Tema 6.

Tècniques immunoquímiques
Tècniques de Bioquímica i Biologia Molecular
Grau de Bioquímica i Biologia Molecular
Grau de Biotecnologia
Doble Grau Bioquímica i Biotecnologia
Doble Grau Biotecnologia i Enginyeria Informàtica
Curs 2020-21
 Índex de continguts
• Introducció
• Part 1: Tècniques clàssiques
• Producció d’anticossos
• Inmunoprecipitació
• RIA/EIA/ ELISA
• Immunohistoquímica
• Citofluorimetria de flux
TÈCNIQUES BASADES EN LA IMMUNOPRECIPITACIÓ
Fonament: formació d’inmunocomplexes insolubles entre
anticòssos i Ag.
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY
TÈCNIQUES BASADES EN LA IMMUNOPRECIPITACIÓ

Immunoprecipitació en solució:
Cal poder separar el complexe Ag-Ac de la resta:
- CENTRIFUGACIÓ
- AGREGAR COMPOSTOS: SALS o CARBÓ ACTIU
TÈCNIQUES BASADES EN
LA IMMUNOPRECIPITACIO

En solución
Usant columnas d’afinitat
En agar
-Ús del anticòssos marcats marcatge directe i indirecte:

Esta foto de Autor

desconocido está bajo
licencia CC BY-SA
-Marcatge dels Anticòssos:

Marcatge Exemples Tècniques

Fluorocrom Fluoresceïna IHQ
Rhodamina ICQ
Phycoerytrina CFF
Texas Red
Biotina Biotina (Avidina- IHQ
conjugada) WB
ICQ
CFF
Enzims PA ELISA
HRP WB
Glucosa oxidasa IHQ
Ureasa ICQ
Electrodense Au/Fe ME
Radioactivitat I125 RIA
-Assaig immunomètrics EIA ELISA

Per a quantificar la concentració de l’Ag (ó de l’Ac)

Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA) NO
COMPETITIU.
Enzyme Immunoassay (EIA)
https://www.youtube.com/watch?v=YIc_3PTpNM8
Particularitats:
Senyal
•Corbes de calibrat emesa

•Ac que reconeguin epítops diferents

•Productes de la reacció enzimàtica: [Ag]

•Colorimètrics
•Quimioluminiscents
•Fluorimetria
-Assaig immunomètrics
Per a quantificar la concentració de l’Ag
N’hi ha diferents dissenys:
From Wikipedia
PGE2
 Immunoassaigs Competitius (RIA)

[hna]
Hna* cte
diferent
+ Separar Ag*-Ab de Ag*
s AB cte
[hna] problema

https://www.youtube.com/watch?v=Cs1LvCyEGKg
B/T
B/T= Ag*-Ab/((Ag*-Ab)+ Ag*)

Nivell de detecció 10-12-10-14 M

[hna]
S’han substituit per IA competitius en molts
casos.
IMMUNOHISTOQUÍMICA /IMMUNOCITOQUÍMICA

• Permet la detecció de l’Ag “in situ”

• Fonament:
reconeixement per part de l’Ac d’un Ag situat a:
cèl.lula en cultiu
preparació teixit sobre portaobjectes
• Localització estructural de l’Ag
• Controls positius i negatius per a garantir l’especificitat de la unió
• Marcatge de l’Ac:
•Enzim:
•HRP/AP
•Microscopi de llum clara
•Contrastat amb tincions comunes: hematoxilina per nuclis
•Perill: activitat enzimàtica pròpia de la mostra
•Fluorocrom:
•Diversitat de marcatges-->marcatges múltiples
•Microscopi per detecció de fluorescència
•Fluoresceina perd senyal amb el temps
•Perill: autofluorescència de la mostra
•Quantificació dificultosa
•Or/Ferritina/proteïna amb ferro:
•Ultraestructura
•Microscopia electrònica
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA-NC
ia CC BY-SA
 -Immunohisto/citoquímica

Eslava et al. BMC

2018.
CITOFLUORIMETRIA DE FLUX LAMINAR

• Anàlisi individualitzada de les propietats físico-químiques

de les cèl.lules o partícules en suspensió en un flux laminar
enfront una font de llum (làser).
• Permet el recompte de fluorescència a partir de cèl.lules en
suspensió la llum desviada es proporcional a la mida de la
partícula.
• Es poden separar físicament les cèl.lules per FACS.

Aplicacions en:

- Hematologia
- Immunologia
- Biologia Cel.lular
- Microbiologia
 DISPERSIÓ FRONTAL
Aspectes Teòrics
- Dispersió frontal o Forward Scatter (FSC)
- Deguda als fenòmens de difracció i refracció
- Angles compresos entre 0º i 10º
- Ens informa sobre el tamany cel.lular

Láser

Fotodetector
 DISPERSIÓ LATERAL
Aspectes Teòrics

- Dispersió frontal o Side Scatter (SSC)

- Angle de 90º
- Ens informa sobre l’estructura cel.lular interna

Láser FSC

Fotodetectors

SSC
Aspectes Teòrics - La fluorescència emesa per cada fluorocrom o colorant
degut a l’excitació pel làser és dispersada a un angle de
90º.
- Marcatge amb anticossos conjugats amb fluorocroms o
colorants que són excitats per la font de llum.

Fluoresceïna (FITC) 519 nm

488 nm
Láser #1 Ficoeritrina (PE) 578 nm
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5) 670 nm
Peridinin-clorofil.la (PerCP) 675 nm
ABSORCIÓ EMISSIÓ
 Resumint…
Aspectes Teòrics
• A partir d’una font de llum obtindrem senyals de FSC i
SSC de la mateixa longitud d’ona que la llum incident.
• Les propietats físiques de dispersió de llum són pròpies
de cada tipus cel.lular.

PMNs
Side Scatter

Monòcits

Forward Scatter
Limfòcits
 MOSTRES. Tipus
Aspectes Pràctics
L’objectiu és obtenir una suspensió cel.lular a partir d’una
determinada mostra.

- Líquids biològics: sang, mèdul.la òssia, rentats, …

- Cultius cel.lulars.
- Teixits.