Spektrofotometria

A fény elektromágneses hullám, amely képes különböző módon kölcsön hatni anyagokkal.
Ilyen kölcsönhatások:

• Visszaverődés
• Szóródás
• Abszorpció
• Transzmisszió

AZ ABSZORPCIÓ ALAPELVE
Egy molekulát felépítő atomok
pályaelektronjai az alapállapot diszkrét
energiaszintjeinek (vibrációs és rotációs
szintjeinek) valamelyikén helyezkednek el a
környezetükkel történő termikus egyensúly
révén. Ha az alapállapot valamely
elektronjával épp annyi energiát (E = hf)
közlünk, amely elegendő egyik gerjesztett
állapot valamely energiaszintjére fellépni,
akkor az elektron gerjesztett állapotba
kerül. A folyamatot abszorpciónak vagy
fényelnyelésnek nevezzük. Mivel minden
atomi és molekuláris rendszer rá jellemző
elektroneloszlással (energiaterm
szerkezettel) rendelkezik, az abszorpció egy
olyan fizikai paraméter, amelynek értéke
alkalmas a vizsgált minta jellemzésére.

AZ ABSZORPCIÓ JELENSÉGE
A fény anyagokban terjedve abszorpció révén is veszít(het) intenzitásából.

1/4
Az fényintenzitás csökkenése híg oldatokban exponenciális függvénnyel írható le, amely
formát Lambert-Beer törvénynek nevezünk:

ahol I az oldatból kilépő, I0 az oldatba belépő fény intenzitása, () az anyag abszorpciós (vagy
extinkciós) együtthatója az adott hullámhosszon, c a koncentráció, és x a minta vastagsága.

Az abszorpció definíciójától elvárjuk, hogy ez a fizikai mennyiség legyen könnyen mérhető, és

egyben legyen additív is. Ezért a kilépő és beeső fény hányadosának negatív logaritmusát
abszorpció, abszorbancia vagy optikai denzitás (OD) néven definiáljuk:

Ha olyan oldatot mérünk, amelynek előzetesen ismert az () értéke, akkor az oldat
rétegvastagsága (x) és a mért abszorbancia (A) ismeretében könnyen meghatározhatjuk az
oldat koncentrációját:

A koncentrációmérés az abszorpciós fotometria leggyakrabban alkalmazott területe.

AZ ABSZORPCIÓ HULLÁMHOSSZ FÜGGÉSE

A fény az anyaggal hullámhossz függő módon hat kölcsön, és így a fény elnyelésének mértéke
is a hullámhossz függvénye lesz. Azok a hullámhosszok (energiaadagok, kvantumok)
nyelődnek el, amelyek illeszkednek az adott anyag elektronrendszeréhez és azok
transzmittálódnak (haladnak át), amelyek nem illeszkednek. Ennek értelmében az abszorpció
egy hullámhossztól függő fizikai mennyiség.

Az aminosavak közül a triptofán, a tirozin és a fenilalanin UV tartományban jellegzetes

spektrummal rendelkeznek. A fehérjék túlnyomó többségében jelen vannak ezek az aminosav
csoportok, így a fehérjék túlnyomó többségének 280 nm körül elnyelési maximuma van. A
fehérjék 220 nm körül is komoly elnyelési csúccsal rendelkeznek. Ez a peptidkötésnek
tulajdonítható. A nukleinsavak a pirimidin és purin bázisok miatt 260 nm környékén
rendelkeznek abszorpciós maximummal. (http://elte.prompt.hu)

2/4
 http://inside107and109.blogspot.com/2018/11/how-pure-is-your-dna.html

TRANSZMISSZIÓ
A transzmisszió az átmenő és beeső fény intenzitásának a hányadosa:

Értéke jellemző a vizsgált anyagra, következtethetünk belőle a jellemzőire. De nem additív

fizika paraméter.

AZ ABSZORPCIÓ MÉRÉSE

Az abszorbancia hullámhossz-függését detektálva ún. abszorpciós spektrumot kapunk. A

spektrum értékes információs tartalmaz a vizsgált molekuláris rendszer elektronszerkezetéről,
de a széles sávok miatt minőségi azonosításra egymagában nem alkalmas.

Példa: A Kurkumin abszorpciós spektruma.

A kurkumin abszorpciós spektruma látható különböző koncentrációkban.  = 425 nm-en

leolvasott abszorbancia értékek a koncentráció függvényében egy lineáris függvényt adnak
(jobb felső kis ábra).

3/4
AZ ABSZORPCIÓS SPEKTRUM FELVÉTELE
A abszorpciós spektrum felvételét spektrofotométerrel végezhetjük. A műszer fő
komponensei:

• Fényforrás (F): a 200-800 nm hullámhossz-tartományban világít

• Monokromátor (M): segítségével kiválasztjuk a megfelelő hullámhossztartományt

• Mintatartó (S mintaoldat, R referenciaoldat)

• Fotodetektor (D): mérjük a fény intenzitását (fotoelektron-sokszorozó segítségével)
• Elektronikus egység (E)
• Számítógép (C)

• Tükrök (T)

Egyes alkalmazásokban további egységek, mint pl. lencsék, optikai szűrők és optikai rések
alkalmazása is szükséges lehet.

A spektrofotométer elrendezése lehet egyutas, vagy kétutas, a mérés geometriája szerint.

Mind a két megvalósítás során meg kell mérni egy referencia minta abszorpciós tulajdonságait
is.

Az egyfényutas spektrofotométerben csak egy küvetta helyezhető el, így egymás után
mérhető a referencia és a minta által áteresztett fény intenzitása.

A kétfényutas spektrofotométerben két küvetta helyezhető el, így majdnem egyszerre

mérhető a minta és a referencia által áteresztett fény intenzitása.

AZ ABSZORPCIÓ ALKALMAZÁSAI

A spektrofotometria az egyik leggyakrabban használt analitikai eljárás a biokémiában. A

módszer igen alkalmas kis mennyiségű anyag gyors, egyszerű, rutinszerű mérésére.

Ha az abszorpciós maximum a spektrum látható tartományába esik, az anyag színes. A látható

tartományban elvégezhető analízisek száma igen nagy.

Az UV tartományú analízisek is széles körben elterjedtek, mivel sok színtelen anyagnak van
ezen a területen (190-320 nm) intenzív elnyelési sávja.

4/4