BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

BÀI 4:
Xác định hàm lượng saccarose
(theo phương pháp thủy phân, xác định đường khử theo DNS)
Họ và tên: Nguyễn Minh Quân
MSSV: 20211523
I. Nguyên tắc của phương pháp phân tích:
1. Chuyển đường thành đường khử:
- Saccarose không có tính khử nên không thể xác định trực tiếp bằng phương
pháp Bectoran => Để xác định saccarose bằng phương pháp này, phải thủy
phân saccarose thành đường khử.
- Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai
đường khử glucose và fructose.

2. Xác định đường khử bằng phương pháp DNS (axit dinitro salicylic ):
Định phân đường khử bằng phương pháp DNS dựa trên cơ sở phản ứng tạo
màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitro salicylic (DNS). Cường độ
màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một
phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên
cứu với thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết
với thuốc thử này, ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường khử, từ đó tính
được hàm lượng saccarose trong mẫu.
 phương pháp không đặc hiệu vì đo tất cả mọi đường khử.
Cho dịch đường khử tác dụng với axit dinitro salicylic DNS:
 3. Tính lượng saccarose
- Từ phản ứng thủy phân saccarose, ta thấy cứ 342g saccarose thủy phân
thu được 180g glucose và 180g fructose  với a(g) đường khử, ta suy ra
342
được số g saccarose phản ứng là 360 a = 0,95a (g)

 0,95 là hệ số chuyển đổi đường khử sang saccarose.

- Lượng đường khử thủy phân từ saccarose được tính bằng hiệu lượng
đường khử sau thủy phân và lượng đường khử trước khi thủy phân.

II. Cách tiến hành:

a) Hóa chất:
Thuốc thử DNS: nước cất + 3,5 axit dinitro salicylic + NaOH (tạo môi trường
kiềm)
Hòa tan trước ba chất trên sau đó thêm:
 Muối K-Na tactrat kép  đảm bảo bền màu dung dịch, vì phức màu
không bền
 Phenol (nóng chảy ở 50oC)  tăng độ nhạy của thuốc thử
 Natri metabi sulfit Na2S2O5  chất khử để đảm bảo không có phản
ứng giữa O2 không khí và đường khử
b) Xây dựng đường chuẩn glucose cho phương pháp DNS:
PTN chuẩn bị
c) Phân tích mẫu:
Mẫu thí nghiệm: Nước ngọt chứa saccarose (PTN cung cấp)
 Thủy phân saccarose:
o Cho vào bình tam giác 100ml 0,4 ml mẫu (dùng pipet), thêm 19ml nước
cất (dùng ống đong) và 10ml HCl 5% (dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí
và đun sôi cách thủy 30 phút để thủy phân saccarose.
o Làm nguội và trung hòa mẫu bằng NaOH 5% (khoảng 14ml). Thử giấy
chỉ thị pH, so sánh màu đến khi pH = 7.
o Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100ml, định mức bằng
nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử sau thủy phân.
 Dịch đường khử trước thủy phân:
o Dùng pipet cho 0,4 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ
100ml. Định mức bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch
đường khử trước thủy phân.

 Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic ( DNS):
o Thêm nước vào nồi cách thủy và đun sôi.
o Mẫu trước thủy phân:
 0,5ml dịch đường khử trước thủy phân
 1,5ml DNS
 Trộn đều/Votex
 Đun sôi cách thủy 5 phút
 Làm nguội nhanh
 Đưa độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 540nm về 0
o Mẫu sau thủy phân:
 0,5ml dịch đường khử sau thủy phân
 1,5ml DNS
 Trộn đều/Votex
 Đun sôi cách thủy 5 phút
 Làm nguội nhanh
 Đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 540nm với
dung dịch đối sánh là mẫu trước thủy phân

 Sử dụng máy đo quang:

o Mở máy  Phím 2 (Applications)  Phím 1 (Single wavelength)
 Nhập bước sóng (750nm)
o Enter
Thao tác đo mẫu:
o Chọn cuvet không bị xước, vỡ, thao tác cầm cuvet tránh cầm vào
mặt trong của cuvet.
o Tráng cuvet bằng tia nước cất, thấm nhẹ miệng cuvet vào miếng
giấy.
o Cho mẫu dịch trước thủy phân vào cuvet, đặt cuvet sao cho mặt
nhám không che mất đường truyền của ánh sáng => ấn blank.
o Tráng cuvet bằng mẫu dịch sau thủy phân, cho mẫu vào, thấm
nước và lau nhẹ mặt trong cuvet => ấn nút đo mẫu => enter => giá
trị OD. Thực hiện các bước tương tự.

III. Xử lý số liệu:
 Loại mẫu: nước ngọt
 Thể tích định mức: 100ml
 Giá trị OD540nm của mẫu đem phân tích:
Mẫu trước thủy phân: OD540nm = 0.249
Mẫu sau thủy phân: OD540nm = 1.331

a) Thiết lập công thức tính:

Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn có dạng:

y = 1.749x – 0.0746 (R2 = 0.9986)
Với trục y = OD540nm , trục x= [Đường khử] (mg/ml). Thay vào phương trình
đường chuẩn vừa tìm được ở trên các giá trị OD540nm ta có công thức :
y+ 0.0746
Nồng độ đường khử có trong mẫu nước ngọt là: x = 1.749 (mg/ml)

b) Tính toán:
y = 0.249  x = 0.185 (mg/ml)
y = 1.331  x = 0.804 (mg/ml)
Lượng đường khử thủy phân từ saccarose= Lượng đường khử sau thủy
phân- Lượng đường khử trước thủy phân= 0.804- 0.185= 0.619 (mg/ml)
Ta có: 1ml dịch đường  0.619mg đường khử
100 ml dịch đường  61.90mg đường khử

 Số gam saccacrose có trong 100 ml mẫu là:

61.90 × 0.95 = 58.805mg = 0.058805g
 Vậy hàm lượng saccarose trong 0,4 ml mẫu là:
0.058805/0.4 x 100%= 14.7% (g/ml)
IV. Một số lưu ý khi làm thí nghiệm:
* Chuẩn bị đường chuẩn:
o Đun sôi cách thủy trong 5 phút  thời gian đủ để phản ứng xảy ra hoàn
toàn.
o Làm lạnh nhanh trong nước lạnh  khống chế nhiệt độ và thời gian phản
ứng để không xảy ra các phản ứng khác.
o Dùng hỗn hợp glucose: fructose với tỉ lệ 1:1 để xây dựng đường chuẩn.
* Thủy phân saccarose:
o Nước ngọt có ga có chứa khí CO2  đuổi khí bằng cách khuấy.
o Lắp và chọn ống sinh hàn khí phù hợp với bình. Ống sinh hàn khí phải có
độ cao theo đúng chuẩn vì HCl bay hơi lên cao, gặp không khí lạnh trên
cao sẽ được ngưng tụ rơi xuống. HCl là tác nhân phản ứng khi HCl bay
hơi hết sẽ ko còn tác nhân phản ứng dẫn tới phản ứng không được xảy ra
hoàn toàn gây sai lệch số liệu.
o Phải trung hòa mẫu bằng NaOH vì phản ứng xảy ra ở môi trường kiềm
nên không được có axit dư. Ngoài ra dịch đường chuẩn được xây dựng tại
pH=7 nên các mẫu thí nghiệm và kiểm chứng cũng phải có pH=7.
o Có thể sử dụng enzim đặc hiệu (enzim saccaraza) để giải phóng saccarose
tránh thủy phân một số đường khác có tồn tại trong mẫu thí nghiệm.
o Quá trình đun sôi 2 mẫu dịch ta phải thực hiện cùng lúc vì nếu thực hiện
cách thời gian có thể khiến cho dung dịch mất màu dẫn đến sai kết quả.