6.

UD PCR teknikak

Edukiak
PCR teknikak, aldaerak eta
aplikazioak.
Anplifikaziorako materialak eta
erreaktiboak.
Erreakzio-nahastea prestatzea
Termoziklatzailea programatzea.
Anplifikatutako zatien tamaina
zehaztea.
 6. UD. PCR teknikak 135

6.1. Polimerasaren Denbora laburrean anplifikazio-maila handia

kate-erreakzioa (PCR)
Polimerasaren kate-erreakzioa edo PCR
(ingelesez Polymerase chain reaction) DNA
anplifikatzeko in vitro teknika bat da, DNA zati
zehatz baten milioika kopia berdin lortzea
ahalbidetzen duena, gutxieneko DNA-molde
kopuru batetik abiatuta.
Hasiera batean molekula handiago baten DNA zati
bakarra anplifikatzeko diseinatu zen PCR delakoa,
baina gerora teknika garatu da, eta zati handiagoak
(35 kb-rainokoak) ere anplifikatzea lortu da.
Halaber, teknikaren hainbat aldaera sortu dira, eta
horien bidez posible da:
lortzeko aukera emateak eta atzemate-
sentsibilitate handiagoa eskaintzeak, PCR oinarrizko
teknika bihurtu du gaur egungo edozein biologia
molekularreko laborategitan.
PCR teknikaren aplikazioak kontaezinak dira
biologiaren, medikuntzaren eta paleontologiaren
eremuan. Hona hemen zenbait adibide:
Zenbait gaixotasunen diagnostikoa eta
pronostikoa
Tratamenduen eboluzioa eta horiei emandako
erantzuna
Adierazpen genikoko azterlanak

Erreakzio bakar batean hainbat zati Mutagenesia

anplifikatzea (PCR anizkoitza).
Azterketa filogenetikoak
RNAren zatiak anplifikatzea (RT-PCR).
Genotipatzea
Lagin bateko azido nukleikoko molekula zehatz
baten kontzentrazioa kuantifikatzea (PCR Auzitegiko medikuntza eta bestelakoak
kuantitatiboa, denbora errealeko PCRa).

Biologia molekularrean erabiltzen diren beste

teknika batzuen aldean, PCR teknikek eta horien
aldaerek abantaila argiak dituzte:

Anplifikazio-teknika gisa. DNA

birkonbinatuaren bidezko teknologia
darabilten bektoreetako klonazio-tekniken
aldean (ikus 7. unitate didaktikoa), denbora
asko aurrezten da (PCRa ordu batzuen
buruan gertatzen da; aitzitik, klonazioak
egunetako lana eskatzen du). Gainera,
erabat automatizatuta daude (klonazioa,
aldiz, eskuz egin behar da).

Atzemate-teknika gisa. Hibridazio-tekniken

aldean (ikus 4. eta 5. unitate didaktikoak),
PCRa baliatzeko askoz lagin txikiagoa behar
da, eta, gainera, sekuentzia zehatzak 6.1. irudia. Polimerasaren kate-erreakzioaren
kuantifikatzea ahalbidetzen du (denbora teknikaren bidez hainbat gaixotasun infekzioso
errealeko PCRa). atzeman daitezke; izan ere, teknika horren
bidez, agente infekziosoaren material
genetikoa atzeman daiteke aztertutako
material zelularrean.
136 6. UD. PCR teknikak
6.2. PCRaren
oinarri teorikoak
Prozesu entzimatikoa da PCR teknika, DNA
polimerasa baten bidez katalizatutakoa eta DNAren
erreplikazioan oinarritutakoa.
Kary Mullis biokimikalari iparamerikarrak sortu
zuen teknika 1983an. Hasierako ideia izan zen
DNA in vitro erreplikazio-zikloak sekuentzietan
errepikatzea. Horrela, DNA molde molekula
bakar batetiik hainbat kopia lortzen dira.
Errepikapen bidezko diseinu hori anplifikazioren
gakoa da; izan ere, ziklo bakoitzean lortutako
kopia berriak molde gisa erabil daitezke kopia
berri gehiago lortzeko hurrengo zikloetan.
Horrela, esponentzialki handitzen dira ondoren
egiten diren erreplikazio-ziklo bakoitzaren
kopiak.
Edonola ere, hori lortzeko bi arazo hauek
konpondu behar dira:
Nola lortu teknikaren ziklo bakoitzean
interesatzen zaigun zatia soilik kopiatzea
(erreplikatzea) DNA molekulen nahaste
konplexu batetik?
Nola lortu DNA moldearen desnaturalizazio-
faserako behar den tenperatura altuaren
ondorioz DNA polimerasa ez inaktibatzea?
Lehenbiziko arazoa konpontzeko hasle
espezifikoak diseinatu ziren, DNAren zati
konkretu baten anplifikazio esklusiboa
ahalbidetzen zutenak. Bigarren arazoaren
konponbidea DNA polimerasa termoegonkorrak
aurkitzea izan zen.
3’
3’
6.2. irudia. PCR baterako hasleak bikoteka diseinatzen dira, eta horien sekuentziak anplifikatu nahi den zatia inguratzen
duten sekuentzien osagarri dira, aurkako mutur eta hariz.
6.2.1. Hasleak edo primersak
Hasleak (ingelesez primers) oligo-nukleotido
katebakarrak dira, eta hauen sekuentzia
anplifikatu nahi den zatia inguratzen duten
aldearen osagarri da.
Bikoteka diseinatzen dira, eta hasle bakoitza
interesa duen alderdiaren ondoko sekuentzia
baten osagarri da, baina kontrako kate eta
muturretan:
3’>5’ norabidea daukan harizpi-moldera
lotuko den hasleari F haslea edo forward
esaten zaio.
5’>3’ norabidea daukan harizpi moldera
lotuko denari, bestalde, R haslea edo reverse
esaten zaio.
DNA polimerasaren jarduera entzimatikorako
substraturik egokiena DNA (moldea)
katebakarraren molekula bat da, eta helize
bikoitzeko alderdi bat dauka. Bertara lotzen dira
eta bertatik hasten dira biltzen harizpi-
moldearen osagarri diren oinarridun
nukleotidoak.
PCRari dagokionez, helize bikoitzeko alderdi txiki
hori hasleek eskaintzen dute, dagozkien
sekuentzia osagarriekin lotzen direnean aurretiaz
desnaturalizatutako harizpi moldeetan.
Hasle bikote batek, hortaz, anplifikatzen den DNA
molekula baten itu-alderdia definitzen eta
mugatzen du, hain zuzen ere bikoteko bi hasleek
barne hartuko dutena.
Hasleek erreakzioaren espezifikotasuna finkatzen
dute, eta posible egiten dute molekulen nahaste
konplexu bateko DNA zati jakin baten anplifikazio
esklusiboa. Horretarako, jakina, haren
sekuentziak bakarra izan behar du aztertzen ari
den DNAn.
3’
3’
 6. UD. PCR teknikak 137

Kontuan izan! Kontuan izan!

DNA polimerasak ez du DNA kate berri baten sintesia Egun, hainbat informatika-programa daude
hasten, aurretiaz dagoen bat luzatzen du (Interneten sarbide librea dute batzuek) hasle
espezifikoak diseinatzeko anplifikatu nahi den
sekuentziatik abiatuta (ikus 9. unitate didaktikoa,
Bioinformatika atala)

6.1. dokumentua Hasleak diseinatzea

Hasleak diseinatzeko beharrezkoa da ezagutzea anplifikatu nahi den zatia inguratzen duten bi alderdietako
oinarrien sekuentzia. Egoera idealetan, hainbat baldintza bete behar dira honako hauei dagokienez:

Luzera. 18 eta 30 oinarriren artekoa izan behar du. Haslea espezifikoa izan dadin, esaten da hasleak
gutxienez 16 oinarriko tamaina izan behar duela. Aukera asko daude 16 oinarritik beherako
sekuentzia bat errepikaturik egon dadin genoma konplexu batean interesa duen alderdiaz gainerako
alderdietan. Horregatik ez da gomendatzen hasle moduan erabiltzea. Horren ondorioz:
– 15 oinarritik beherako hasleak DNA moldera errendimendu handiz lotzen bazaizkio ere, ez dira
behar adina espezifikoak. Bestalde, produktu anplifikatu ez-espezifikoak agertzea eragiten dute.
– 30 oinarritik gorako luzera duten hasleek espezifikotasun handia ematen diote teknikari, baina
gaitzago lotzen zaizkio DNA moldeari eta txikitu egiten dute erreakzioaren errendimendua. Hala
ere, aplikazio konkretuetan 40-45eko hasleak erabil daitezke.
Oinarrien konposizioa. G+C edukia % 40-60 bitartean duten hasleekin lortzen dira emaitzarik onenak.
Nolanahi ere den, A/T eta G/C aberatsa duten domeinuen arteko banaketak orekatua izan behar du.
Haslearen alderdirik garrantzitsuena 3´muturra da; izan ere, DNA moldeari lotzen bazaio alderdi hori,
eta 5´muturra lotzen ez bazaio ere, DNA polimerasak DNAren erreplikazioa has dezake. Horregatik,
gomendatzen da haslearen 3´muturrak ez ditzala izan jarraian hiru G/C sekuentzia edo gehiago,
horrela ekiditen baita hiru G/C jarraian edo gehiago dituen DNAren edozein punturekin modu
egonkor eta ez-espezifikoan lotzea.

Sekuentzia. Hasleek ez dute izan behar sekuentzia osagarri intramolekularrik edo intermolekularrik.
– Sekuentzia osagarri intramolekularrak egoteak eragin dezake, alde batetik, haslean bigarren mailako
egiturak sortzea (adibidez, urkilak, DNA molderako lotura ekiditen dutenak); bestalde, haslearen
autodimerizazioa eragin dezakete, eta horrek gutxitu egiten du kontzentrazio eraginkorra erreakzioaren
nahastean.
– Hasleen artean sekuentzia
osagarri intermolekularrak
egoteak eragin dezake
hasleak dimerizatzea, eta
horrek ere gutxitu egiten
du kontzentrazio Autodimerizazioa

eraginkorra. Hasleen
arteko osagarritasunik eza
bereziki garrantzitsua da bi Hasleen dimerizazioa
, ,
5 _TGACCTTGCGGGCCGAC_3
hasleen 3´muturretan, ez 5
,_
TGACCTTGCGGGCCGAC
_
3
,
,
| | | | |
,
3 _AGCGAGACACTGGGGTCTAG_5
daitezen sortu muturrak R haslea

DNA moldera lotzea

eragozten duten dimeroak.
6.3. irudia. Adibide honetan ikusten denez, gaizki diseinatutako hasleek urkila motako
bigarren mailako egiturak sor ditzakete, edo hasleen dimeroak sortu edo autodimerizatu.
Fusio-tenperatura. Beti posible izaten ez den arren, hasleen Tm 52-65 ºC bitartean egon behar da.
Edozein kasutan, hasle-bikote bateko bi hasleen Tm -en arteko diferentziak 5 ºC-tik beherakoa izan
behar du, tenperatura berean DNA moldearekin lotzeko errendimendua antzekoa izan dadin.
138 6. UD. PCR teknikak
6.2.2. DNA polimerasa
termoegonkorrak
DNA polimerasak DNA kate berriak sintetizatu
ahal izateko, beharrezkoa da DNA moldea
katebakarra izatea. Horren eraginez, PCR ziklo
bakoitza beroaren bidezko desnaturalizazio fase
batekin hasi behar da. Hori arazoa da DNA
polimerasa arruntentzat; izan ere, azken horiek
termolabilak dira, hots, inaktibatu egiten dira
tenperatura altuetan. Teknika diseinatzeko egin
ziren lehenbiziko esperimentuetan arazo horri
DNA polimerasa termoegonkor motak
aurre egiteko beste entzima bat gehitzen zen
ziklo bakoitzean; horrek, ordea, teknika zailtzen
DNA polimerasa termoegonkorrak bigarren mailako
eta luzatzen zuen, bai eta kutsadura-arriskua
gaitasun entzimatikoen arabera sailka daitezke.
handitzen eta automatizazioa ekiditen ere.
Honako hauek izan daitezke:
DNA polimerasa termoegonkorrak aurkitzeak
PCR teknikaren erabateko garapena ekarri zuen.
DNA polimerasa termoegonkorrak
arkeobakterio estremofilo (termofilo) talde
bateko entzima isolatuak dira, tenperatura
altuetan jarduera polimerasa daukatenak.
DNA polimerasa bakteriano arruntak bezala,
entzima horiek katalizatu egiten dute 5´>3´
norabidean nukleotidoak gehitzea, helize
bikoitzeko alderdi txiki batetik abiatuta, molde
gisa DNA katebakar bat erabilita, eta magnesio-
ioien presentzian (Mg2+). Hala ere, PCRan
erabiltzeko egoki bihurtzen dituen bi ezaugarri
bereizgarri dituzte:
6.2. dokumentua
Jarduera polimerasa egin dezaten tenperatura
egokiena 70-75 ºC-koa da. Horren ondorioz,
hasleak DNA moldera hibridatzea ahalbidetzen
da, tenperatura erlatiboki altuetan baldintza
zorrotzak finkatuta, eta horrek handitu egiten
du erreakzioaren espezifizitatea.
95 ºC-an inkubazio-aldi luzeak (40 minututik
gorakoak) igarota ere, jarduera polimerasa
mantentzeko gaitasuna dute. Horrek
bermatzen du entzima ez dela inaktibatutako
DNAren desnaturalizazio-faseetan.
5’>3’ jarduera exonukleasa, 3’>5’ jarduera
exonukleasarik gabea. Jarduera polimerasaz
gainera, 5´>3´ jarduera exonukleasa dute,
baina ez dute 3´>5´ jarduera exonukleasarik.
Horren ondorioz, ezin dute errorerik zuzendu
(gaizki gehitutako nukleotidoak deuseztatzea).
Horren adibide da Taq DNA polimerasa, zeinak
errore tasa hau duen: 1 gehitutako 100.000
nukleotidoko.
5’>3’ jarduera exonukleasa, 3’>5’ jarduera
nukleasarekin batera. Jarduera zuzentzailea
duten entzimak dira. Nukleotido oker bat
(DNA moldeari dagokiona osatzen ez duen
oinarri nitrogenatua duen bat) gehitzen
denean, deuseztatu egiten dute, eta katea
luzatzen jarraitzen dute nukleotido egokia
gehituta.
Entzima hauen kasuan errore-tasa askoz ere
txikiagoa da: 1 gehitutako 1 milioi
nukleotidoko, hain zuzen ere. Horren
ondorioz, oso erabilgarriak dira erreplika-
fideltasun handia eskatzen duten PCR
aplikazioetarako; adibidez, sekuentziazio
bidezko mutazioen analisiak egiteko
sekuentziak anplifikatzeko edo adierazpen-
azterketak egiteko.
Alderantzizko transkriptasa-jarduera. Zenbait
DNA polimerasa termoegonkorrek ahalmena
dute RNA molde moduan erabiltzeko, hau da,
alderantzizko transkriptasa jarduera dute
manganeso-ioiak (Mn2+) daudenean. Hala,
RNAtik abiatuta DNAc sintetizatzeko eta
anplifikatzeko erabil daitezke.
 6. UD. PCR teknikak 139

6.3. dokumentua PCRn gehien erabilitako DNA polimerasa termoegonkorrak

Taula honetan zehazten da zein diren PCRn gehien erabiltzen diren DNA polimerasak. Halaber,
adierazten da zein organismotatik isolatu diren eta zein diren bigarren mailako jarduera entzimatikoak.

Exonukleasa Exonukleasa Alderantzizko

Izena Organismoa
5’>3’ 3’>5’ transkriptasa
Taq DNA polimerasa Thermus aquaticus BAI EZ EZ
Tfl DNA polimerasa Thermus flavus BAI EZ BAI
Tth DNA polimerasa Thermus thermophilus BAI EZ BAI
Tli DNA polimerasa Thermococcus litoralis EZ BAI EZ
Pfu DNA polimerasa Pyrococcus furiosus EZ BAI EZ
Pwo DNA polimerasa Pyrococcus woesei EZ BAI EZ

DNA polimerasa termoegonkorrak isolatu diren organismoaren arabera izendatzen dira, hain zuzen ere
generoari dagokion lehenbiziko letra larriarekin eta espezieari dagozkion lehenbiziko bi letra xeheekin. Hala,
esaterako, Thermus aquaticus organismotik isolaturiko polimerasa termoegonkorra honela izendatzen da:
Taq DNA polimerasa.

6.2.3. PCR baten Adibidez, Taq DNA polimerasak jarduera galtzen

oinarrizko zikloa
Arestian esan bezala, PCRa erreplikazio-zikloen
sekuentziak errepikatzean datza. Ziklo bakoitzak
hiru fase ditu:
I. DNA moldea desnaturalizatzea.
II. Hasleak DNA moldearekin hibridatzea.
III. Hasleak luzatzea.
Erreakzio-nahastean dagoen DNA molde zati
bakoitzeko, DNA molekula berri baten sintesia
lortzen da ziklo bakoitzaren azken emaitza gisa.
DNA molekula berri hori molde gisa baliatzen da
hurrengo zikloan.
I. fasea: desnaturalizatzea
DNA moldea osorik desnaturalizatu dadin, faseak
behar beste iraun behar du eta tenperaturak
behar bezain altua izan behar du; baina,
prozesua ezin da gehiegi luzatu, DNAren
polimerasa inaktibatu ez dadin.
Kontuan izan!
Zikloaren fase bakoitza egokitutako tenperatura
eta denbora-tarte jakin batean egiten da,
anplifikazioan errendimendu onena lortu ahal
izateko eta nahi ez diren produktuak ager ez
daitezen
du 40 minututik gora 95 ºC-ko tenperaturapean
egonez gero. Normalean, desnaturalizatze fasea
94-95 ºC-an egiten da, 15-30 segundotan.
II. fasea: hibridatzea
Hasleak DNA moldearekin hibridatzea
(ingelesezko annealing) 50 eta 65 ºC bitartean
egiten da normalean. Balore zehatza hasleen Tm-
aren araberakoa izaten da, eta honako tarte
honetan egoten da: Tm ± 5 ºC.
Hibridatze-tenperaturak altuagoak badira
hasleen Tm baino, zorroztasun gehiago behar
da eta, hortaz, espezifizitate handiagoa
(hasleen hibridatze ez-espezifiko txikiagoa eta
nahi ez diren produktuen kantitatea
gutxitzea). Eragozpen da, baina,
errendimendua txikiagoa izatea.
Hibridatze-tenperaturak baxuagoak badira
hasleen Tm baino, hibridatze-errendimendu
handiagoa lor daiteke; izan ere, hasleak
eraginkortasun handiagoz hibridatzen dira.
Hala ere, eragozpen bat ere badu: hasleen
hibridatze ez-espezifikoa dela eta, nahi ez
diren produktuak ager daitezke.

6.4. irudia. PCRaren
oinarrizko zikloa, ondoz
ondoko hiru fasez osatua:
desnaturalizatzea, hasleak
hibridatzea eta luzatzea.
Dena den, hasleen hibridatze-tenperatura egokia
modu esperimentalean finkatu behar da hasle-
bikote bakoitzarentzat. Hibridatze-fasearen
iraupen estandarra 30 eta 60 segundo artekoa
da.
III. Fasea: luzatzea
DNA polimerasaren bidez harizpi-moldea
kopiatuta hasleak luzatzeko edo elongatzeko,
tenperaturak egokia izan behar du, hala lortzen
baita erabiltzen den entzimaren polimerizazioa.
Bada, Taq polimerasaren kasuan 72 ºC-koa da.
Entzimaren polimerizazio-abiadurak eta
anplifikatuko den zatiaren luzerak baldintzatzen
dute luzatze-fasearen iraupena. Esaterako, Taq
polimerasak 60 nukleotido/segundo inguruko
polimerizazio-abiadura du. Entzima horren
kasuan, 30 eta 40 segundo artean luzatzea
gomendatzen da 1kb baino gutxiagoko zatiak
anplifikatzeko, minutu batekoa 1-1,5 kb arteko
zatietarako, eta bi minutukoa 1,5-3 kb tarteko
zatietarako. Jarduera zuzentzailea duten
entzimen kasuan, luzatze luzeagoak aurreikusi
behar dira, gutxi gorabehera minutu batekoak
1kb-ko zatietarako.
6.2.4. PCRaren
anplifikatzaileak
PCRaren oinarrizko zikloa n aldiz errepikatu
ondoren, hainbat anplifikazio-produktu lortzen
dira, batzuk bilatuak eta beste batzuk bilatu
gabeak. Proportzioak, ordea, ezberdinak dira.
Produktu horiek nola lortzen diren ulertzeko,
azter dezagun zer gertatzen den DNA moldearen
jatorrizko molekula batetik abiatutako PCRaren
lehen zikloetan.
6. UD PCR teknikak 141
PCRaren lehen zikloa
Hasierako desnaturalizatze-fasea. DNAren
jatorrizko molekularen bi kateak bereizten
dira, N+ eta N–.
Hibridatze-fasea. Hasle bakoitza dagokion
itu-sekuentziari lotzen zaio.
Luzatze-fasea. Bi DNA kate berri sintetizatzen
dira. Kate horiek anplifikatu nahi dugun zatia
barne hartzen dute, baina askoz luzeagoak
dira; izan ere, DNA polimerasak harizti-moldea
erreplikatzen jarraitzen du bigarren zikloko
desnaturalizatze-fasea hasi bitartean. Kate
horiei I+ e I– esaten diegu.
Lehen zikloa bukatzean, bi kate berri horiek
helize bikoitza osatzen dute DNA moldearen
alderdi osagarriekin: N+/I– eta N–/I+. Molekula
horiek PCRaren erdibideko produktu luzeak dira,
nahi ez direnak.
1. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 2
produktu (2 × 1) eta nahi diren 0 produktu.
PCRaren bigarren zikloa
Desnaturalizatze-fasea. Helize bikoitza duten
egitura guztiak disoziatzen dira, eta DNAren
lau kate lortzen dira. Bada, horiek molde gisa
jardun dezakete: N+, N–, I+ e I –.
Hibridatze- eta luzatze-faseak. DNAren lau kate
berri sintetizatzen dira, eta horrek molde gisa
jardun duten harizpiekin helize bikoitza osatzen
dute: N+/I–, N–/I+, I+/A– e I–/A+.
I harizpiak erabiliz sintetizatutako kateak (A+ eta
A) anplifikatu nahi dugun zatiari dagozkio zehazki.
140 6. UD. PCR teknikak

I+/A– eta I–/A+ molekulak ere erdibideko 4. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 8 (2 ×
nahigabeko produktuak dira. 4) eta 8 anplikoi.

2. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 4 Hurrengo zikloetan, hauek izango dira azken
produktu (2 × 2) eta nahi diren 0 produktu. emaitzak:

5. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 10

PCRaren hirugarren zikloa produktu ez (2 × 5) eta 22 anplikoi.

6. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 12

Desnaturalizatze-fasea. 8 harizpi molde
lortzen dira: N+, N–, 2 I+, 2 I–, A+ eta A–.
Hibridatze- eta luzatze-faseak. 8 harizpi
moldeetatik 8 heteroduplex lortzen dira zikloa
bukatzean: N+/I–, N–/I+, 2 I+/A–, 2 I–/A+, 2
A+/A–.
A+/A– molekulak produktu desiragarriak dira,
eta anplifikatu nahi dugun zatiarekin bat datoz.
Anplikoi izena hartzen dute.
produktu (2 × 6) eta 52 anplikoi.
7. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 14
produktu (2 × 7) eta 114 anplikoi.
Horrela jarraituko dute zikloek ondoz ondo, eta
ziklo bakoitzean nahi ez diren produktuak
aritmetikoki handituko dira; ostera, anplikoien
kopurua esponentzialki handituko da.
PCRa amaitzean, n anplifikazio-zikloren ostean:

3. zikloaren azken emaitza: nahi ez diren 6 (2 × 3) Nahi ez diren produktuak 2n izango dira (70,
eta 2 anplikoi. baldin eta 35 anplifikazio-ziklo egin badira).

Anplikoien kopurua 2n-tik gertu egongo da (>

PCRaren laugarren eta hurrengo 1010, baldin eta 35 anplifikazio-ziklo egin
zikloak badira).

Desnaturalizatze-fasea. 16 harizpi Teknikaren errendimendua beti % 100ekoa ez

erabiliko dira molde gisa: N+, N–, 3 I+, 3 I–, 4 A+
eta 4 A–.
Hibridatze- eta luzatze-faseak. 16 harizpi
moldeetatik 16 heteroduplex lortzen dira: N+/I–,
N–/I+, 3 I+/A–, 3 I–/A+, 8 A+/A–.
bada ere, argi dago polimerasaren kate-
erreakzioaren bidez jatorrizko laginean dauden
molekula-molde bakoitzaren milioika kopia lor
daitezkeela.

Kontuan izan! N+

1. I+
http:// ZIKLOA N–

medmol.es/tecni-
cas/13/ webgunean N+
I– I+
N–
PCRa azaltzen duen 1. A+
I–
ZIKLOA
eskema animatu bat I+
A–
ikus dezakezu.
N+
I– I+
N–
A+
I–

I+
3. A+
ZIKLOA I–
CICLO
I+ 5
A– A+
A–

A+
A–

6.5. irudia PCR produktuak

erreakzioaren lehenbiziko
zikloetan. 3. ziklotik aurrera,
modu esponentzialean
metatzen hasten dira produktu 4.
desiragarri laburrak ZIKOA

(anplikoiak).
142 6. UD. PCR teknikak

Ondo funtziona dezan, DNA polimerasa bakoitzari

6.3. PCR estandarra
edo konbentzionala
PCR estandarra, konbentzionala edo
oinarrizkoa PCRaren formarik sinpleena da,
non DNA zati bakarra anplifikatzen den hasle
bikote bakar batekin eta amaieran egindako
anplifikazio-prozesu bakar batean.
Zerk-nola funtzionatzen duen ulertzeko, sakon
aztertu behar dira lau alderdi: erreakzio-
nahastearen konposizioa, nahastearen
prestaketa, termoziklatzailearen programazioa
eta erreakzioaren produktuen analisia.
Mg2+ librearen kontzentrazio optimo bat dagokio.
Erreferentzia gisa, MgCl2 kontzentrazio
estandarrak 1,5 nM-koa izan behar du azken
erreakzio-nahastean Taq polimerasarentzat.
Kontuan izan!
DNA polimerasen zenbait ekoizlek zuzenean
hornitzen dute euren entzimetarako
kontzentrazio optimoa daukan erreakzio-tanpoi
egokia. Beste ekoizle batzuek, ostera,
gabe hornitzen dute erreakzio-tanpoia, eta tutu
osagarri batean eskaintzen dute
kontzentratua (25 mM edo 50 mM)

6.3.1. Erreakzio-nahastea
Erreakzio-nahastean biltzen dira PCRa egokiro
gertatzeko erreakzio-ingurunean egon behar
duten erreaktibo guztiak.
Nahastea indargetzaile edo tanpoi egoki batean
datza. Disolbaturik ditu DNAren erreplikazioa
gertatzeko beharrezko erreaktibo guztiak.
Tanpoiak ematen du pH eta gatz-kontzentrazio
egokia, DNA polimerasak fideltasunik
handienarekin ondo jarduteko.
Desoxinukleotido trifosfatoak
Erreakzio-nahasteak DNA molekula osatzen
duten lau desoxinukleotidoak izan behar ditu,
desoxinukleotido trifosfato gisa (dNTPs). Izan
ere, hori erabiliko du DNA polimerasak substratu
gisa luzatzen ari diren kateetara gehitzeko.
Lau dNTPs-ek kontzentrazio berean egon behar
dute, bestela, txikitu egiten da entzimaren
fideltasuna. Kontzentraturik hornitzen dira, hain
zuzen ere 10 mM kontzentrazio totalean (2,5
mM, dNTP bakoitzeko).

Oro har, Tris oinarriko tanpoiak izaten dira,
kloruro potasikodunak (KCl), eta 8,3 eta 9,0
arteko pHa izaten dute. Normalean, erreakzio-
tanpoi egokia kontzentratua hornitzen da (2×, 5×
edo 10×) DNA polimerasarekin batera. Nagusiki
hauek dira tanpoian disolbatzen diren
erreaktiboak: kloruro magnesikoa,
desoxinukleotido trifosfatoak, hasleak, DNA
polimerasa eta DNA moldea. Zenbaitetan,
lortutako emaitzaren arabera, beste gehigarri edo
indartzaile batzuk behar izaten dira PCRa
optimizatzeko.
Erreakzio-nahastean dNTP bakoitzaren azken
kontzentrazio estandarra 200 μM-koa da.
Hasleak
Lehenago esan bezala, hasleak gako dira
anplifikazio espezifikoak emaitza onak eman
ditzan. Erreakzio-nahastean egon beharreko
hasleen kontzentrazioak berbera izan behar du,
eta bikote bakoitzerako modu esperimentalean
zehaztu behar da.

Erreferentzia gisa, emaitza onak ematen dituzte hasle

Kloruro magnesikoa bakoitzeko 200 eta 400 nM-ko azken kontzentrazioek.

Jarduteko, DNA polimerasa termoegonkorrek

magnesio ioiak (Mg2+) behar dituzte faktorekide DNA polimerasa
gisa. Ioi horiek kloruro magnesikoaren bidez
(MgCl2) gehitzen dira erreakzio-nahastera. DNA polimerasa ere erreaktibo gakoa da PCRa
egokiro gerta dadin. DNA polimerasa jakin bat
Erreakzio-nahastean Mg2+ librearen hautatzeko, anplifikazioan eskatzen den
kontzentrazioa oso txikia bada edo fidelitateari, anplifikatuko den zatiaren luzerari
kontzentraziorik ez badago, DNAren eta, batzuetan, anplifikatuko den sekuentziari
jarduerarik eza gertatzen da. erreparatzen zaio.

Kontzentrazioa oso handia bada,

erreplikazioaren fideltasuna gutxitu egiten da.
 6. UD. PCR teknikak 143

Normalean, DNA polimerasak kontzentraturik 6.4. dokumentua

hornitzen dira, % 50ean glizerola dakarten
soluzioetan. Ekoizleek lanerako kontzentrazio
optimoa zehazten dute, eta 1-2,5 unitate tartean
egoten da 50 μl-ko azken erreakzio-bolumenerako.

Kontuan izan!
DNAren gehiegizko kontzentrazioak erabiltzeak
ez dakarkio onurarik erreakzioaren Jatorria Kutsatzailea
errendimenduari; aldiz, asko handitzen du Muskulu-ehunak Mioglobina
kostua Azala Melanina
Gorozkiak Behazun-gatzak
Landare-ehunak Polisakaridoak
Animalia-ehunak Kolagenoa
DNA moldea Lagin
Lurzorua eta Azido humikoa
biologikoa landareak
DNA moldea beharrezko osagaia da erreakzio- Hemoglobina
Odola
nahastean; izan ere, bertan dago anplifikatu nahi (hemo taldea)
den intereseko zatia. Normalean, 3. unitate EDTA
Odol
didaktikoan deskribatutako edozein metodo Zitrato sodikoa
antikoagulatua
erabilita purifikatutako DNA erabiltzen da. Heparina
SDS
PCRa modu optimoan gerta dadin, kontuan izan Azetato sodikoa
behar dira bai DNA moldearen kalitatea, bai DNA ateratzeko eta Fenola
kantitatea. purifikatzeko Kloroformoa
erabilitako Isopropanola
ADN moldearen kalitatea. Egoera idealean, erreaktiboak Etanola
PCRrako DNA moldeak honako kalitate- Xilola
irizpideok bete behar ditu:
Integritate handia, hots, pisu molekular Kontuan izan!
handiko DNA, hondatu eta zatitu gabea, eta
DNA moldearen kantitate txikiegiek erreakzioaren
akatsik gabea.
errendimendu txikia dakarte. Kantitate handiegiek,
1,7 eta 2,0 arteko A260/A280 kozientea, ostera, nahi ez diren produktuak agertzeko
proteinekin kutsatuta ez dagoela bermatzeko. aukerak handitzen dituzte
Kutsatzailerik gabea, ekidin ahal izateko
PCRaren erreakzioa inhibitzea, dela DNA
inaktibatzen delako, dela Mg2+ librea bahitzen Beste gehigarri eta indartzaile batzuk
delako (ikusi 6.4. dokumentua)
Erreakzio-nahastearen oinarrizko osagaiak
ADN moldearen kantitatea. PCR batean optimizatu direlarik, espero izatekoa da emaitza
emaitzarik onenak lortzeko kantitate egokia onak lortzea. Hala ere, zenbaitetan PCRaren
ikertzen den DNAren konplexutasunaren errendimendua baxua da, edo nahi ez diren
araberakoa da. produktuak agertzen dira anplifikaturik.
Normalean, arazo hauen arrazoia kutsatzaileak
Erreferentzia gisa, DNA plasmidikoarekin lan izaten dira, edo DNAren edo hasleen izaera,
egiten denean, emaitza onak lortzen dira 0,1– zehatz esateko, horien sekuentzia. Kasu horietan,
1 ng kopuruekin. DNA genomiko erreakzio-nahasteari PCRaren indartzaile gisa
bakterianoren kasuan nahikoa izaten da 1-10 jarduten duten gehigarriak gehitzen zaizkio,
ng arteko kopurua. erreakzioaren errendimendua handitzeko edo
Giza DNA genomikoarekin, 100-300 ng-k nahi ez diren produktuen agerrera gutxitzeko.
emaitza onak eman ohi dituzte. Ez da Gehigarri eta indartzaile horiek hainbat modutan
gomendatzen ADN/µl erreakzio-nahasteko 10 jarduten dute, eta ez dituzte eragin onuragarri
ng gainditzea; hau da, ez da komeni 50 µl-ko berak PCR guztietan. Hori dela eta, kasu
azken erreakzio-bolumenerako 500 ng ADN arazotsuetan erabili behar dira soilik, eta eragina
molde baino gehiago erabiltzea. modu esperimentalean aztertu behar da (ikus
6.5. dokumentua).
144 6. UD. PCR teknikak

6.5. dokumentua Gainera, normalean hainbat erreakzio gertatzen

PCRan erabilitako gehigarriak direnez era berean, hodi bakoitzean egin
daitezkeen balizko erroreak ezberdinak dira, eta
Gehigarriak eta horien balizko jardun- horrek eragiten du PCRak egoera ezberdinetan
mekanismoak zerrendatzen dira taula honetan. egitea. Bada, arazo hori ekiditeko eta erreakzio-
Gehigarriak Jarduera-mekanismoa
nahastearen konposizioa homogeneoa izan
DMSO dadin, era berean gertatzen diren proba
Formamida DNA moldearen
Tm-a gutxitzen dute guztietan, onena da nahaste master (master mix
Betaina ingelesez) izeneko erreakzio-nahaste bakarra
Gelatina prestatzea: osagai guztiak biltzen ditu, salbu eta
Glizerola Taq DNA DNA moldea.
Polietilenglikola polimerasa
(PEG) egonkortzen dute Osagai bakoitzaren kantitatea kalkulatzeko,
Behien PCRak elkartzen eta erreakzio baterako behar den kantitatea eta era
albumina (BSA) blokeatzen ditu berean prozesatuko diren lagin kopurua +1
Sulfato amonikoa Desnaturalizazioa errazten biderkatuz lortzen da; izan ere, hobe da azken
du
hodirako nahastea sobera egotea eta ez faltan.
Detergente ez
ionikoak DNA polimerasa
Gainera, kontuan izan behar da laginen kopuruan
Tween-20 gaineratzea ekiditen sartu behar direla teknikaren kontrol positiboa
Np-40 dute eta negatiboa (ikus 6.6. dokumentua).
Triton X-100
Nahaste masterra egin delarik, kantitate egokia
banatzen da erreakzio-hodietan, eta dagozkien DNA
moldeak gehitzen dira.
6.3.2. Laginak
prestatzea
Kontrol positiboa eta kontrol negatiboa
Laginak prestatzeko errekzioaren bolumena
doitu, nahaste «masterra» prestatu eta kontrol Aztertu beharreko laginez (non PCRa gertatuko
positibo eta negatiboa ezarri behar dira. baita) gain, aldi bakoitzean teknikaren kontrol
positiboa eta negatiboa prestatzen dira:
Erreakzioaren bolumena doitzea
PCR bat diseinatzean, erabaki behar da 6.6. dokumentua
erreakzioa gertatuko den nahastearen azken
Nahaste master estandarraren
bolumena zenbatekoa izango den. Normalean 25
edo 50 µl-koa izaten da.
adibidea 10 PCR egiteko

Parametro hori finkatu delarik (erreakzio-

nahastearen osagai guztiak bezala, tanpoia
barne; guztiak ere kontzentraturik gehitzen dira),
nahasteari gehituko zaizkion erreaktiboen
bolumenak kalkulatu behar dira, lortu nahi den
azken kontzentrazioaren arabera. Osagai Erreaktiboa Bolumena/ Hodi Azken Azken
hodia kop. bolumena kontzentrazioa
bakoitzaren bolumenaren arteko gehiketaren eta 10x tanpoia 5 µl 11 55 µl 1x
erreakzio-nahastearen azken bolumenaren MgCl2 50 mM 1,5 µl 11 16,5 µl 1,5 mM
arteko aldea PCR graduko ur antzua erabilita 200 µM
osatzen da. dNTPs 10 mM 4 µl 11 44 µl (cada uno)
F haslea
(20 pmol/µl) 1 µl 11 11 µl 400 nM
Nahaste «masterra» R haslea (20
1 µl 11 11 µl 400 nM
pmol/µl
PCR erreakzioak bolumen oso txikietan egiten Taq DNA
polimerasa 0,5 µl 11 5,5 µl 1,25 U/50 µl
direnez eta osagaiak kontzentraturik ipintzen (2,5 U/µl)
direnez, pipeteatutako horietako bakoitzaren Ur esterila
36 µl 11 396 µl
kantitateak oso txikiak izaten dira (0,5-5 μl mQ
artean); hala, errore-aukera oso handia da. Guztira 49 µl 11 539 µl
 6. UD. PCR teknikak 145

Kontrol positiboa. Nahaste masterra daukan Erreplika-zikloen kopurua azterketarako

hodi bat da, eta bertara gehitzen da
kontrolerako DNA moldea, anplifikatu nahi
den zatia daukana.
Kontrol negatiboa edo zuria. Nahaste masterra
daukan hodi bat da. Bertan DNA moldearen
ordez bolumen bereko PCR graduko ura
ipintzen da; hala, ez da DNArik egongo
erreakzioan.
Laginak eta kontrolak prest daudenean,
termoziklatzailera eramaten dira, PCRa hasteko.
6.3.3. Termoziklatzailea
programatzea
Termoziklatzailea deritzon tresnan gertatzen
da PCRaren erreakzioa.
Tresna horrek ahalbidetzen du ziklo errepikakorrak
programatzea modu automatizatuan gerta
daitezen, inkubaziorako hainbat tenperatura eta
denboratan.
PCR estandar bidez DNA zati bat anplifikatzeko
programatu nahi badugu termoziklatzailea, hiru
etapa nagusiri jarraitu behar diegu. Etapa horiek
azken inkubazio batekin bukatzen dira: horrek
erreakzioaren produktuak mantentzen ditu
makinatik ateratzen diren arte (ikus 6.7.
dokumentua).
1. Hasierako desnaturalizatzea. PCR erreakzioa
hasten duen etapa da. Nahastea zenbait
minutuz 94-95 ºC-an berotzean datza,
erreakzio-nahastean dauden DNA molekula
bikatenario guztiak osoki desnaturalizatzen
direla bermatzeko.
2. Erreplika-zikloak. Etapa honetarako
programatzen dira:
Inkubaziorako tenperaturak eta denborak
oinarrizko PCR zikloaren fase bakoitzerako
(desnaturalizatzea, hasleak hibridatzea eta
luzatzea).
Zenbat aldiz errepikatuko den zikloa, hots,
erreplika-zikloen kopurua.
laginean anplifikatu nahi diren zatien hasierako
kopia-kopuruaren araberakoa izango da.
Zenbat eta ugariagoa izan anplifikatu beharreko
zatia, orduan eta erreplika-ziklo gutxiago
beharko dira anplikoi nahikoa lortzeko. Ohi
denez, 25-35 ziklo artean behar izaten dira,
baina moldeak urriak edo arazotsuak direnean,
40ra artekoak ere izan daitezke. 40 ziklotik gora
eginez gero, asko handitzen da nahi ez diren
produktu inespezifikoak agertzeko aukera, eta
DNA polimerasak jarduera galtzen du
desnaturalizatze-tenperaturetan emandako
denbora dela eta.
3. Azken luzatzea. Etapa honetan PCR
erreakzioa bukatzen da. 5-10 minututan eta
DNA polimerasaren polimerizazio-tenperatura
optimoan egindako inkubazio bakarrean datza;
hala, PCR produktu guztiak osorik eta helize
bikoitzaren forman daudela bermatzen da.
4. Mantentzea. Termoziklatzailearen
programazioa azken inkubazio batekin
bukatzen da beti: denbora mugarik gabe eta 4
ºC-an egiten da, termoziklatzailetik atera artean
laginak mantentzeko eta entzimaren jarduera
deuseztatzeko.
6.6. irudia. Termoziklatzailearen programazio-eskema
PCR estandarra egiteko.

6.7. dokumentua Termoziklatzailea programatzeko protokoloa

Etapa Fasea Tenperatura Denbora Zikloen kopurua

Hasierako desnaturalizatzea 95 ºC 3 min Inkubazio bakarra
Desnaturalizatzea 95 ºC 30 seg
Erreplika-zikloa Hasleak hibridatzea 57 ºC 30 seg 30 ciclos
Luzatzea 72 ºC 45 seg
Azken hedadura 72 ºC 7 min Inkubazio bakarra
Mantentzea 4 ºC ∞ Inkubazio bakarra
146 6. UD. PCR teknikak

6.3.4. Anplifikatutako Hainbat tamainatako hainbat zerrenda agertuz

gero, anplifikazioan nahi ez diren produktuak lortu
produktuak analizatzea direla esan nahi du. Horren arrazoia izaten da
PCR erreakzioa bukatzean, PCRan modu inespezifikoan anplifikatu direla itu
anplifikatutako laginak ateratzen dira espezifikoaz bestelako DNA zatiak. Hala, erreakzioa
termoziklatzailetik, eta emaitza errepikatu behar da, termoziklatzailearen
analizatzen da (anplifikatutako programazioa edo erreakzio-nahastearen osagaiak
produktuak atzematen dira) geletan aldatuta, emaitza espezifikoa lortu arte.
egindako elektroforesesi baten bidez;
normalean % 0,5-2,0 agarosa izaten da,
tamainen markatzaile batekin. Emaitza positiboa

PCRa atzemateko egiten denean, nahikoa izaten

Tamaina egokiko zerrenda bakarrak da zerrenda bakarra agertzea
adierazten du PCRa ondo egin dela.

6.7. irudia. Agarosa-geletan egindako elektroforesia, PCR baten emaitza ikusteko. 1. lerroa: zuria (ez da zerrendarik ageri). 3. lerroa:
tamainen markatzailea (100 pb-ko gehikuntzak). 1-14 lerroak: aztertu beharreko laginak. Lagin guztiek dute aztertutako sekuentzia,
630 pb-koa (emaitza positiboa). Ez da nahi ez diren produktuen zerrenda inespezifikorik ageri.

6.8. irudia. Agarosa-geletan egindako elektroforesiak, bi PCRren emaitzak agertzen dituztenak: nahi ez diren produktuak
atzeman dira bietan. A elektroferesian lagin guztietan ageri da 100 pb-tik beherako zerrenda bat (ikus gezia): hasleen
dimeroei dagokie. B elektroforesian hainbat zerrenda inespezifiko ageri dira, lagin guztietan tamaina ezberdinetakoak.

baieztatu ahal izateko itu-sekuentzia aztertzen
den laginean egon badagoela eta, hortaz,
emaitza positiboa dela bermatu ahal izateko.
Ostera, nahaste masterrean kutsadura-arazoak
baleude, nola baztertu positibo faltsua dela?
Bada, hain zuzen ere horretarako, PCR txanda
bakoitzean era berean prozesatzen da kontrol
negatibo edo zuri bat, non DNA moldea ordeztu
egiten den PCR graduko urarekin.
Elektroferesiaren gelean zuriari dagokion lerroak
garbi agertu behar du, zerrendarik gabe. Zurian
zerrendaren bat agertzeak esan nahiko luke
erreaktiboren bat edo teknikan erabilitako
pipetaren bat kutsatu dela. Horrek txanda
horretako emaitzak indargabetuko lituzke.
Emaitza negatiboa
Aztertu beharreko lagin batean zerrenda
espezifikorik ez agertzeak adierazten du, behin-
behinean, laginak ez daukala itu-sekuentziarik
eta, hortaz, emaitza negatiboa izango litzateke.
Baina, egiazki, hori ez da nahikoa baieztatu ahal
izateko emaitza negatiboa denik; izan ere,
baliteke erabilitako erreaktiboren batek egokiro
ez funtzionatzea edo laginak PCRaren
inhibitzaileak izatea. Nola baztertu aukera
horiek?
Teknikaren kontrol positiboa laginekin batera
prozesatzen da, eta horrek balio du, hain zuzen
ere, erreakzio-nahastea egiaztatzeko. Bada,
erreaktibo guztiek ondo funtzionatzen badute,
kontrol positiboan ikusiko da zerrenda espezifikoa.
Hala gertatu ezean, arazoren bat dago nahaste
masterrean, eta PCR aldia indargabetuta geratzen
da.
Lagin batean inhibitzaileak daudela baztertzeko,
laginaren kontrol positiboa egin behar da:
laginean dagoen kontrol-gene bat anplifikatzeko
beste PCR bat egitean datza. Kontrola egokiro
anplifikatzen bada, baieztaturik geratzen da
lagina negatiboa dela hasiera batean ikertutako
sekuentziari dagokionez. Laginaren kontrol
positiboan ez bada anplifikaziorik gertatzen,
lagina ez da egokia PCRrako.
Kontuan izan!
6. UD. PCR teknikak 147
6.4. PCR estandarraren
modalitateak
PCR estandarra diagnostikatze-helburuekin
erabiltzen da nagusiki, eta 3,5 kb-tik beherako
sekuentziak anplifikatzen dira; horretarako, orain
arte deskribatu ditugun PCR estandarraren
baldintzek emaitza onak eman ohi dituzte.
Nolanahi ere den, nahi ez diren produktu
gutxiago sortu nahi izateak edo tamaina handiko
zatiak anplifikatu nahi izateak zein beste
aplikazio batzuetarako fideltasun handiko
anplifikazioak lortu nahi izateak ekarri du
beharrizan zehatzetara egokitu eta PCR
estandarraren aldaera edo modalitate berriak
garatzea; adibidez, berotan hasitako PCRa, zati
handien PCRa eta fideltasun handiko PCRa.
6.4.1. Berotan hasitako PCRa
Erreakzio-nahastea prestatzeko prestaketa-
aldian, termoziklatzailera eramaten denean zein
tenperatura igotzen denean desnaturalizatze-
tenperaturara lehen aldiz iristeko, anplifikazio-
nahi ez diren produktuak sor daitezke.
Nahi ez diren anplifikazio-produktuak agertzea
ekiditeko, hasleen izaerari loturik batez ere,
berotan hasitako PCRa sortu zen (Hot Start
PCR, ingelesez).
Beraz, berotan hasitako PCRaren oinarria da
entzimaren jarduera saihestea tenperatura
baxuetan. Hainbat estrategiaren bidez lor
daiteke:
Erreakzio-nahastea DNA polimerasarik gabe
prestatzea. Modurik errazena da. Erreakzio-
nahastea DNA polimerasarik gabe prestatzen
da, hodietan isurtzen da eta hodiak
termoziklatzailean ipintzen dira.
Termoziklatzailea martxan jarri delarik, banaka
gehitzen zaio entzima hodi bakoitzari
termoziklatzailearen tenperatura 65 ºC-tik
gorakoa denean. Metodologia neketsua da,
eta kutsadura-arriskua handitzen du.
DNA polimerasa isolatzea nahastearen
gainerako osagaietatik. Tenperatura nahikoa
altua lortu artean entzima nahastearen
gainerako osagaietatik isolatzean datza.
148 6. UD. PCR teknikak
Isolatzea, esaterako, honela lortzen da: DNA
polimerasa argizari-esferen barruan sartuta;
hala, tenperatura altuak lortzen direnean
hasierako desnaturalizatzean, argizaria urtu
egiten da eta entzima erreakzio-nahastean
aske geratzen da.
DNA polimerasa inaktiboa hornituta. Hau
lortzeko anti-gorputz espezifiko batekin
blokeatu behar da; bestela, kimikoki
eraldatua, bateratze termolabil baten bidez
talde blokeatzaile bati lotuta. Edozein
modutan, hasierako desnaturalizatzearen
tenperatura lortzen denean, entzimak bere
jarduera hasten du, dela antigorputz
blokeatzailea desnaturalizatzen delako, dela
loturik zegoen talde kimikoarekiko bateratze
termolabila hausten delako.
6.4.2. Zati handien PCRa
PCR estandarraren errendimendua asko jaisten da
5kb-etik gorako zatiak anplifikatzen direnean.
Horren arrazoia da moztutako produktu asko,
anplikoi espezifikoa baino laburragoak, metatu
direla, eta, hortaz, ezin direla erabili molde gisa
hurrengo zikloetan. Moztutako produktu horiek
agertzea nukleotido ezegokiak gehitzeagatik
gertatzen da ziur asko; izan ere, polimerizazioa
geldotzen edo, zuzenean, geldiarazten dute.
Zati handien PCRa PCR estandarraren aldaera
bat da, 5-35 kb bitarteko zatiak anplifikatzen
direnean errendimendua handitzea
ahalbidetzen duena.
PCR horien diseinuak erreakzio-nahastearen
osaerari eta termoziklatzailearen programazioari
eragiten die.
Erreakzio-nahastea
PCR estandarrean ikusitakoen aldean, aldaera
hauek dagozkio erreakzio-nahastearen osaerari:
DNA polimerasen nahastea. Aldaketarik
garrantzitsuena da. Bi DNA polimerasa
termoegonkorren nahastea erabiltzean datza:
Horietako bat izango da gehiengoa duena
(kontzentrazio handia), jarduera zuzentzailerik
gabea.
Bestea izango da gutxiengoa duena
(kontzentrazio txikia), jarduera
zuzentzailedun osagaia duena (3’>5’
jarduera exonukleasa).
Hala, gehiengoa osatzen duen DNA polimerasak
nukleotido okerra gehitzen duenean eta
polimerizazioa gelditzen duenean (horrek
produktua moztea ekarriko luke), jardun
zuzentzailea daukan DNA polimerasak
nukleotido okerra deuseztu dezake, eta
polimerizazioarekin jarraitu.
Gehigarriak erabiltzea. Erreakzio-nahasteari
gehigarriak gehitzen zaizkio, adibidez:
Glizerola, DNA polimerasak egonkortzeko.
DMSO, desnaturalizatzea laguntzeko.
Potasio-kontzentrazio txikiak erreakzio-
tanpoian. Modu esperiementalean ikusarazi
da potasio-kontzentrazio txikiek lagundu
egiten diotela zati luzeen anplifikazioen
eraginkortasunari.
Termoziklatzailea programatzea
Agerikoa da zati handiak polimerizatzeko
nabarmen handitu behar dela ziklo bakoitzaren
iraupena termoziklatzailea programatzen
denean. Anplifikatuko den zatiaren luzeraren
arabera, 25 minutura arteko tarteak programa
daitezke. Ostera, desnaturalizatze-tarteak
laburtu egiten dira (2-10 segundo) polimerasen
inaktibatzea minimizatzeko.
6.4.3. Fidelitate handiko PCRa
PCRaren produktuak erabiliko diren anplifikazio
batzuetarako (esaterako, adierazpen genikorako
edo klonaziorako), fideltasun handiko PCRa behar
da.
Fideltasun handiko PCRak baldintza
berezietan egiten dira, anplikoietako mutazio
puntualak, nukleotido okerren eraginez sortu
ohi direnak, ekiditeko.
Kasu horietan komeni da aldaketak egitea
erreakzio-nahastearen osaeraren baldintza
estandarretan. Hauek dira aldaketok:
DNA polimerasa termoegonkorrak, jarduera
zuzentzailea dutenak, erabiltzea.
Entzimaren fideltasun handiago baterako
baldintzei laguntzea, doituta:
Erreakzio-nahastearen pH-a. Zenbait
entzimak fideltasun handiagoa izaten dute
ohiko pHa baino pH baxuagoetan, eta beste
zenbaitek pH altuagoetan.
Mg2+ kontzentrazioa. Gehiegizkoa izateak
txikitu egiten du polimerasen fideltasuna.
 6. UD. PCR teknikak 149

PCR estandarraren bidez nahi ez diren produktuak

6.5. Beste PCR metatzea ekidin ezin diren kasuetan espezifizitatea
teknika batzuk handitzeko ere.

PCR batean edo bestean baliatzen diren hasleak

PCR estandarraz gainera, espezifizitate handiagoko
aplikazioak ahalbidetzen dituzten beste teknika
batzuk ere badira. Horien artean dago habia
bidezko PCRa, PCR anizkoitza eta alderantzizko
transkripziodun PCRa.
ezberdinak dira:
Lehenbiziko PCRan luzera handiagoko zati bat,
interesa duen alderdia daukana, anplifikatzeko
diseinatzen dira. Kanpoko hasle esaten zaie.

Bigarren PCRan interesa duen alderdia

6.5.1. Habia bidezko PCRa
Habia bidezko PCRa edo nested-PCR
(ingelesez) akoplaturiko bi PCR erreakzio
egitean datza; hala, lehenbiziko anplifikazioko
produktuak DNA molde gisa baliatzen ditu
bigarren PCRak.
PCR estandarraren errendimendua baxua
denean (anplifikatutako produktu gutxi)
sentsibilitatea handitzeko erabiltzen da, bai eta
anplifikatzeko diseinatzen dira, eta lehenbiziko
PCRan anplifikatutako zatiaren barruan
hibridatzen dira. Barneko hasle esaten zaie.
2. PCRan anplifikatu beharreko lagina 1. PCRko
erreakzioaren produktua da; hala, 1. PCRan
sortutako anplikoiak DNA molde gisa baliatzen dira
2. PCRan, eta sekuentzia horretan dagoen eta
interesa duen alderdia berriz anplifikatzen da.

3’
3’

5’ 3’
3’

6.9. irudia. PCR animatu baten eskema. Lehenbiziko PCRan itu den zatia baino zati handiagoa anplifikatzen da, kanpoko
hasleen bikote bat erabilita. Lehenbiziko PCRan sintetizatutako anplikoiak 2. PCRko lagin moduan baliatzen dira, bi
barneko BI haslerekin batera, nahi den zatia anplifikatzeko.

6.5.2. PCR anizkoitza
PCR anizkoitza edo Multiplex PCR (ingelesez)
zenbait itu-sekuentzia era berean
anplifiklatzean datza, hodi berean eta PCRaren
erreakzio bakarrean.
Hainbat hasle-bikote erabilita lortzen da; bikote
bakoitza espezifikoa da, alderdi jakin bat
anplifikatzeko. Hasleen bikote horiek zenbait
baldintza bete behar dituzte:
Ituarekin hibridatzeko hasleen tenperatura
optimoak antzekoa izan behar du hasle
guztien kasuan; izan ere, termoziklatzailearen
programa bakarra erabiltzean, hasle guztiak
batu behar zaizkio DNA moldeari efizientzia
berarekin hibridatze-faserako programaturiko
tenperaturan.
Hasle-bikote bakoitzak sortutako anplikoiek
behar bezain ezberdinak izan behar dute euren
artean tamainari dagokionez, elektroferesian
banatu ahal izateko eta banakako zerrenda gisa
ikusi ahal izateko.
Behar bezala diseinatu behar dira, ez dezaten
euren artean hibridaturik dimerorik edo
oligomerorik sortu.
PCR anizkoitzaren aplikaziorik sinpleena
atzemate-erreakzio batean barneko kontrol
positibo bat gehitzea da.
Barneko kontrol positiboa erreakzio-
nahasteari hasle-bikote bat gehitzean datza,
non hasleak diseinaturik dauden kontrol-
sekuentzia bat, zehazki aztertu beharreko DNA
moldean agertu behar dena, anplifikatzeko.
6.10. irudia. Elektroferesia agarosa geletan, PCR
anizkoitza ikusteko. Funtsezkoa da era berean
anplifikatutako sekuentziak euren artean nahikoa
ezberdinak izatea tamainari dagokionez elektroferesian
ondo banatu ahal izateko.
6. UD. PCR teknikak 151
Modu horretan, emaitza negatiboak PCR bakar
batean egiaztatzen dira zuzenean, laginaren
kontrol positiborako PCR osagarri bat egin behar
izanik gabe. Hiru emaitza posible daude:
Positiboa. Elektroferesian bi zerrenda ageri
dira: ikertzen ari garen sekuentziari dagokion
zerrenda espezifikoa, eta kontrol positiboari
dagokiona.
Negatiboa. Kontrol positiboari dagokion
zerrenda ageri da soilik.
PCR baliogabea. Ez da zerrendarik ageri.
Horrek adierazten du laginak PCRaren
inhibitzaileak dauzkala.
6.5.3. Alderantzizko PCR
transkripzioduna (RT-PCR)
Alderantzizko transkripziodun PCRa edo RT-
PCR (ingelesez Reverse Transcription-PCR)
teknikaren bidez ARNm molekulak anplifikatu
eta aztertu daitezke.
DNA polimerasa termoegonkorrek DNA
darabiltenez molde gisa, PCR bidez ARNa
anplifikatzeko hauek egin behar dira:
1. Sintesi bidezko aurretiazko pauso bat: ADNc
sintetizatu behar da atzeratranskriptasa (RT)
edo alderantzizko transkriptasa baten bidez.
2. Bigarren pauso bat, non DNA polimerasa
termoegonkor batek DNAc molde gisa
darabilen eta anplifikatu egiten duen.
Bi pauso horiek hodi bakarrean edo bi hodi
independentetan egin daitezke.
ARN moldea transkribatzeko
estrategiak
RTek, DNA polimerasek bezalatsu, hasleak behar
dituzte RNA moldean helize bikoitzeko alderdi
txiki bat osatzeko eta, hala, DNAc sintetizatu ahal
izateko. RT-PCRaren kasuan, purifikatutako ARN
batetik abiatuta, hiru estrategia jarrai daitezke:
Sondak markatzeko erabiltzen den random
priming delakoaren antzeko estrategia bat,
non hexanukleotidoen nahaste bat erabiltzen
den hasle gisa, eta hasle horiek laginean
dauden ARN molekula guztietako hainbat
posiziotan zoriz hibridatzen diren. Estrategia
horren bidez DNAc laginaren RNA guztia
transkribatzen da.
Hasle gisa oligo-dT bat erabiltzea, zeina
hibridatu egingo den laginean dauden RNAm-
poli-A buztanekin.
150 6. UD. PCR teknikak

termoegonkorra

PCRaren
ondoko zikloak

6.11. irudia. Alderantzizko transkripziodun PCRaren (RT-PCR) eskema. Lehenbiziko etapan DNAc bat sintetizatzen da,
RNAm molekula batetik abiatuta eta alderantzizko transkriptaza bat eta hasle bat (eskeman sekuentzia hasle espezifikoa)
erabilita. Etapa hori bukatutakoan, heteroduplex-ak lortzen dira: ARNm/ADNc.
Bigarren etapan PCR estandar bat egiten da, hasle espezifikoekin; hala, lehen etapan DNAc bikatenarioa sintetizatzen da
eta, bigarren ziklotik aurrera, anplikoi espezifikoak sortzen dira.

Estrategia honen bidez laginean dauden RNAm
molekula guztiak DNAc-ra transkribatzen dira.
Sekuentzia jakin bateko hasle espezifiko bat
erabiltzea; zehazki, ondorengo PCRan erabiliko
den hasleetako bat. Estrategia honen bidez,
DNAc-ra transkribatzen da soilik anplifikatu
nahi dugun sekuentzia daukan RNA zatia.
6.6. PCRa denbora
errealean
PCR estandarra eta bere aldaerak, orain arte
aztertutako beste PCR mota batzuk bezala, azken
puntuko erreakziotzat jotzen dira. Hau da, emaitza
ez da jakiten bukatu eta elektroferesi bidez
produktuak analizatu arte.
Denbora errealeko PCRan, ostera, anplifikazio-
prozesua monitorizatu egiten da produktu
fluoreszenteen bidez, eta ziklorik ziklo
atzematen dira anplikoiak.
Denbora errealeko PCRa denbora
errealeko termoziklatzaile batean egiten
da, zeinak, termoziklatzaile arrunt batek
eskaintzen dituen funtzioez gain,
fluoreszentzia bidezko irakurgailu bat
ere badakarren. Hala, PCRaren edozein unetan
erreakzio-hodi bakoitzeko fluoreszentziaren
intentsitatea neur daiteke. Azken puntuko
PCRaren aldean hauek dira denbora errealeko
PCRaren abantailak:
Azkarrago atzematen dira lagin bateko itu-
sekuentziak modu kualitatiboan; hala, PCRa
bukatu baino lehenago izan ditzakegu
emaitzak.
Emaitzak fidagarriagoak dira; izan ere,
fluoreszentzia bidezko atzemate instrumentala
objektiboagoa eta sentiberagoa da
elektroferesi-gel baten etidio bromuro bidez
egiten denaren aldean.
Kutsadura-arazoak minimizatzen dira, bai
anplifikazioa, bai atzematea, hodi itxi berean
egiten direlako.
Fluoreszentziaren intentsitatea eta
sintetizatutako DNA proportzionalak direnez,
denbora errealeko PCRak kuantifikazioa
ahalbidetzen du, bai ekoitzitako anplikoei
dagokienez, bai laginean dagoen hasierako itu-
DNAri dagokionez.
Denbora errealeko PCRaren funtzionamendua
egokiro ulertzeko, atal honetan honako hauek
aztertuko ditugu: anplifikazioaren zinetika eta
anplikoiak atzemateko fluoreszenteak. Horrek
ahalbidetuko digu PCR mota honen aplikaziorik
garrantzitsuenak zein diren ikastea.
152 6. UD. PCR teknikak
6.6.1. Anplifikazioaren
zinetika
Fluoreszentzia eta anplikoen produkzioa lotzea
lortu delarik, PCRaren anplifikazioaren zinetika
azter daiteke anplifikazio-kurba deritzenei esker.
Anplifikazio-kurba sigmoide motako kurba da,
eta PCRaren ziklo bakoitzean fluoresezentzia
irudikatzean lortzen da, gertatzen den ziklo-
zenbakiaren arabera.
Modu nabarmenean bereizten diren hiru eremu
ditu kurbak, anplifikazio-zinetikaren hiru faseei
dagozkionak:
Zarataren eremua edo fasea. Fluoresezentzia
bakarra atzematen da, hain zuzen ere hodi
bakoitzaren hondoko seinale fluoreszenteak
eragiten duena. PCRaren lehenbiziko zikloei
dagokie, eta horietan sintetizatutako anplikoi
kopurua txikiagoa da tresnak atzeman
dezakeena baino; beraz, fluoreszentzia ere
horri lotzen zaio.
Kurba-eremu honen anplitudea lagineko itu-
sekuentziaren kantitatearen araberakoa
izango da. Zenbat eta gutxiago izan lagineko
itu-sekuentziak, orduan eta ziklo gehiago
beharko dira tresnak atzematen duen
entzima-mailatik gorako anplikoien kopurua
lortzeko.
Hazkunde esponentzialaren eremua edo
fasea. Eremu honetako kurba lineala da, malda
handikoa. Ziklo gutxi batzuk hartzen ditu (4tik
6ra), eta anplikoien ekoizpenaren jatorrizko fase
esponentzialari dagokio.
Fluoreszentzia
Atalasea
6.12. irudia. Denbora errealeko PCR baten anplifikazio-
kurba. A) Zarataren eremua: bertan adierazten diren
zikloetan termoziklatzailearen atzemate-mugatik behera
(atalasea) daude anplikoi espezifikoak. B) Hazkunde
esponentzialaren eremua. C) Mesetaren eremua.
Mesetaren eremua edo fasea. Kurbaren
eremu hau ere lineala da, baina ez du
hainbesteko maldarik; izan ere, nabarmen
gutxitzen da PCRaren azken zikloetako
errendimendua, seguruenik, substratuak
bukatzen direlako, polimerasak jarduera
galtzen duelako modu progresiboan, entzima
saturatzen delako, eta abar.
Termoziklatzaileak denbora errealean,
erreakzioak gertatzen direnean, ekoizten ditu
kurba horiek; baina horretarako, anplikoiak
atzemateko sistema fluoreszente bat gehitu
behar da erreakzio-nahastean.
6.6.2. Anplikoiak
atzemateko sistema
fluoreszenteak
Anplikoiak atzemateko sistema fluoreszenteak bi
motatakoak izan daitezke: sekuentziaren
independenteak edo sekuentziaren espezifikoak.
Sekuentziaren atzemate-sistema
independenteak
Sekuentziaren atzemate-sistema
independenteek agente fluoreszente
tartekatzaileak erabiltzen dituzte.
Agente fluoreszente tartekatzaileak substantzia
fluoreszenteak dira, eta fluoreszentzia eragiten
dute helize bikoitzeko DNAn txertatzen direnean.
Beraz, PCRaren ziklo bakoitzean anplikoiak
gehitzen direnean, fluoreszentzia handiagoa
igortzen da.
Kasu horretan, anplifikazio-ziklo bakoitzaren
bukaeran egiten da fluoreszentziaren neurketa,
hain zuzen ere luzatze-fasea bukatzen denean;
izan ere, une horretan anplikoi guztiak egoten
dira helize bikoitzaren itxuran.
Atzemate-sistema honen arazo nagusia da
espezifizitate oso baxukoa dela, agente
tartekatzailea helize bikoitzeko edozein DNA
molekulari lotzen zaiolako, nahi ez diren
produktu inespezifikoak eta hasleen dimeroak
barne.
Kontuan izan!

Sekuentziaren atzemate-sistema
espezifikoak
Sekuentziaren atzemate-sistema espezifikoek
zunda oligonukleotidikoak erabiltzen dituzte,
fluorokromoekin markatutakoak. Azken horiek
hibridatu egiten dira modu espezifikoan
anplikoiaren eremu zentralean.
Modu horretan, fluoreszentzia produktu
desiragarriekin lotzen da, eta atzemate-
espezifizitatea handitzen da.
Hala ere, fluorokromo batekin markatutako
zundak uhin-luzera egokiarekin kitzikatuz gero
soilik eragiten du fluoreszentzia, berdin diolarik
soluzioan aske dagoen edo itu-sekuentziari
loturik dagoen. Beraz, nola lortu zundak
fluoreszentzia eragitea soilik anplikoiari lotzen
zaionean?
Arazo hori konpontzeko, bi fluorokromo akoplatzen
zaizkio zundari, erresonantzia bidezko energia
fluoreszentearen transferentziaren printzipioari
jarraikiz (FRET) (ikus 6.8. dokumentua)
Hidrolisi-zundak
Hidrolisi-zundak edo TaqMan zundak
oligonukleotido sintetikoak dira, notifikatzaile
esaten zaion (reporter ingelesez) fluorokromo
emaile bat dutenak 5’ muturrean eta quencher
bat (fluoreszentea zein ez) 3’ muturrean.
Zunda hibridatu egiten da anplifikatzen den
zatiaren erdiko alderdian, eta DNA polimerasak,
zabaltzea ekiditeko, 3’ muturra fosforilaturik
dauka.
6.14. (A) irudian ikusten da nola jarduten
duen PCR ziklo batean zehar. Mota honetako
zundekin ziklo bakoitzeko luzatze-fasearen
bukaeran neurtzen da fluoreszentzia.
Baliza molekularrak
Baliza molekularrak edo (ingelesez) beacons
molekulak zunda oligonukleotidikoen arteko
zunda mota bereziak dira, espezifikoak
denbora errealeko PCR-rako.
Hidrolisi-zundek bezala, 5’ muturrean
notifikatzaile bat eta 3’ posizioan quencher bat
daramate; baina, aurrekoetatik ezberdintzen dira
mutur biak sekuentzia labur errepikatuak eta
alderantzizkatuak direlako (eta, hortaz,
osagarriak). Artean, erdiko eremua jatorrizko
zunda da, anplifikatzen den zatiaren
erdigunearen sekuentzia osagarri bat daukana.
6. UD. PCR teknikak 153
6.8. dokumentua
Erresonantzia bidezko energia
fluoreszentearen transferentziaren
printzipioa (FRET)
Erresonantzia bidezko energia
fluoreszentearen transferentzia edo FRET
(ingelesez: Fluorescence resonance energy
transfer) honetan datza: fluorokromo batetik
besterako argi-energia transferitzea. Hori
gerta dadin, fluorokromoek gertu egon behar
dute fisikoki, eta lehen fluorokromoaren
igorpen-espektroa gainjarri egin behar zaio
bigarren fluorokromoaren kitzikatze-
espektroari. Energia transferitzen duen
fluorokromoa emailea da, eta jasotzen
duenari hartzaile esaten zaio.
Emailea Hartzailea
{{
Igortzea Eszitazioa
Igortzea
Eszitazioa
Uhinaren luzera
6.13. irudia. Bi fluorokromoren arteko erresonantzia bidezko
energia fluoreszentearen transferentziari (FRET) dagokion
oinarri teorikoa. Transferentzia gerta dadin, beharrezkoa da
fluorokromo emailearen emisio-espektroa zati batean
behintzat gainjartzea kitzikatze-fluorokromo hartzailearekin
(eremu grisa).
Bi baldintzak betetzen badira, fluorokromo
emaileak energia xurgatzen du uhin-luzera
egoki batekin kitzikatzen denean, eta
fluoreszentzia igorri beharrean energia hori
transmititu egiten dio fluorokromo
hartzaileari, zeina, era berean, kitzikatu egiten
den eta hari dagokion fluorezentzia eragiten
duen.
Kasu horretan, hartzaileak «neutralizatzaile»
edo emailearen «apaltzaile» gisa (quencher
ingelesez) jarduten du, eta ekidin egiten du
dagokion fluoreszentzia eragitea.
Badira zenbait molekula ez-fluoreszente gai
direnak energia fluoreszentea jasotzeko
erresonantzia bidez. Quencher ez-fluoreszente
esaten zaie.
Ohiko baldintzetan, zunda hauek urkila-itxurako
bigarren mailako egitura hartzen dute (muturrak
osagarriak direlako), eta erdiko eremua
kiribildurik ageri da. Horrela kokaturik,
notifikatzailea eta quencher-a oso gertu daude,
eta, hala, notifikatzailearen fluoreszentzia
atzematen da (ikusi 6.14.B1 irudia).
154 6. UD. PCR teknikak

Zunda DNA moldeari lotzen zaionean, DNA
moldearekin parekatu ezin daitezkeen bi
muturrak banatu egiten dira; hala, notifikatzailea
kitzikatzen denean, azken horrek fluoreszentzia
eragiten du (ikus 6.14.B2 irudia).
Zunda horien bidez, hibridatze-fasearen
bukaeran neurtzen da fluoreszentzia.
FRET zundak
FRET zundak zunda-bikoteak dira, anplikoiaren
alderdi zentralean hibridatzen direnak ondoko
eremuetan.
Horietako batek notifikatzaile bat darama 3’
posizioan, eta beste batek quencher fluoreszente
bat 5’ posizioan (ikus 6.14.C1 irudia).
Dagozkien itu-sekuentziekin hibridatzean, bi
fluorokromoak oso gertu geratzen dira (bat eta
bost oinarri bitartean); hala, notifikatzailea
kitzikatzean energia transferitzen zaio quencher-
ari, azken hori kitzikatu egiten da eta
fluoreszentzia eragiten du (ikus 6.14.C2 irudia).
Zunda horiekin hibridatze-fasearen bukaeran
neurtzen da fluoreszentzia, notifikatzailea
kitzikatzen da eta quencher-a atzematen da.

6.14. irudia. Sekuentziaren atzemate-sistema espezifikoak:

A. Denbora errealeko PCR ziklo baten eskema, non TaqMan edo hidrolisi-zundak erabiltzen diren. Zunda osorik
dagoenean (ez dio axola soluzioan aske edo DNA moldeari loturik egoteak), notifikatzailea kitzikatzeak eragiten
du energia fluoreszentea transferitzea, hain zuzen ere notifikatzailetik quencher-era; beraz, ez dago
fluoresezentziaren emisiorik (1 eta 2). Haslea luzatzean, DNA polimerasak zunda hidrolizatzen du, nukleotidoz
nukleotido, bere exonukleasa 5’>3’ jardueraren bidez eta, hala, askatu egiten dira erdialdera bai notifikatzailea,
bai quencher-a, eta banatu egiten dira (3 eta 4). Luzatzearen bukaeran notifikatzailea kitziklatzen da, eta
fluoreszentzia eragiten du (5).
B. Denbora errealeko PCRan baliza molekularrek nola funtzionatzen duen erakusten duen eskema .
C. Denbora errealeko PCRan FRET zundek nola funtzionatzen duten erakusten duen eskema.

6.6.3. PCRaren aplikazioak
denbora errealean
Denbora errealeko PCRaren aplikaziorik
garrantzitsuenak hauek dira: denbora errealeko
PCR kuantitatiboa eta mutazioak atzematea
fusio-kurbaren bidez.
Denbora errealeko PCR
kuantitatiboa (qPCR)
Denbora errealeko PCR teknologiaren aplikazio
bati deritzo denbora errealeko PCR
kuantitatiboa edo qPCR. Bada, lagin batean
dagoen azido nukleikoko molekula baten
hasierako kantitatea kuantifikatzea
ahalbidetzen du.
Kalkulu hori egiteko, denbora errealeko
termoziklatzaileak atzeman egiten du zein PCR
ziklotan lortzen duen laginaren fluoreszentziak
atzemate-muga baino balio handiagoa. Ziklo
horri ebakera-zikloa, Cp, esaten zaio (ingelesez
Crossing point) edo atalase-zikloa, Ct (ingelesez
Threshold cycle).
Anplifikazio-kurban Cp zarata-eremutik
hazkuntza esponentzialaren eremura igarotzen
deneko zikloa da, non bat-bateko gorako bira bat
irudikatzen den.
Lagin baten Cp-a alderantziz proportzionala zaio
bertan dagoen itu-molekularen hasierako
kantitateari. Zenbat eta handiagoa izan itu-
sekuentzien kopurua laginean, orduan eta PCR
ziklo gutxiago beharko dira Cp-ra iristeko.
Hori horrela izanik, kuantifikazioa bi modutara
adieraz daiteke: modu absolutuan edo modu
erlatiboan.
Kuantifikazio absolutua
Kuantifikazio absolutuaren probetan azken
emaitza (lagineko itu-sekuentziaren kantitatea)
kontzentrazio-unitatetan (adibidez, μg/μl)
adierazten da, edo bolumeneko kopia-kopurua
adierazita.
Kuantifikazio mota honek kalibratze-kurba bat
egitea eskatzen du, kontzentrazio jakin bat
daukaten patroiekin edo ezagutzen den kopia
kopurua duten patroiekin. Patroi horiek era
berean prozesatzen dira, aztertu beharreko
laginen PCR-txanda berean.
Termoziklatzailearen analisirako
softwareak patroien Cp-en arabera
6. UD. PCR teknikak 155
zehazten du kalibratze-kurba, eta lagin
bakoitzaren Cp interpolatzen du, emaitza
kalkulatzeko.
Proba horiek oso erabilgarriak dira karga biralak,
tratamenduei ematen zaien erantzunak (farmakoen
efikaziaren kontrola), adierazpen genikoak…
kuantifikatzeko.
Kuantifikazio erlatiboa
Kuantifikazio absoluturako proben emaitzak
baldintzatu egiten dituzte lagin ezberdinen
purifikazio hobeek edo txarragoek, DNAc-aren
sintesiaren efizientziak (ARNm aztertzen
denean), pipeteatzean egindako okerrek eta
abarrek.
Akatsak eragin ditzaketen arrazoi edo
zehaztugabetasun horiek ekidin egin daitezke, hain
zuzen ere kuantifikazio erlatiboa erabilita.
Kuantifikazio erlatiboa honetan datza: itu-
sekuentziaren kontzentrazioa adieraztea
erreferentzia-gene baten arabera; bada,
erreferentzia-gene hori lagin guztietan ageri
da, eta kopia kopuru konstantea du.
Gisa honetako probetan ez da behar patroien
bidezko kalibratze-kurbarik.
Fusio-kurbak eta mutazioak atzematea
qPCRen beste aplikazio garrantzitsu bat da fusio-
kurben bidez mutazioak atzematea.
Fusio-kurba grafiko bat da, fluoreszentzia
adierazten duena, denboraren aldean.
Denbora errealeko termoziklatzaileak prestaturik
daude anplifikatutako produktuen fusio-kurbak
egiteko. Printzipioz, funtzio hau nahi ez diren
produktuen anplifikazioa atzemateko
espezifizitate-kontrol gisa diseinatu zen,
atzemate-sistema moduan agente tartekatzaile
bat erabiltzen denerako.
PCRa bukatu delarik egiten da kurba.
Horretarako, jaitsi egiten da tenperatura, hain
zuzen ere DNA guztia helize bikoitzaren itxuran
egotea ahalbidetzen den arte (60-65 ºC).
Hortik aurrerakoan tenperatura geldiro igotzen
da, desnaturalizatze-tenperaturara iritsi arte (95
ºC). Artean, fluoreszentziaren intentsitatearen
bariazioa etengabe monitorizatzen da.
Demagun PCRa espezifikoa izan dela eta ez dela
nahi ez den produkturik sintetizatu.
 156 6. UD. PCR teknikak

egin ahala, gutxitu egiten da fluoreszentzia, zunda

Hasieran, fluoreszentzia maximoa da, eta geldiro-geldiro askatzen joaten delako.
gutxitzen da anplikoaiaren fusio-puntura iritsi arte.
Orduan, fluoresezentzia bat-batean txikitzen da eta Fusio-erpinen kurbak hiru motatakoak izan daitezke:
kurban inflexio-puntu bat agertzen da.
Fusio-erpin bakarreko kurba, zundaren
fusio-puntuari dagokion tenperaturan.
Fusio-puntua hobeto ikusi ahal izateko,
DNA moldeak mutaziorik ez duela
termoziklatzailearen softwareak beste kurba bat
adierazten du.
kalkulatzen du aurreko kurbatik abiatuta. Kurba horri
fusio-erpinen kurba esaten zaio; izan ere, kurba horretan Fusio-erpin bakarreko kurba, zundaren
anplikoiaren fusio-puntua erpin baten itxuran ageri da fusio-puntutik beheragoko
adierazirik. tenperaturan. Homozigosi-mutazioa
ageri dela adierazten du.
PCRa bukatzean nahi ez ziren produktuak ere sintetizatu
badira, hainbat inflexio-puntu ageriko dira, eta fusio- Bi fusio-erpindn kurba, erpin bat
erpinen kurban hainbat erpin agertuko dira. Hori zundaren fusio-tenperaturan eta bestea
gertatzen da nahi ez diren produtkuen fusio-puntuak ez beheragoko tenperaturan.
direlako anplikoiarenak bezalakoak. Heteroziglosi-mutazioa adierazten
du.
Gaur egun zunda fluoreszente bakarraren bidez zein
FRET zunda-bikoteen bidez lortutako fusio-kurbak
erabiltzen ari dira mutazio puntualak atzemateko. FRET zundak erabiltzean, oinarri berari
Atzematea honetan datza: zunda txiki bat osatzen duen jarraitzen zaio; baina, bi baldintza bete
hibridoaren Tm-a nabarmen jaisten da parekatu gabeko behar dituzte:
oinarri bat (mutazio puntuala) dagoenean itu-sekuentzia
batean. Notifikatzailea daukan zunda mutazio-
eremuan hibridatu behar da.
Zunda bakarra erabiltzen denean (esaterako, baliza Notifikatzailea daukan zundaren Tm
molekular bat), zunda horrek mutazio-eremua estali quencher-a daukan zundarena baino
behar du. Kurbaren hasieran fluoreszentzia maximoa da, apur bat txikiagoa izan behar du
zunda anplikoiari loturik dagoelako. Tenperaturak gora (lehenago aska dadin).

a AMuestra
lagina A
FLUORESZENTZIA

ci Muestra B
dRFU/dT

B lagina

o
Curva de
rescen Produto no deseado
u
l fusión
F

Temperatura °C
6.15. irudia. Denbora errealeko PCR batean lortutako A eta B laginen fusio-kurbak eta fusio-erpinak.
A laginean inflexio-puntu bakarra ageri da fusio-kurban; halaber, fusio-erpin bakarra dago: anplikoi
espezifikoari dagokio.
B laginean inflexio-puntu bakarra agertzen da fusio-kurban, eta bi fusio-erpin: bat anplikoi espezifikoari dagokio,
bestea anplifikazioan lortutako nahi ez den produktu inespezifiko bati.
 6. UD. PCR teknikak 157

Ariketak
1. DNA molekula bikatenario baten (DNA moldea) sekuentziak ageri dira jarraian, bai eta berorren
eremu bat anplifikatzeko erabili diren bi haslerena ere. Ebatzi beheko auzi hauek:
a) Parekatu hasle bakoitza DNA moldean dagokion itu-sekuentziarekin.
b) Adierazi zein den F haslea eta zein den R haslea.
c) Zenbat pb izango ditu anplikoiak?
d) Markatu anplikoia DNA moldearen molekulan.
5’ – GGAAACCCTGTCCAAAGCAAGGGCTATCGGGTATCACCTCTGACCATCCTTCCCATTCATCCTCCAGGTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3’ – CCTTTGGGACAGGTTTCGTTCCCGATAGCCCATAGTGGAGACTGGTAGGAAGGGTAAGTAGGAGGTCCAG
AAGTCTGGCACCATCTTTGACAACTTCCTCATCACCAACGAGACGTGGGGCGTAACAAAGGTGAGGCCTGGTCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTCAGACCGTGGTAGAAACTGTTGAAGGAGTAGTGGTTGCTCTGCACCCCGCATTGTTTCCACTCCGGACCAGG
TGGTCCTGATGTCGGG – 3’
||||||||||||||||
ACCAGGACTACAGCCC – 5’
1. haslea: 5’ – AAGCAAGGGCTATCGGGTAT – 3’
2. haslea: 5’ – ACCAGGCCTCACCTTTGTTA – 3’

2. DNA polimerasa termoegonkorrei dagokienez:

a) Adierazi zein diren PCRan erabili ahal izateko DNA polimerasa batek izan behar
dituen ezaugarri nagusi biak, eta azaldu zergatik.
b) Azaldu zer ezberdintasun dagoen jarduera zuzentzailea daukan polimerasa baten eta
jarduera zuzentzailerik ez polimerasa baten artean.
c) DNA polimerasa baten polimerizazio-tenperatura optimoa 42 ºC-koa da, eta jarduera
mantentzen du bi ordutan 100 ºC-an egon ondoren. PCR batean erabil daiteke entzima
gisa? Arrazoitu erantzuna.

3. Zerrendatu PCR bateko nahaste estandar baten osagaiak eta azaldu zer funtzio betetzen duen
zerrendatutako osagai bakoitzak erreakzioan.

4. Argitalpen zientifiko batean jasotako PCR bateko baldintza hauek lortu nahi ditugu:
PCR baterako erreakzio-nahastearen azken bolumena: 25 μl.
MgCl2-aren azken kontzentrazioa: 1,5 mM.
dNTPs bakoitzaren azken kontzentrazioa: 200 μM. Hasle bakoitzaren (F eta R) azken
kontzentrazioa (F y R): 400nM.
Taq DNA polimerasa: 1 U.

Horretarako, PCR-kit bat daukagu, honako erreaktibo hauek dituena:

Erreakzio-tanpoia: 10x.
MgCl2 : 25 mM.
dNTPs soluzioaren azken kontzentrazioa, guztira: 10 mM.
F eta R hasleen kontzentrazioa: 10 pmol/μl bakoiotzak.
Taq DNA polimerasaren kontzentrazioa: 2 U/μl.

Kalkulatu osagai bakoitzaren kantitateak 10PCRko erreakzio-nahastea prestatzeko, kontuan izanik PCR
bakoitzean DNA moldearen 1 μl gehituko dela.

5. Ikus ezazu praktika jakin honi dagokion bideoa helbide honetan:

https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E. Zein helbururekin aplikatzen da PCR teknika?
Identifikatu eta irudikatu eskema baten bidez jarraitzen diren pausoak.
158 6. UD. PCR teknikak

6. Sei lagin aztertu dira PCR bidez, zitomegalobirusik ageri den

atzemateko. PCRa hasle espezifikoekin egin da, genoma
biralaren 250 pb-ko zati bat anplifikatzeko; halaber, bi hasle
espezifiko erabili dira Beta-globinaren 400 pb-ko zati bat
anplifikatzeko, kontrol positibo gisa. Erreakzioa bukatzean,
erreakzio bakoitzeko produktuen (2tik 7ra) elektroferesia egin
da agarosa-geletan (% 2an), 1. lerroan ageri den tamaina-
markatzaile batekin batera (100 pb-ren multiploak).
Elektroferesiaren irudia ondoko irudian ageri da.

7. Adierazi lagin bakoitzean lortutako emaitza ,eta arrazoitu

erantzunak.

8. Lotu zure koadernoan PCR aldaera edo mota bakoitza dagozkien entzima edo hasleekin.
PCR anizkoitza A. Kanpoko bi hasle eta barneko bi hasle, ondoz ondoko bi
1. PCRtan.
Zati handietarako PCRa B. Alderantzizko transkriptasa + DNA polimerasa termoegonkorra
2.
Habia bidezko PCRa (nested-PCR) C. Jarduera zuzentzailerik gabeko DNA polimerasa +
3. )
Jarduera zuzentzailedun DNA polimerasa
Hot Start PCR D. Jarduera zuzentzailedun DNA polimerasa
4.
RT-PCR E. Hainbat hasle-bikote PCR berean
5.
Fidelitate handiko RT-PCRa F. DNA polimerasa inaktiboa lehen aldiz desnaturalizatze-
6. tenperatura lortzen den arte.

9. RNAm molekula batetik abiatuta, irudikatu alderantzizko transkripzioaren eskema eta RT-PCR
baten lehenbiziko hiru zikloak, non DNAc lortzeko poli-T hasle bat erabiltzen den c.
DNAc bikatenarioko zenbat anplikoi espezifiko lortzen dira hirugarren zikloa bukatzean?

10. Osatu zure koadernoan denbora errealeko PCRari buruzko beheko baieztapenak, egokiak ez diren
pasarteak ezabatuta.
a) Agente tartekatzaileak erabiltzen direnean:
Ziklo bakoitzaren hibridatze-/luzatze-fasearen bukaeran neurtzen da fluoreszentzia.
Fluoreszentzia handitu/txikitu egiten da ziklo-kopuruak handitu ahala.
b) Hidrolisi-zundak edo TaqMaqn zundak erabiltzen direnean:
Ziklo bakoitzaren hibridatze-/luzatze-fasearen bukaeran neurtzen da fluoreszentzia.
Fluoreszentzia handitu/txikitu egiten da ziklo-kopuruak handitu ahala.
c) Baliza molekularrak erabiltzen direnean:
Fluoreszentzia handitu/txikitu egiten da ziklo-kopuruak handitu ahala.
Notifikatzailea/quencher-a kitzikatzen da eta notifikatzaileak/quencher-ak eragindako
fluoreszentzia neurtzen da.
d) FRET zundak erabiltzen direnean:
Ziklo bakoitzaren hibridatze-/luzatze-fasearen bukaeran neurtzen da fluoreszentzia.
Notifikatzailea/quencher-a kitzikatzen da eta notifikatzaileak/quencher-ak eragindako
fluoreszentzia neurtzen da.

11. Esan beheko baieztapenok egia edo gezurra diren. Arrazoitu erantzuna gezurra izanez gero.
a) qPCRan ebakera-puntua (Cp) anplifikazio kurba zarataren eremutik hazkuntza esponentzialaren
eremura igarotzen deneko zikloa da.
b) Lagin baten Cp-a laginean dagoen itu-molekularen hasierako kontzentrazioarekiko proportzionala da.
Zenbat eta hasierako kontzentrazio gehiago, orduan eta handiagoa da Cp.
c) Denbora errealeko termoziklatzaile batek sortutako fusio-erpinen kurban Tm ezberdinetan
anplifikatutako zenbat produktu (espezifikoak eta ez-espezifikoak, denak ere PCRan
sintetizatutakoak), hainbeste erpin agertzen dira.
 6. UD. PCR teknikak 159

6.1. jarduera
Beta-globina genea anplifikatzea, odol periferikoaren DNA lagin
batetik abiatuta
Azalpena

Jarduera honen helburua da gaitasunak garatzea PCR bat egiteko behar diren prozeduretarako
(erreakzio-nahastea prestatzeko eta termoziklatzailea erabiltzeko), eta ondoren erreakzioko produktuak
aztertzeko (anplifikatutako zatiak atzemateko) % 2an agarosa daukan geletan egindako
elektroferesiaren bidez.

3.1. jardueran (3. unitate didaktikoa) odol periferikoaren DNA purifikatuko lagin bat lortu genuen; bada, hori
izango da jarduera honen abiapuntua, bai eta Beta-globinaren generako hasle espezifikoak ere. PCR
arruntaren bidez, genea anplifikatzeko ahalegina egingo dugu.

Tresnak eta erreaktiboak

PCRrako: termoziklatzailea, PCR kita (kontzentratutako tanpoia, MgCl2, dNTPs, Beta-Globinarako F eta R
hasle espezifikoak, Taq DNA polimerasa).

Elektroferesirako: elikatze-iturria, elektroferesirako kubeta, transiluminatzailea, agarosa-gela eta

elektroferesirako ohiko tanpoiak.

Garapena
Hiru edo lau pertsonako taldeak osatuta egingo duzue jarduera. Hasi baino lehen, planifikatu egin
beharreko lana, lanerako beharko duzuen materiala kontuan izanda, eta banatu atazak zuen artean.
Prestatu lanerako beharko duzuen materiala, soluzioak edo erreaktiboak.
Kalkulatu sei PCR-rako erreakzio-nahasterako behar diren osagai bakoitzaren kantitateak, kontuan izanik
PCR bakoitzean DNA moldearen 1 μl gehituko dela eta erreaktibo bakoitzaren azken kontzentrazioak
honako hauek izango direla:
PCR baterako erreakzio-nahastearen azken bolumena: 25 μl. Tanpoiaren azken kontzentrazioa: 1x.
MgCl2-aren azken kontzentrazioa: 1,5 mM. dNTPs-en azken kontzentrazioa: 200 μM bakoitzak. Hasle
bakoitzaren (F eta R) azken kontzentrazioa: 400nM. Taq DNA polimerasa: 1 U.
Bete uneoro segurtasun-neurriak eta hartu arriskuak ekiditeko neurriak. Ez ahaztu biologia molekularreko
laborategian jarraitu beharreko kalitate-irizpideak, materiala eta erreaktiboak esterilitate-baldintzetan
manipulatzeko arauak, lanerako protokoloak, sortutako hondakinak kudeatzeko prozedurak eta abar.
Programatu termoziklatzailea Etapa Fasea Tenperatura Denbora Ziklo kop.
protokolo honi jarraituta:
Inkubazio
Hasierako desnaturalizatzea 95 ºC 3 min
PCRa bukatzean, atera hodiak bakarra
termoziklatzailetik eta atzeman Desnaturalizatzea 95 ºC 30 seg
anplifikatutako produktuak
Erreplika- Hasleak
elektroferesiaren bidez, tamainen fasea hibridatzea
57 ºC 30 seg 30 ziklo
markatzaile batekin batera.
Luzatzea 72 ºC 45 seg
Elektroferesia amaitutakoan, notatu Inkubazio
behaketaren bidez eta gel- Azken luzatzea 72 ºC 7 min
bakarra
argazkiaren bidez lortutako
Inkubazio
emaitzak. Mantentzea 4 ºC ∞
bakarra
Balorazioa
Deskribatu zer-nolako zailtasunak izan dituzuen jardueran.
Sortu al da nahi ez zen produkturik? Deskribatu zer zuzenketa erabili dituzuen produktu horiek zuzentzeko.