоспоре у перитецијама дозревају у пролеће и са првом кишом или
јаком росом долази до њиховог ослобађања. Ослобођене аскоспоре ношене ваздушним
струјама доспевају на лист, где клијају у биљно ткиво и остварују примарне инфекције.
Време потребно за клијање и продирање патогена зависи од температуре ваздуха и дужи-
не влажења листа. Након продирања, хифа гљиве наставља да расте и развија се, а после 8
до 18 дана уочавају се прве пеге. У оквиру пега, гљива спорулише и формира велики број
конидија којима се остварују секундарне инфекције. Ова болест се јавља сваке године и у
свим производним подручјима јабуке, а основу заштите чини превентивна примена фунги-
цида и спречавање примарних инфекција.

Прво прскање, у фази бубрења пупољака до фенофазе ''мишје уши'' , потребно је урадити
препаратом на бази бакра (Everest), у концетрацији 0,5% ( 50ml у 10l воде). На сортама на
којима су се развили први листићи, спречавање инфекције постиже се применом фунги-
цида Mankosav 75 WG, у количини 3kg/ha ( 30 g у 10l воде). У фази зелени букетићи овом
препарату потребно је додати системични фунгицид Diverto, у количини 0, 75 -1/ha ( 7,5 -
10 ml у 10l воде ). Mankosav 75 WG и Diverto имају превентивно деловање и испољавају
високу ефикасност на нижим температурама, које су често на почетку вегетације. Тре-
тмане обавезно радити пре кише или остварења услова за инфекције, у размаку 5 до 7 да-
на. У фази интезивног пораста лисне масе и формираних плодова, заштита се наставља ко-
мбинацијом препарата Different 250 EC, у количини 300 ml/ha (3 ml у 10l воде) и Niveral, у
количини 1l/ha ( 10 ml у 10l воде ). Комбинације ових препарата одликује добра расподела
на површини плода , деловање на вишим температурама и висока ефикасност у спречава-
њу инфекције.
 Слика 1. Venturia inaequalis на листу

Слика 2. Venturia inaequalis na plodu

 2. Пораст и спорулисање колонија V.Inaequalis
Фрагменти ваздушне мицелије колоније V. Inaequalis са моноспорне културе узгајане на
подлози од слада ( изолат пореклом из Лесковца) засејани су на хранљиве подлоге слад-
агар (СА), одварак листа јабуке (ОЛЈ) и кромпир глукозни агар- специјал (КГА), које су
подешене на pH 6,0. Засејане подлоге излагане су температурама од 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30,
33, 35 °C у политермостату у мраку ( Борић, 1985; Арсенијевић и Губери-
нић, 1989). Културе су прегледане свакодневно у циљу утврђивања почетка развоја коло-
нија на појединим температурама. Пораст колонија мерен је у интервалима од седам дана
током шест недеља развоја, док је коначан пораст колонија узет пречник измерен 42-ог
дана од засејавања ( Борић, 1985). Приказани подаци представљају просеке од пет пона-
вљања.

Образовање репродуктивних органа (конидија) праћено је сваког дана, од почетка развоја

мицелије у периоду од 42 дана. Почетак спорулације патогена утврђиван је у културама на
косој подлози у епруветама и на чистој подлози у Петри кутијама пречника 5cm. Мицелија
је захватана фитопалолошком иглом, преношена на микроскопску плочицу, а затим
припреман привремени препарат који је посматран под микроскопом, како би се утврдило
евентуално присуство спора. На овај начин је поуздано могао бити одрећен почетак спору-
лације. Интезитет спорулације, односно густина конидија у 1ml суспензије, утврћивана је
помоћу хемоцитометра по Thom-u са 16 поља укупне површине 1mm2 и дубине од 0,2mm.
Густина конидија одрећивана је после 30 дана од засејавања патогена (Ross, 1974), на сва-
кој од испитиваних закошених подлога у епруветама и свим температурама на којиима је
било пораста мицелије, како би се утврдиле разлике у интезитету спорулације. Сунспензи-
ја конидија припремана је тако што је 1ml дестиловане воде додаван у епрувету са култу-
ром патогена уз благо гребање металном спатулом да би се конидије одвојиле од мицели-
је. Добијена суспензија је пресипана у чисту епрувету и процеђена кроз полиетиленску
мрежу да би се одстранила мицелија. Пастеровом пипетом узимана је суспензија спора и
преношена на хемоцитометар. Прве две капи суспензије су одстрањиване, а следећа је на-
ношена између покровне љуспице и стаклене плоче хемоцитометра и под микроскопом
при увећању од 100х вршено је пребројавање конидија. Бројање је рађено у 32 понављања
( 32) поља. Утврђиван је укупан број спора, а из тога је затим израчунаван просечан број
спора по 1mm2 Густине спора у 1cm3 ( 1ml) суспензије израчунвана је по следећој форму-
ли: N= n x 5 x 1000, где је N = број спора у 1ml суспензије ( густина спора / 1ml) а n =
просечан број спора на 1mm2.
 3. Резултат развоја колонија
Почетак развоја колонија значајно зависи од температуре гајења. Уколико се температура
снижава, почетак раста је све каснији. Тако, на 1 стенен целзијуса почетак раста је тек
после 72 сата, на 20 °C и 25 °C после 22 и 24 сата, а на 30 °C и вишим температу-
рама нема пораста колонија. Испитиване хранљиве подлоге ( СА, КГА, ОЛЈ) не показују
почетак пораста колонија V. Inaequalis и у овом погледу колоније се понашају исто на
свим испитиваним културама. Пораст колонија врло значајно зависи од температуре и по-
длоге на којој се патоген гаји, као и њихове интеракције. Оптималне температуре за пора-
ст колонија патогена се разликују у зависности од коришћене подлоге и износе
15-25 °C са СА, 15-20 °C на ОЛЈ, И 20 °C на КГА. Минимална температура је око 1 °C
степен целзијуса, а максимална 27 °C. Температура од 15 °C најбоље диференцира разлике
у порасту колонија на коришћеним подлогама. На овој температури пораст колонија се
значајно разликује у зависности од коришћене подлоге ( 26,7 mm на ОЛЈ, 30,4 mm на КГА,
36,6 mm на СА). Овакви резултати развоја патогена нису утврђени при темперетури од
20 °C и осталим испитиваним температурама. Из добијених резултата види се да је највећа
разлика у порасту колонија, када се узму у обзир све испитиване температуре, утврђена је
на полдози од кромпира ( КГА). Остале две испитиване подлоге ( СА и ОЛЈ) не
испољавају овакав ефекат на пораст култура V. inaequalis. С' друге стране подлога од
слада омогућила је испољавање ширег спектра оптималних температура за пораст
колонија. То су температуре између 15 и 25 °C и између њих се не понављају статистички
значајне разлике, у односу на укупан пораст колонија. На подлози од одварка листа
јабуке, оптимум та пораст колонија је између 15 и 20 °C док је на подлози од кромпира, за
пораст гљиве оптимална температура од 20 °C.Упоређењем коначног пораста колонија на
појединим подлогама, види се да је најбољи пораст колонија V. inaequalis постигнут на
подлози од слада, а да је нешто слабији пораст на подлози од кромпира. Најслабије
резултате у погледу услова за пораст колонија показала је подлога од одварка листа јабуке
( ОЛЈ).
Слика 3. Пораст колонија на подлози од слада,одварка листа јабуке и и кромпира при
разним температурама на 42 дана

Темпрература утиче на структуру и изглед колонија V. inaequalis ( слика 3 ) што је најуо-

чљивије на КГА. На температури од 1 °C ваздушни део колонија је масли-
настозелен, кружног облика са јасно ограниченим ивицама, без уочљивог руба. Супстра-
тни део колонија је за нијансу тамнији, кружног је облика и са јасном ивицом. Централни
део колоније није уздигнут. На температури од 5 °C колоније су кружног облика, а за
разлику од претходне температуре имају тамнији руб ширине око 1mm. Вазд-
ушни део колонија је сив и сомотасте грађе са незнатно издигнутим централним делом.
Супстратни део колонија је тамно маслинаст до мрк. На температури од 10 °C је врло
уочљива разлика у изгледу колонија, које су кружног облика са нешто светли-
јим рубом, ширине око 2mm. Ваздушни део колонија је светло сиве боје, смотасте стру-
ктуре са гушћом мицелијом, а колоније су рељефне по својој површини. Централни део
колонија је издигнут,а ивица је такође рељефна, ( мицелија по ивици грудвичасог изгледа)
Супстратни део колонија у свом централном делу је мрк, а на периферији светлији,
ширине око 3 mm. На температури око 15 °C, за разлику од претходне, ваздушни део
колонија није рељефан по површини, што је и најуочљивија разлика у односу на колоније
са претходне температуре. Централни део колонија је благо уздигнут, пречника око 2 mm.
Сустратни део колонија је мрк, без наглашеног руба.

На температури од 20 °C колоније су неправилно кружног облика са таласастом ивицом и

јасно израженим тамнијим рубом , ширине око 3 mm. Ваздушни део колонија благо
испупчен у средишњем делу, а од колонија са претходних температура разликује је благо
нијансиран тамнији прстен (у средишњем делу колоније ),пречника окo 10mm.Супстратни
део колонија је тамно мрке боје са светлијим средишњим делом и тамнијим рубом ширине
око 3 mm. На температури од 25 степени целзијуса за разлику од претходних, уочљива су
два уска концентрична прстена за нијансу тамније боје,од осталог дела колоније, као и
узак руб исте нијансе. Почетак спорулације константован је после 29 дана од почетка
развоја мицелије на температури од 1 °C, на 5 степени после 12 дана, а на 10 °C и 25 °C
после 7 дана.Температуре од 15 и 20 °C су најповољније за почетак спорулације , на
којима су образовање конидија почиње почиње после три дана од почетка развоја
мицелије. Различите температуре утичу на интезитет спорулације колонија, односно на
густину спора ( у 1ml суспензије). Утврђено је да је интезитет спорулације највећи при
температури од 15 °C, на подлози од слада, ( 166500 спора/ml). Са снижавањем
температуре, рапидно опада и интезитет спорулације. Врло низак интезитет спорулације
утврђен је и на температури од 25 °C. На температури од 20 °C нема спорулације или је
она слаба, тако да на подлози од малца износи свега 5625 спора/ml , док на осталим
подлогама изостаје. Најмање разлике у интезитету спорулације при појединим
температурама развоја патогена су на подлози од кромпира ( КГА).

4. Дејство pH подлоге на пораст колонија и спорулацију V.inaequalis

Највећи пораст колонија је на слабо киселој подлози ( pH 5,9 ). Међутим, и на умерено
киселој ( pH 5,1), као и на неутралној ( pH 7,0) подлози, а такође и на слабо базној ( pH
9,0), патоген се добро развија, мада је на овим подлогама укупан пораст колонија видно
мањи него на слабо киселој подлози ( pH 5,9). Најмањи пораст колонија је на подлози са
pH 9,0. Киселост подлоге има утицај и на морфолошке одлике колонија V.inaequalis . На
нижим ( pH 5,1 и 5,9), као и на вишим pH вредностима подлоге (pH 8,0 и 9,0), колоније су
тамно маслинасте боје без видљиво израженог прстена по ободу. На неутралној pH
вредности, средишњи део колонија има светомаслинасту боју и руб тамније нијансе. Ко-
лоније на свим pH вредностима су скоро правилно кружног облика са дифузном ивицом.

Интезитет спорулације колонија V.inaequalis такође зависи од киселости подлоге. Најбоље

спорулишу културе на подлози са pH вредношћу 8. На осталим pH вредностима интезитет
спорулације колонија је знатно слабији. Колоније на подлогама са pH вредношћу 5,9 и 7,0
имају у просеку скоро 3 пута слабију спорулацију него оне на подлози са pH вредношћу
8,0. Најслабију спорулацију имају колоније које се развијају на подлози са pH вредношћу
9,0.

5. Утицај светлости на развој и спорулацију патогена V. inaequalis

У испитивањима утицаја светлости, чисте културе V. inaequalis, узгајане на подлози од
слада, излагане су дејству вештачке и дифузне светлостии држане у тами. Колоније V. ina-
equalis испитиване током овог огледа, изложене су приближно истим условима темпера-
туре. Вредности интезитета дифузног осветљења биле су од 220 до 940 lux-a ( у просеку
638 lux-a), а интезитет вештачке светлости износио је 940 lux-a. Услови осветљења не
утичу значајно на почетак развоја мицелије. Утврђено је да је код свих третмана мицелија
почела да се развија после 24h од засејавања подлога. Поредећи укупан пораст колони-
ја гљиве при различитим условима осветљења, уочава се да су најмањи пораст имале ко-
лоније гајене у тами, док су колоније излагане утицају светлости имале већи пораст. И
поред тога на основу добијених резултата не може се са сигурношћу тврдити који услови
осветљења и дужина експозиције стимулативно делују на пораст колонија, јер су разлике
међу третманима минималне, а статистичко поређење података указује на непостојање
функционалне зависности међу њима. Међутим генерално се може закључити да светлост
стимулише развој мицелије у односу на таму. Различити услови осветљења нису значајни-
је утицали на изглед, боју и структуру колонија V. inaequalis. Све колоније па и оне које су
се развијале у тами приближно су исте боје, кружног облика са дифузном ивицом. Такође
је утврђено да различити услови осветљења нису значајно утицали на почетак и интезитет
спорулације у култури. Почетак спорулације у свим варијантама утврђен је после 72 сата
од почетка развоја мицелије.
 ЗАКЉУЧАК
Највећи број фунгицидних третмана у контроли болести јабуке реализован је против кра-
ставости јабуке. Међутим тржни центар, тј број доступних фунгицида који су често кори-
шћени у повећаним дозама изазвали су проблеме мање осетљивости патогена на приме-
њене фунгициде.Утицај различитих температура на раст колонија патогена и спорулација
су истраживани да би се открили оптимални услови за патоген и њихов развој.Оптимална
температура за развој колоније била је од 15 до 20 °С ,минимална око 10, а максимална
27 °С. Утицај средњег pH и вештачке и дифузне светлости на раст и спорулацију V.
inaequalis је проучавана ин витро. Оптимални pH за раст колоније био је 5,9 а при pH 8,0
детектована је најбоља спорулација патогена.Морфологија колонија зависи од Ph
медијума. Стимулисана је и дифузна и вештачка светлост за раст колонија и спорулација у
поређењу са мраком, али не постоји регуларност везе између извора светлости и периода
експозиције.
 ЛИТЕРАТУРА

1. Алексић, Г., Стојановић, С., Старовић Мира, Кузмановић, С., Тркуља , Н. (2005):
Пораст и спорулисање колонија V. inaequalis на различитим температурама и подлогама.
Заштита биља, Вол. 56 (1-4), Но 251-254, 77-86.

2. Борић, Б. (1985а): Утицај високих температура на клијавост конидија V. inaequalis

(Cooke) Winter. Заштита биља, Вол. 36 (2), Бр.172: 143-148.

3. Борић, Б. (1985б): Утицај температуре на клијавост спора V. inaequalis (Cooke) Winter и

утицај старости на њихову виталност. Заштита биља, 173:295-302

4. Борић, Б., Драганић, М., Алексић, Г. (1994): Морфолошке карактеристике изолата V.

inaequalis са територије Југославије и одгајивачке вредности неких хранљивих подлога.
Трећи југословенски конгрес о заштити биља (Зборник резимеа (38), 48,Врњачка Бања).

5. Гуџић, Д.. С, Стојановић,Д..С. (2011): Болести воћака и винове лозе (Универзитет у

Приштини-Пољопривредни факултет, 26 стр, Косовска Митровица- Лешак)