CÔNG NGHỆ PROTEIN ENZYME

Chương 4: Các kĩ thuật phân tích protein và enzyme

(10-12 tiết)
4.1. Nhận biết protein/enzyme
4.1.1. SDS-PAGE, Native-PAGE
4.1.2. Western blotting
4.1.3. 2DGE
4.1.4. MALDI-TOP/MS
4.2. Định tính và định lượng hoạt tính protein/enzyme
4.2.1. Định tính hoạt tính enzyme: phương pháp thạch đĩa, Zymogram
4.2.2. Định lượng hoạt tính enzyme
- Xác định nồng độ protein bằng phương pháp đo OD
- Xác định nồng độ protein bằng phương pháp ELISA
- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp đo OD

1
 4.1.1. Điện di trên gel polyacrylamide
(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis )

SDS- PAGE, Native PAGE

• Dùng để xác định trọng lượng phân tử protein (kDa, theo tổng aa)
dựa trên phân tách theo phân tử và thang protein chuẩn (kDa);
• Dự đoán cấu trúc bậc 3 với cầu S-S
• Dự đoán protein có cấu bậc 4 hay không

2
Phản ứng tạo gel polyacrylamide

TEMED
TetraMethylEthyleneDiamine
TEMED xúc tác tạo thành gốc tự do

Gốc tự do xúc quá trình polymer hóa

Sư tạo thành lưới polyacrylamide là phản ứng

polymer hóa thu nhiệt do đó nên thực hiện ở
nhiệt độ phòng. Nhiệt độ tủ lạnh làm chậm phản
ứng. Chỉ cho gel vào tủ lạnh sau khi gel đã đông

3
 Nguyên lý chung của kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamide

Tốc độ dịch chuyển (v) của protein (hay một phân tử nào đó) trong điện trường phụ
thuộc vào lực điện trường (E), điện tích của protein (Z) và hệ số ma sát (f):
v=Ez/f
hệ số ma sát f tùy thuộc vào độ nhớt của môi trường () và bán kính của khối protein
f=6r
- Trong điều kiện CÓ chất gây biến tính (SDS-PAGE)- protein mất hoạt tính. Các phân
tử protein phân tách dựa trên trọng lượng phân tử (kDa);
- Trong đìêu kiện KHÔNG CÓ chất gây biến tính (Native PAGE) protein được bảo tồn
hoạt tính. Các protein phân tách dựa vào cấu trúc không gian, khối lượng phân tử và
điện tích bề mặt;
Tốc độ dịch chuyển của protein tỷ lệ thuận với điện tích và tỷ lệ nghịch với khối
lượng phân tử
4
1. Điện di trên gel polyacrylamide trong điều kiện có chất gây
biến tính protein là SDS và β-mercaptoethanol
SDS-PAGE Protein được hòa tan trong dung dịch SDS (sodium
dodecyl sulphate), các phân tử SDS mang điện tích âm
sẽ tạo phức hợp với protein.

Protein sẽ bị biến tính và trên bề mặt sẽ tích hoàn toàn

điện tích âm (1 phân tử SDS sẽ liên kết với 2 gốc acid
amin)

Do đó điện tích sẽ tỉ lệ thuận với kích thước phân tử

protein

➢ Tốc độ dịch chuyển của protein trong điện trường phụ

thuộc vào kích thước phân tử (protein nhỏ di chuyển
nhanh hơn protein lớn)
5
• b-mercaptoethanol: có tính khử, phá vỡ cầu nối disulphide trong
cùng chuỗi polypeptide và giữa các chuỗi polypeptide, thúc đẩy
protein duỗi thành sợi khi có mặt SDS;
• SDS-PAGE mẫu protein đã được xử lí b-mercaptoethanol (có
trong loading buffer) cho phép dự đoán trọng lượng phân tử của
protein (kDa)
6
Khoảng cách dịch chuyển của protein trên SDS_PAGE còn
phụ thuộc vào kích thước mạng lưới lỗ gel

Nồng độ gel polyacrylamide/bisacrylamide (T/C) quyết định kích cỡ

mạng lưới lỗ trên gel:
T = % acrylamide + % bisacrylamide
C= % bisacrylamide

- Kích cỡ lỗ sẽ nhỏ nếu %T cao

-T có thể từ 6-15% tùy thuộc vào kích thước phân tử của protein cần
phân tích

- Protein kích thước càng nhỏ nồng độ gel nên sử dụng càng cao

7
Vai trò của hệ đệm không liên tục “discontinuous Laemmli buffer system”

-Glycine có 3 trạng thái điện: âm, dương và

Gly (-) không mang điện tùy thuộc pH so với pI

Gly (o) Gly (o)

Cl- Cl- Cl- Cl-
2 lưới pH= 6.8
glycine và Glycine
Gly (-) Gly (-) Gly (-) ion Cl kẹp trung
các protein hòa điện
ở giữa dồn (pI) di
về vạch chuyển
xuất phát rất chậm Protein mang điện
trong âm yếu ở pH 6.8
điện
trường

8
 Cách xác định trọng lượng phân tử của protein trên gel điện di

Start line

Stop line
Bromophenol blue
(cm)
Rprotein: Khoảng cách di chuyển của protein Rf = Rprotein/ R coomasie blue
Rcoomasie blue: Khoảng cách di chuyển của thuốc
Rf: Khoảng cách di chuyển trung bình của protein trên gel
thử bromophenol blue (M=500Da)
9
 2. Điện di trên gel polyacrylamide trong điều kiện KHÔNG có
chất gây biến tính protein là SDS và β-mercaptoethanol
Native- PAGE
- Loại bỏ SDS và b-
mercaptoethanol trong
sample loading buffer.
Loại bỏ SDS trong gel và
running buffer.
- Protein ở trạng thái tự
nhiên có thể cấu trúc bậc
3 hoặc bậc 4, dịch chuyển
trong điện trường phụ
thuộc tổng điện tích bề
mặt. Protein có khả năng
thể hiện hoạt tính như xúc
tác, gắn phối tử.
10
Kết hợp các phương pháp để xác định cấu trúc bậc 3 và 4 của protein

Native- PAGE +
b-mercaptoethanol

11
 4.1.2. Kĩ thuật Western Blotting

• Dùng để xác định sự gấp cuộn không gian “đúng” – có hoạt tính,
của protein thông qua gắn đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể.
• Protein không có hoạt tính đặc biệt có thể nhận biết bằng lai miễn
dịch tượng tự như kĩ thuật ELISA: protein đích là kháng nguyên thì
dùng kháng thể (được sản xuất trước đó kháng toàn phần hoặc một
phần của protein đó -gọi là epitope) để gắn đặc hiệu;
• Tín hiệu màu đơn sắc hoặc huỳnh quang hoặc phóng xạ

12
 Chuyển các band protein qua
màng nitrocellulose
Western blot (+)
Tấm đệm

Màng
Dùng để phát hiện nitrocelluose
protein trong mẫu
(rất nhạy ở hàm SDS-PAGE gel
lượng thấp ≥
0.1ng
Tấm đệm
Enzyme đánh dấu là SDS- PAGE (chưa nhuộm CBB)
alkaline
phosphatase
(AP)/cơ chất dùng
phát tín hiện màu Màng
đơn sắc là nitrocellulose
NBT/BCIP sau khi phát
hiện màu
Hoặc hệ thống phát
tín hiệu huỳnh
quang

13
Western blot: các bước cơ bản
1. Chuẩn bị mẫu protein, từ tế bào hoặc từ tổng protein thu được. Protein bị biến tính hoàn toàn trong
SDS (không cho b-mercaptoethanol);
2. Phân tách protein trên gel SDS-PAGE. Dùng gradient gel tốt hơn là một nồng độ gel acrylamis/bis-
acrylamide;
3. Dùng màng nitrocellulose (gắn kị nước) hoặc PVDF(polyvinylidene fluoride) gắn phần kị nước và
phân cực) đều có các kích thước 0.1, 0.2 và 0.45 um, loại 0.1, 0.2 um tốt cho protein < 20kDa);
4. Điện thẩm tích để chuyển protein từ gel gắn lên màng lai. Vì tương tác gắn là kị nước nên running
buffer nên có muối. Nếu dùng nitrocellulose thì phải thêm methanol trong running buffer để tăng gắn
phân cực;
5. Phủ nền màng nictrocellulose/PVDF sau điện thẩm bằng BSA hoặc skim milk (sữa tách béo) để
giảm gắn không đặc hiệu với kháng thể bậc 1;
6. Phủ màng nictrocellulose/PVDF với kháng thể bậc 2 kháng lại kháng thể bậc 1. Rửa kháng thể bậc 2
không gắn;
7. Phản ứng cho tín hiệu. Thuông thường kháng thể bậc 2 được dung hợp với enzyme (ví dụ alkaline
phosphatase, peroxidase..), khi này phủ màng với cơ chất tương ứng enzyme đó. Tín hiệu thu được
là sản phẩm biến đổi của cơ chất có thể cho màu ở bước sóng đơn sắc, hoặc phát huỳnh quang;
8. Cần so sánh band protein sau blotting với band trên SDS-PAGE để xác định vị trí protein./. 14
 4.1.3. Kĩ thuật điện di hai chiều
(2D PAGE)
• Dùng để đánh giá sự da dạng protein trong mẫu dựa trên phân
tách: chiều 1- theo điện tích bề mặt (pI) của các protein và phân
tách chiều 2- theo phân tử lượng (kDa) của các protein
• Bản gel điện di có thể được nhuộm bằng comassie brilliant blue
(CBB) hoặc huỳnh quang để so sánh các mẫu protein

15
Chiều 1: Điện di điểm đẳng điện
Isoelectrofocusing (IEF)

- Điện di protein trên gel với

gradient pH
- Phân tách protein dựa vào điểm
đẳng điện (pI) khác nhau của các
protein
- Protein tích điện khác nhau và
dịch chuyển trên gel về các điện
cực theo hai hướng khác nhau. Ở
điểm pH = pI protein sẽ dừng lại.
- IEF cho phép xác định pI của
protein

16
Cytochrom c

Pepsin

17
Chiều 2: Điện di SDS-PAGE

18
Phổ diện điện di 2D-PAGE

Nhuộm Ag+

19
Nghiên cứu dấu peptide (peptide fingerprinting) bằng khối phổ (MS)

1. Phân cắt 2. Phân tích khối

protein bằng phổ MALDI-TOP
enzyme trypsin

3. So sánh với các protein đã

nghiên cứu trong ngân hàng dữ
liệu protein- xác định tên protein
20
Nghiên cứu proteomics:
So sánh 2 mẫu protein để đánh giá khác biệt về protein biểu hiện

21
Nghiên cứu proteomics
Two-Dimensional Differential Gel Electrophoresis (2D-DIGE)

https://www.researchgate.net/figure/Experiment
al-design-for-2-D-Fluorescence-Difference-Gel-
Electrophoresis-2D-DIGE_fig1_266028187

22
Nghiên cứu proteomics Two-Dimensional Differential Gel Electrophoresis (2D-DIGE)

Định tính Định tính/ định lượng

https://www.abdn.ac.uk/ims/documents/2D-DIGE_Aberdeen_Proteomics.pdf
23
 4.1.4. Kĩ thuật khối phổ protein
(MALDI-TOP/MS)
• MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
• TOP: Time of Flight
• Dùng để xác định trình tự protein dựa trên phổ khối;
• Chỉ xác định được trình tự các mảnh protein (peptide);
• Trả lời câu hỏi tên protein cần xác định thuộc nhóm nào

24
MALDI-TOP/MS : nguyên tắc phân tích

Vùng ion hóa Vùng bay

của ion

25
MALDI-TOP/MS : các bước cơ bản

Kết quả phổ thu được sẽ so

sánh với thư viện các phổ chất
đã biết
Thời gian bay của ion phụ thuộc
vào khối lượng của ion đến khi
detector bắt được tín hiệu
Phân tử trong mẫu phân tích sẽ bị
ion hóa tách khỏi vị trí ban đầu bay
vào ống chân không cao - vô
trường với thời gian khác nhau
Chiếu tia laser vào đốm mẫu đã
khô

Phủ mẫu với chất mang để làm khô

26
MALDI-TOP/MS : hệ thống phân tích

27
Phổ protein qua phân tích LC-MS
Insulin có 3 dạng khối với 3 pick
có thời gian bay khác nhau :
(I+ H)+
(I+ 2H)2+
(2I+ H)+
b-Lactoglobuline có 3 dạng khối
với 3 pick có thời gian bay khác
nhau :
(L+ H)+
(L+ 2H)2+
(L+ 3H)3+

28
4.2. ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG HOẠT TÍNH
PROTEIN VÀ ENZYME
4.2.1. Định tính : Zymogram
4.2.2. Định lượng
- Xác định nồng độ protein bằng phương pháp đo OD
- Xác định nồng độ protein bằng phương pháp ELISA
- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp đo OD

29
4.2.1 Định tính hoạt tính enzyme

30
 4.2.1 DỊNH TÍNH HOẠT TÍNH ENZYME
Phương pháp thạch đĩa 4.2.1 Zymogram

• Nhỏ dung dịch Native PAGE

mẫu chứa
enzyme.
• Vòng trong sinh
ra là do cơ chất
mất đi
• Cho biết sự hiện
diện của enzyme
trong mẫu
• Phân tách vạch protein bằng native-PAGE
• Sandwich gel native-PAGE chứa enzyme lên lớp
cơ chất
• Vệt trong cho biết vị trí vạch protein là enzyme
31
4.2.2 Định lượng enzyme

32
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD

Io I
 Thiết bị ghi lại
độ hấp thụ

L
Kính lọc sáng mẫu (cuvette thạch anh hay nhựa)

Định luật Beer-Lambert: tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng  và nồng độ
của một chất:
log Io/ I = e()*L*c
log Io/ I là độ hấp thụ, hay còn gọi là mật độ quang (Optical Density -OD)
L : chiều dài cuvettet thường = 1 cm
C: nồng độ chất có trong cuvette
e là hệ số hấp thụ mol phân tử tại bước sóng  với đơn vị là M–1cm –1 khi ấy nồng độ chất là M.

33
 Xác định nồng độ protein bằng đo trực tiếp OD280nm

• Nồng độ protein tối đa có thể xác định 4 mg/ml

• Thực hiện nhanh và dễ dàng
• Không chính xác bằng các phương pháp đo phổ
hấp thụ của các hợp chất màu.
• Bị nhiễu bởi các tạp chất khác như ADN

Đối với mẫu protein hỗn hợp.

Nồng độ (mg/ml) = giá trị OD280nm (chiều dài
cuvette 1 cm)
Đối với protein tinh sạch mà biết trước hệ số e
Nồng độ (mg/ml) = giá trị OD280nm/e
Đối với protein có khả năng bị lẫn với DNA, RNA
Nồng độ (mg/ml) = (1.55 x OD280) - 0.76 x OD260)

34
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP BIURET
Tạo phức màu tím giữa Cu2+ và protein

Ion Cu2+ tham gia liên kết tạo phức với các
liên kết peptide trong protein. Trong môi
trường kiềm (KOH và NaOH) phức
protein-Cu có màu tím và hấp thụ bước
sóng 540-560 nm. K,Na-tartate có vai trò
làm ổn định màu của phức.
35
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP BIURET

• Phương pháp được ứng dụng lâu đời nhất,

được A.G. Gornall (Canada) đưa ra đầu
tiên (1949)
• Độ nhạy không cao
• Dùng để xác định protein trong mẫu có hàm
lượng protein cao (1 - 10 mg protein/ml)
• Là phương pháp cơ bản cho các phương
pháp khác như LOWRY và BCA trong định
lượng protein

36
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP BCA

Nếu protein chứa các chất

khử khác thì phép phân
tích không chính xác

37
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP BCA
• BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid hay 4,4'-Dicarboxy-
2,2'-biquinoline
• Dựa trên cơ sở của phản ứng BIURET: Cu2+ tạo phức
với protein ở liên kết peotide. Các chuỗi bên có tính
khử như cysteine, cystine (Cys-Cys), tryptophane,
tyrosine sẽ khử Cu2+ thành Cu+ trong môi trường kiềm;
• Cu+ tạo phức với BCA, sản phẩm có màu tím hấp thụ
ánh sáng ở bước sóng 562nm
• Lượng phức protein-Cu-BCA màu tím tỉ lệ với lượng
protein
• Phức hợp màu rất bền, có độ nhạy cao cho phép xác
định một lượng protein thấp trong mẫu (0.02-2.0
mg/ml).
• Có thể tiến hành trong đĩa 96 giếng với thể tích mẫu
nhỏ .
38
Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP LOWRY

39
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
• Lowry được ứng dụng phổ biến (Lowry, O.H.;
Rosebrough, N.J.; Farr, A.L.; Randall, R.J.; J. Biol. Chem. 1951,
193, 265-275. Protein measurement with the Folin phenol
reagent)
• Nồng độ protein được xác định với hợp chất màu
phenol Folin-Ciocalteau , phản ứng kép tạo phức
hợp protein-Cu+ : Cu2+ bị khử thành Cu+. Cu+ sau
đó phản ứng với phosphomolybdicphosphotungstic
acid (Na2MoO4 + Na2WoO4 + H3PO4) (thuốc thử
Folin-Ciocalteau ) tạo phức heteropolymolybdenum
có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng bước
sóng 500-750nm.
• Độ nhạy pp Lowry cao hơn phương pháp BIURET
• Khoảng tuyến tính < 0.2 mg/ml

40
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein

Cần chú ý:
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
➢Các dẫn xuất của acid amine, lipids, đường, các muối, acid nucleic và các hợp chất
sulphydryl, ammonium ions, các hợp chất thiol gây ảnh hưởng lên phản ứng.
➢Khoảng pH thích hợp cho phản ứng từ 10-10,5.
➢Phản ứng nhạy với các tạp chất màu khác
➢Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi hỏi phải dựng đường chuẩn
mỗi lần tiến hành xác định hàm lượng
➢Để dựng đường chuẩn nên dùng các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính
xác.
➢Độ hấp thụ (OD) chỉ tăng tuyến tính theo nồng độ ở vùng nhất định. LOWRY chỉ
chính xác trong khỏang ~10 to 200 µg/ml . Do vậy cần pha loãng mẫu trong khoảng
nồng độ trên để có kết quả chính xác.
➢Waterborg, J.H.; Matthews, H.R.; Methods Mol. Biol. 1994, 32, 1-4. The Lowry
method for protein quantitation.
41
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
Phản ứng Bradford

Coomassie Brilliant Blue G-250

42
 Xác định nồng độ protein bằng đo OD thuốc nhuộm protein
PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
• Phản ứng protein với thuốc thử BRADFORD được
thực hiện trong môi trường acid mạnh.
• Phương pháp dựa trên sự biến đổi độ hấp thu cực
đại (dịch chuyển từ 465 nm sang 595 nm) khi
Coomasie liên kết với protein.
• Protein ổn định mang điện tích âm liên kết với
Coomasie qua tương tác kỵ nước và liên kết ion
(tương tác chủ yếu qua các gốc kiềm như arginine,
và ở mức độ thấp hơn là histidine, lysine, tyrosine,
tryptophan và phenylalanine);
• Độ nhạy cao, khoảng tuyến tính 1- 20 ug/ml
• Không ảnh hưởng bởi chất khử như phương pháp BCA hay Lowry
• Các protein khác nhau tạo phức hấp thụ khác nhau, vì vậy cần chọn lọai protein
có cấu trúc tương đồng với protein cần xác định hàm lượng làm chất chuẩn
43
 ELISA Sử dụng kháng
Enzyme-linked immunosorbent assay thể đặc hiệu dung
hợp enzyme thay
thế liên kết với
protein/kháng
Kháng thể đặc hiệu bắt nguyên đích
protein đích

Kháng nguyên có
nồng độ cực thấp

• Kỹ thuật dùng tương tác miễn dịch học, cho định lượng nồng độ protein kháng nguyên
hoặc kháng thể trong mẫu vật ở nồng độ cực kì thấp, <1ng/100ul (100 ul thường là thể
tích giếng thử nghiệm), tức <10 ug/ml)
• Độ hấp thụ quang OD của hợp chất màu sinh ra tỷ lệ thuận với nồng độ protein đích trong
mẫu
• Sandwitch ELISA là thông dụng nhất cho xác định kháng nguyên
• Indirect ELISA thường dùng cho xác định kháng thể 44
Sandwich ELISA Kháng thể bậc 2 (kháng
Kháng thể bậc 1 đặc kháng thể bậc 2)-dung
Enzyme gắn với kháng thể bậc II:
hiệu bắt protein đích hợp với enyme
Horse radish peroxidase (HRP)
Cơ chất: TMB, DAB, ABTS

TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) không màu

Sản phẩm : 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Kháng thể bậc 1
diimine: màu xanh (primary) gắn protein
đích lên bề mặt giếng
Tăng độ đặc hiệu của Test

45
ELISA Ví dụ: Indirect ELISA xác định kháng thể trong mẫu

ELISA Microreader

Đĩa ELISA được hoạt hóa gồm loại kị nước

cho các phân tử protein và ưa nước (có
các nhóm amino hoặc carboxyl) Nếu đĩa
có gi “surface-activated microplates” thì
dùng cho loại tạo k]liên kết cộng hóa trị

46
4.3. ĐỊNH LƯỢNG HOẠT TÍNH ENZYME

• Phương pháp đo OD: gián tiếp và gián tiếp

• Phương pháp huỳnh quang: đo trực tiếp

47
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEIN VÀ ENZYME
Đơn vị hoạt tính (U): là lượng enzyme cần thiết để chuyển 1
µmole cơ chất thành sản phẩm, hoặc tạo thành 1 µmole sản phẩm
trong 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH phản ứng quy định

KHÔNG LIÊN TỤC LIÊN TỤC

Sau một khoảng thời gian nhất định, Xác định nồng độ cơ chất mất
dừng phản ứng, xác định nồng độ cơ đi hoặc sản phẩm sinh ra một
chất mất đi hoặc sản phẩm sinh ra cách liên tục theo thời gian

48
KHÔNG LIÊN TỤC, VD: bromelain/casein
Tyrosin Không Mẫu
(ml) (ml) (ml)
Dung dịch Casein 1,2% trong đệm
2,5 2,5 2,5
phosphate
Để yên ở 35o5C trong 5 phút
Dung dịch acid tricloracetic 5% 5 5
Dung dịch HCl 0,2N 0,5 0,5
Dung dịch tyrosin mẫu 0,5
Dịch nước thơm có chứa enzyme
0,2
bromelain
Lắc đều để yên ở 35o5C trong 10 phút
Dung dịch acid tricloracetic 5% 5
Dịch nước thơm có chứa enzyme
0,2 0,2
bromelain

49
 Lô Tyrosin Lô Không Lô Mẫu

Lắc đều và để yên ở

nhiệt độ phòng 10
phút, đem lọc.

Hút chính xác

2.5 ml dịch lọc

Mỗi ống cho thêm 5mL dung dịch NaOH 0.5 N và 1mL thuốc thử
Folin. Lắc kỹ để yên 15’, đem đo ở 620nm
50
 Tyrosin mẫu: 100 ml dd tyrosine chứa 45mg tyrosin
3
→ 0.5 ml dd Tyrosine chứa 45 * 0. 5 *10
g
100
45 * 0.5 *103
g ΔODTyr
100
? ΔODMẫu

Hoạt độ bromelain (UI) được biểu thị là số g tyrosin sinh ra do sự thủy phân
cơ chất của enzyme có trong 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp trong 1 phút

450 * 0.5 * ODM

Hoạt tính chung = UI / ml
10 * ODT * 0.2

51
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM: PHƯƠNG PHÁP ĐO LIÊN TỤC

1. Đo trực tiếp sự thay đổi nồng độ cơ chất hoặc sản phẩm theo thời gian
1.1 Fumarase

L-malate fumarate 250nm = 1,450 M–1cm – 1

H2O
1.2 Malate dehydrogenase
L-malate oxaloacetate

NAD+ NADH + H+ 340nm = 6,220 M–1cm – 1

1.3 Citrate synthase

oxaloacetate citrate

Acetyl-CoA CoA-SH 232nm = 4,500 M–1cm – 1

52
2. Đo gián tiếp thông qua đo sự thay đổi nồng độ của một cơ chất hoặc sản phẩm
của một phản ứng hóa học/ enzym đi kèm (coupling) theo thời gian
2.1 Phản ứng hóa học, ví dụ Citrate synthase
oxaloacetate citrate

Acetyl-CoA CoA-SH

O2N– o –S–S– o –NO2

O2N– o –S– 412nm = 13,600 M–1cm – 1
– OOC COO–
– OOC 2-nitro-5-thiobenzoate anion
DTNB
5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoate)
CoA–S–S– o –NO2

COO–

2.2 Phản ứng enzym

Ví dụ-1 Malate dehydrogenase Citrate synthase

L-malate oxaloacetate citrate

NAD+ NADH + H+ acetyl-CoA CoA-SH 340nm = 6,220 M–1cm – 1

53
Ví dụ-2
Aspartate aminotransferase
L-aspartate L-glutamate
MDH
-ketoglutarate oxaloacetate L-malate

NAD+ NADH + H+ 340nm = 6,220 M–1cm – 1

Ví dụ-3 Hexokinase
Glucose + (Mg2+)ATP glucose-6P + (Mg2+)ADP

PK phosphoenol pyruvate
pyruvate
(Mg2+)ATP
LDH NADH + H+ 340nm = 6,220 M–1cm – 1
NAD+
lactate

54
 PHƯƠNG TRÌNH MICHAELIS MENTEN

1. Xác định tốc độ phản ứng vo =

umole P (hoặc S)/ min
2. Chia cho thể tích enzyme (ml) sử
dụng trong phản ứng thu được hoạt
tính chung enzyme umole/ml E/min
3. Chia hoạt tính chung cho nồng độ
protein (mg/ml) được hoạt tính riêng
umole/ mgE/min

Pre-steady *state **
Steady state 55
Những điều cần ghi nhớ khi thực hiện phản ứng enzyme:
Sử dụng hóa chất tinh sạch?
Enzym và các hóa chất khác có ổn định trong điều kiện phản ứng không?
Luôn có mẫu đối chứng cho tất cả các yếu tố có thể gây sai số, dương tính
giả như: pH, nhiệt độ, các hóa chất...
Kiểm tra xem lượng enzym có đủ để đạt trạng thái ổn định?
Xác định tốc độ phản ứng ban đầu? Độ tuyến tính?
Đối với phản ứng cần xác định thông qua một phản ứng enzym khác, cần
đảm bảo rằng tốc độ phản ứng đo được không phụ thuộc vào lượng enzym ở
phản ứng kèm (có nghĩa là bao nhiêu cơ chất hay sản phẩn của phản ứng
chính sẽ được chuyển hóa hoàn toàn ở phản ứng kèm)

56