Chương 5

Công nghệ sản xuất và tinh chế

protein tái tổ hợp

1
5.1 Giới thiệu về protein tái tổ hợp

2
 Protein tái tổ hợp là gì?
Protein lạ được sản xuất bởi từ tế bào/cơ thể sinh vật chủ
ban đầu không mang gene mã hóa protein này

Mục đích gì?

- Tạo ra nhiều protein/enzyme
- Thay đổi vật chủ để sinh tổng hợp
- Thay đổi để hoạt tính protein/enzyme tốt hơn, phù
hợp hơn so với protein nguyên bản

3
 Sử dụng trong những lĩnh vực nào?

Y học protein/enzyme dùng cho chuẩn đoán, điều trị bệnh

Dược: protein làm vaccine, làm thuốc (hormones, cytokines…)
Hóa dược: enzyme tổng hợp dược chất
Chăn nuôi/Thú y: protein/enzyme dùng chuẩn đoán, điều trị bệnh,
sản xuất thức ăn chăn nuôi…
CN thực phẩm: enzyme dung trong chế biến, bảo quản thực phẩm
CN nhẹ: enzyme trong công nghiệp dệt, giấy…
Môi trường enzyme làm kits, sensor, pin nhiên liệu.…

4
Thị trường TG về protein tái tổ hợp 2018

Khác
Công nghiệp
công nghệ Sinh học Nghiên cứu cơ bản

Nghiên cứu thuốc mới

Điều trị bệnh

https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/recombinant-protein-market
5
 Ứng dụng trong Y -Dược

Protein tái
tổ hợp
chiếm 20%

https://sciex.com/community/blogs/blogs/the-future-of-biologics-drug-development-is-today
6
 5.2 Thiết kế hệ thống biểu hiện
vượt mức protein tái tổ hợp
1. Lựa chọn protein đích
Từ bước 1-4
có thể thay 2. Xác định trình tự gene
đổi, tùy thuộc 3. Chọn mô để chiết tách DNA hoặc RNA
vào kĩ thuật sử
dụng
4. Nhân (copy) nhiều phiên bản gene bằng PCR
5. Chèn sản phẩm gene vào vector biểu hiện
6. Chọn dòng tế bào chủ để biểu hiện vượt mức
protein

7
 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, ví dụ để làm thuốc

1. Xác định 7. Vector

6. Chèn sp PCR vào mang gene
protein/gene đích vector biểu hiện tái tổ hợp 12. Tối ưu biểu hiện
2. Xác định trình tự aa
của gene từ dữ liệu 13. Nuôi trồng quy mô lớn
NCBI

8. Biến nạp vào E.coli

3. Tinh chế tổng mRNA 14. Tinh chế protein

9. Kiểm tra trình 15. Kiểm tra chất lượng
tự và chiều gắn của quy trình: độ ổn định,
4. Tổng hợp cDNA độ tinh sạch, hoạt tính,
của gene
nhiễm tạp (virus)…
10. Biến nạp vào dòng
5. Khuếch đại gene (PCR) tế bào 16. Phối trộn
tá dược

11. Sàng lọc dòng TB biểu hiện HT ổn định 8

Thuốc
 Tổ chức gene ở prokaryotic & eukaryotic cells

1 promoter → 1 mRNA→ nhiều peptide

polycitronic

Protein từ eukaryotic nhất thiết phải dùng mRNA

1 promoter → 1 mRNA→ 1 peptide

monocitronic 9
Cấu trúc gene ở TB Eukaryote & quá trình RNA
•Hầu hết các gene tế bào
động vật đều gồm những
đoạn DNA mã hóa (exons)
và những đoạn DNA
không mã hóa protein
(introns).
• Sản phẩm mRNA trưởng
thành mã hóa cho protein
có trình tự liên tục (chỉ
gồm exon)
•Hầu hết các mRNAs tế
bào động vật chứa đuôi
poly-A “A tail,” đó là một
sợi có100–300 dATP, có
vai trò để vận chuyển
mRNA từ nhân vào
cytosol tới ER đồng thời
cũng giúp mRNA tránh bị
phân hủy. 10
 Tổng hợp cDNA (Reverse transcribing)_
complimentary DNA (cDNA)

Xem VIDEO CLIP

•cDNA được tổng hợp với một

primer: poly-T oligonucleotide
primer hoặc random hexamer
primer
11
1. Các phương pháp tạo dòng gene (Cloning)

1.1 Dựa trên trình tự gene/ protein đã biết

• Phương pháp PCR trực tiếp (prokaryote)
• Phương pháp tổng hợp gene
1.2 Dựa trên một phần trình tự gene đã biết
Phương pháp lai (DNA hybrization)
1.3 Dựa trên hoạt tính protein
• Tạo dòng ngẫu nhiên từ thư viện DNA hoặc thư viện cDNA

12
 1.1 Dựa trên trình tự gene/ protein đầy đủ

Trình tự gene (NCBI)

Prokaryote Eukaryote
Tổng hợp gene DNA, có vị trí
Tổng RNA
ER tương ứng trên vector, có
Tổng DNA promotor phù hợp, có RBS, có
cDNA codon phù hợp cho biểu hiện

Phản ứng PCR-1 với cặp mồi đặc hiệu

Chèn vào vector nhân dòng

Thể biến nạp đơn dòng

Tìm dòng tái tổ hợp bằng PCR-2

13

Giải trình tự gene

 1.4 Tổng hợp gene (đã biết trình tự)
Hiện nay có thể tổng hợp gene lên đến 3 kbp (khoảng 1000 aa).
Đọc thêm các pp mới (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5178364/)

Đã điều chỉnh codon usage trong trình tự primer

cho phù hợp với hệ thống tế bào chủ!

14
Codon bias

15
 Điều chỉnh codon
(codon harmonization/ codon optimization)

Thông thường protein biểu hiện trong tế bảo chủ không phù hợp mã codon nên
hiệu suất thấp, hoặc hoạt tính thấp vì không đúng trình tự aa -“codon bias”
Condon harmonization thực chất là đột biến trình tự gene để có được trình tự aa
cuối cùng tốt nhất gần nhất với nguyên bản.
*Xem them CLIP: https://www.youtube.com/watch?v=P-fjZPf3Dnw

Có thể tự tối ưu hóa:

- Tính CAI: http://genomes.urv.es/CAIcal/
- Download bảng codon của tế bào chủ: http://www.kazusa.or.jp/codon
- Sử dụng các phần mềm để tối ưu hóa sau:
https://www.idtdna.com/CodonOpt
http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/

Hoặc, thuê công ty làm việc này ví dụ: https://www.genscript.com/codon-opt.html

Ở Vietnam, PhuSaChem có dịch vụ này
16
2. Các phương pháp biểu hiện protein (Displaying)
1. Biểu hiện ở phage
2. Biểu hiện ở tế bào vi khuẩn
3. Biểu hiện ở nấm men
4. Biểu hiện ở tế bào động vật

Gene đã điều chỉnh codon cho phù hợp với vật chủ!
Gene tái tổ hợp sát nhập vào genome của vật chủ tính ổn định của hệ
thống biểu hiện cao nhất, nhưng khi ấy là GMO!

17
Vector biểu hiện (protein)

Stop codon

/ Tế bào chủ là E. coli

Start codon Mỗi tế bào chủ

khác nhau đòi hỏi
vector khác nhau,
phù hợp để biểu
hiện protein tái tổ
hợp

18
Biểu hiện ở vi khuẩn (Nội bào)
Một phần biểu hiện ngoại bào, phần lớn biểu hiện nội bào
ATG Stop
Protein nguyên bản B1 B2
Gene
Promoter
rbs

Apr

ATG Stop
Protein dung hợp B1 B2
Gene
Promoter
6xHis Myc
rbs GST V5
Protein dung
hợp với His-Tag Apr

19
 Ví dụ: biểu hiện protein-His Tag
6xHis-Trx
GST Fusion1 6xHis Fusion2 Fusion

GUS GFP b-Gal b-Gal GFP b-Gal

- + - + -+ - + - + -+ - + -+ -+ - + - + -+

E. coli strain BL21 SI (salt-inducible, T7 promoter)

1 pDEST™15
2 b-Gal : beta-galactosidase
pDEST™17
GFP: Green Fluorescent Protein
GUS: beta-glucuronidase (GUS reporter system
được sử dụng nhiều trong sinh học phân tử thực vật)
20
•Giai đoạn sau dịch mã của protein xảy ra ở thể ER và Golgi, vì vậy không
có ở prokaryote. (1) ribosome gắn vào mRNA, bắt đầu dịch mã, 20 aa đầu tiên là P tín
hiệu SRP; (2) SRP gắn tín hiệu; (3) SRP gắn vào màng ER kéo theo Ribosome ; (4)
SRP rời khỏi ER;(5) Ribosome gắn vào màng ER; (6) dịch mã tiếp tục; (7) một đoạn
oligosaccharide bao đã hoạt hóa phosphate được chuyển tới vị trí aa Asparagine (N)
trên protein đang kéo dài; (8) protein-carbohydrate lai hợp được vận chuyển tới Golgi;
(9) tại Golgi nó được cắt bỏ bớt phần carbohydrate bao ngoài bằng glucosidases; sau
21
Một số vấn đề của protein tái tổ hợp dạng nội bào prokaryotes
• Tích tụ protein tái tổ hợp, chứa nhiều dạng protein thể vùi
• Tổng hợp protein phụ thuộc vào tốc độ tổng hợp protein, tức phụ thuộc
điều kiện sinh trưởng
• Thường dùng plasmid có số copy thấp.
• Nuôi hệ vi khuẩn mang plasmid ở nhiệt độ thấp
Thuận lợi: chống được hoạt tính ly giải của protease, hiệu suất cao, không
khó tinh sạch.
Khó khăn: sản phẩm protein tái tổ hợp gấp cuộn không đúng bản chất tự
nhiên; không dùng được cho protein cần biến đổi sau dịch mã

Một số giải pháp

◼ Thu hồi thể vùi rồi cho tái tạo gấp cuộn lại

◼ Giảm nhiệt độ nuôi cấy

◼ Sử dụng sốc nhiệt để tăng biểu hiện

◼ Dùng plasmid có số copy thấp hơn

◼ Gắn thêm vào đầu N một protein màng

22
 Biểu hiện ở vi khuẩn (Ngoại bào)
Việc biểu hiện protein ra bên ngoài bề mặt của vi khuẩn đòi hỏi thêm một đoạn
protein như một cái neo móc (anchor) vào màng tế bào, đó là
• 9 aa đầu tiên của E.coli lipoprotein (Lpp)
• đoạn từ aa 46- aa 159 của protein màng vi khuẩn gram âm OmpA

as porin-like integral membrane proteins

23
Biểu hiện vượt mức sử dụng vi khuẩn chủ
E.coli

E. coli BL21 (DE3)

E. coli BL21 (DE3)/pLysSN
E. coli BL21 (DE3)/star-PLysSN
và nhiều loại tế bào chủ khác

24
 E.coli
Strain Genotype Đặc trưng genotype Môi trường nuôi cấy
F-, dcm, - Bị vô hiệu hóa các 1. Để tăng sinh trưởng
BL21 ompT, proteases (lon và omp-t) tế bào cần có 10g
(DE3) / hsdS (rB- - Chứa lDE3 lysogen (l glucose /1 lit môi trường
mB-), gal, prophage) mang gene T7 nuôi cấy, ngoài các
Novagen (DE3) RNA polymerase được thành phần cơ bản.
; Thermo hoạt hóa bởi promoter (yếu tố này ảnh hưởng đáng
scientific lacUV5, do đó gene chèn kể đến sinh trưởng)
*dấu (-) có
phía sau T7-promoter (ở
nghĩa là loại
bỏ plasmid biểu hiện) được 2. Để cảm ứng biểu hiện
cảm ứng biểu hiện bởi protein TTH (ở plasmid
IPTG biểu hiện) với IPTG (cần
khảo sát nồng độ tối ưu)

*Phù hợp với các plasmid pET, pCAL có hệ thống biểu hiện protein TTH sau T7 promotor
** Phù hợp để sx những protein dị hợp không gây độc cho tế bào chủ.
*** Không phù hợp để cất trữ, duy trì plasmid biểu hiện protein TTH. Để cất trữ plasmid
biểu hiện protein TTH nên dùng E.coli DH10B hoặc DH5α không chứa gene T7 25
polymerase
5.3 Sản xuất protein tái tổ hợp
1. Nuôi cấy tạo nhiều protein (over expression)
2. Thu hồi và tinh chế protein
3. Biến đổi protein (protein modification)
4. Bảo quản protein

26
27
28
29
GFP - đuôi dung hợp

30
GFP - đuôi dung hợp Biểu hiện vượt mức

31
GFP đã cắt đuôi
dung hợp

32
GFP đã cắt đuôi
dung hợp

33