КАКВО Е ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕКАЦИЯ (PCR)?

 Полимеразната верижна реакция (PCR) е метод за In vitro амплификация на

ДНК, което води до производството на много копия на определена ДНК
последователност. PCR съчетава принципите на комплементарна
хибридизация на нуклеинова киселина и репликация на нуклеинова
киселина, за да амплифицира едно копие на таргетната ДНК
последователност, дори ако е неоткриваема чрез стандартни методи за
хибридизация.
 PCR е изобретен през 1983 г. от американския биохимик Кари Мълис. ползва
се в широк спектър от приложения, включително анализ на древни ДНК
проби, идентифициране на инфекциозни агенти, генно клониране и
манипулиране, секвениране на ДНК, диагностика на генетични разстройства,
криминалистика и откриване на патогени при инфекциозни заболявания.

 PCR методът обикновено разчита на термичен цикъл, който включва

излагане на реакцията на повтарящи се цикли на нагряване и охлаждане.
Тези температурни промени улесняват специфични реакции, като стопяване
на ДНК и ензимно управлявана репликация на ДНК. Двата ключови
компонента на PCR са праймери и ДНК полимераза. Праймерите са къси
едноверижни ДНК фрагменти, известни като олигонуклеотиди, които са
комплементарни на целевата ДНК област. ДНК полимеразата е ензимът,
отговорен за сглобяването на нови ДНК вериги с помощта на праймери и
свободни нуклеотиди.
 PCR процесът включва няколко стъпки. В началния етап на денатуриране
двуверижната ДНК матрица се нагрява до висока температура(94 – 96
градуса), което води до разделяне на двете вериги. След това температурата
се понижава (45-60 градуса), което позволява на праймерите да се свържат с
комплементарните последователности на ДНК. След като праймерите се
свържат, ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига, използвайки
шаблонната ДНК и свободни нуклеотиди( при темп. 72 градуса). Този процес
се повтаря многократно, като всеки цикъл води до амплификация на
целевата ДНК. ДНК, генерирана в един цикъл, се превръща в шаблон за
следващия, което води до експоненциално увеличение на количеството ДНК.
 За да се гарантира успехът на PCR, обикновено се използва устойчива на
топлина ДНК полимераза, като Taq полимераза, която първоначално е
изолирана от бактерията Thermus aquaticus. Taq полимеразата може да
издържи на високите температури на етапа на денатуриране, без да се
денатурира.

Изискванията за PCR включват няколко компонента и условия, които са

необходими за успешната амплификация на ДНК.
1. ДНК шаблон: ДНК шаблонът е целевата последователност, която ще
бъде амплифицирана. Може да бъде изолиран от различни източници,
като кръв, тъкани, съдебномедицински проби или микробни клетки.
ДНК шаблонът трябва да съдържа целевата последователност, която
трябва да бъде амплифицирана.
2. Грундове: Праймерите са къси, едноверижни ДНК молекули, които се
свързват с ДНК шаблона и осигуряват отправна точка за ДНК синтеза.
В PCR се използват два праймера: предният праймер, който се свързва
с една верига от целевата ДНК, и обратният праймер, който се свързва
с допълнителната верига. Праймерите трябва да бъдат проектирани
специално за целевата ДНК последователност, за да се осигури
специфичност и ефективност на амплификацията.
3. ДНК полимераза: ДНК полимеразата е ензим, който синтезира нови
ДНК вериги чрез добавяне на нуклеотиди към праймера. Най-често
използваната ДНК полимераза в PCR е Taq ДНК полимераза, получена
от бактерията Thermus aquaticus. Taq полимеразата е термостабилна и
може да издържи на високите температури, използвани по време на
денатурация. Други ДНК полимерази с възможност за корекция, като
Pfu или KOD полимераза, също могат да се използват за
минимизиране на грешките по време на амплификацията.
4. Нуклеотидите: PCR изисква и четирите дезоксинуклеозид трифосфата
(dNTPs) – аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T) – за
синтезиране на нови ДНК вериги. Тези нуклеотиди се добавят към
реакционната смес при равни концентрации.
5. Буферен разтвор: PCR буферът осигурява необходимите условия и
химикали за оптимална активност и стабилност на ДНК полимеразата.
Обикновено съдържа Tris-HCl за поддържане на pH, KCl за
стабилизиране на отгряването на праймер-шаблон и MgCl2 като
кофактор за активността на ДНК полимераза. Други добавки могат да
бъдат включени в зависимост от конкретния PCR протокол.
6. Едновалентни и двувалентни катиони: Калиевият хлорид (KCl)
обикновено се използва като моновалентен катион в PCR реакции за
оптимизиране на условията за амплификация на ДНК. Двувалентните
катиони, като магнезий (Mg2+), са от съществено значение като
кофактори за активността на ДНК полимераза. Mg2+ йони обикновено
се включват в PCR буфера, въпреки че манган (Mn2+) може да се
използва в определени случаи, като ДНК мутагенеза.
7. PCR тръба: PCR се извършва в малки, тънкостенни пластмасови тръби,
наречени PCR тръби. Тези тръби позволяват ефективна
топлопроводимост и температурно равновесие по време на процеса
на термичен цикъл.
8. Термичен цикъл: Термоциклер, известен също като термоциклер, е
устройство, използвано за бързо нагряване и охлаждане на PCR
 реакционната смес по време на етапите на температурен цикъл.
Съвременните термоциклери използват ефекта на Пелтие за постигане
на прецизен контрол на температурата. Те също така са оборудвани с
нагреваеми капаци за предотвратяване на кондензация и изпаряване
на реакцонната смес

Полимеразната верижна реакция (PCR) е мощна техника, използвана за

амплифициране на специфични ДНК последователности. Това включва
поредица от температурни промени, известни като термични цикли. Стъпките,
включени в PCR, са следните:

1. Инициация: Тази стъпка е необходима за ДНК полимерази, които се

нуждаят от топлинна активация. Реакционната камера се нагрява до
температура от 94-96 °C (или 98 °C за изключително термостабилни
полимерази) и се държи в продължение на 1-10 минути.
2. Денатурация: Реакционната камера се нагрява до 94-98 °C за 20-30
секунди. Това кара двуверижната ДНК матрица да денатурира,
разделяйки я на две едноверижни ДНК молекули.
3. каляване: Температурата се понижава до 50-65 °C за 20-40 секунди.
По време на тази стъпка къси ДНК последователности, наречени
праймери, се свързват към всеки от едноверижните ДНК шаблони.
Праймерите са проектирани да се свързват със специфични региони,
обграждащи целевата ДНК последователност.
4. Удължение/удължение: Температурата се повишава до оптималната
температура на активност на използваната ДНК полимераза,
обикновено около 72-80 °C. ДНК полимеразата синтезира нова ДНК
верига, комплементарна на шаблонната верига чрез добавяне на
нуклеотиди (dNTPs) в посока 5′ към 3′. Тази стъпка разширява
праймерите и синтезира нови ДНК вериги.
5. Колоездене: Стъпки от 2 до 4 (денатурация, отгряване и удължаване)
се повтарят за 20-40 цикъла. С всеки цикъл целевата ДНК се удвоява,
което води до експоненциално усилване на специфичната ДНК
последователност.
6. Крайно удължение: След последния PCR цикъл се извършва краен
етап на удължаване при температура от 70-74 °C за 5-15 минути, за да
се осигури пълно удължаване на останалата едноверижна ДНК.
7. Окончателно задържане: Реакционната камера се охлажда до 4-15 °C
за неопределено време. Тази стъпка позволява краткосрочно
съхранение на PCR продуктите.
За проверка на успеха на PCR може да се използва електрофореза в агарозен
гел. Амплифицираните ДНК продукти се разделят въз основа на размера, като се
използва ДНК стълба като еталон.
PCR е многофункционална техника, използвана в различни приложения, като
анализ на генна експресия, генетични тестове, криминалистика и изследвания в
областта на молекулярната биология. Способността му да амплифицира
специфични ДНК последователности бързо и ефикасно революционизира
много области на изследване.

Полимеразната верижна реакция (PCR) може да бъде разделена на три етапа въз
основа на напредъка на реакцията: експоненциално усилване, изравняване и
плато.

1. Експоненциално усилване: В този етап PCR реакцията претърпява

експоненциален растеж, което води до бързо увеличаване на
количеството на желания ДНК продукт. Всеки цикъл на PCR удвоява
количеството ДНК, като се приема 100% ефективност на реакцията.
Например, след 30 цикъла, едно копие на ДНК може да бъде
увеличено до милиард копия. Този етап демонстрира забележителната
сила на усилване на PCR, позволяваща репликацията на специфична
ДНК последователност в контролирана лабораторна среда. Дори
минимални количества от целевата ДНК са достатъчни за откриване и
анализ.
2. Изравняване : С напредването на PCR реакцията скоростта на
амплификация започва да се забавя. Този етап се характеризира с
намаляване на скоростта на натрупване на продукта. Няколко фактора
допринасят за това забавяне. Ензимът ДНК полимераза може да
започне да губи своята активност с течение на времето, намалявайки
ефективността си при синтезирането на нови ДНК вериги. Освен това,
консумацията на реагенти, като дезоксинуклеотид трифосфати (dNTP) и
праймери, постепенно изчерпва тяхната наличност, ограничавайки
техния принос към реакцията. Тези фактори колективно водят до
намалена скорост на усилване в сравнение с по-ранната
експоненциална фаза.
3. Плато: В етапа на платото не се наблюдава допълнително увеличаване
на натрупването на продукта. Това се случва, когато реагентите и
ензимът, необходими за PCR реакцията, се изчерпят напълно. Тъй като
реакцията напредва и продължава през множество цикли,
ограничената наличност на dNTP и праймери предотвратява по-
нататъшния синтез на ДНК. Освен това ензимът ДНК полимераза може
да се използва напълно или да се разгради, което допълнително
възпрепятства производството на нови ДНК вериги. Реакцията достига
точка, в която не настъпва значително усилване и количеството на
продукта се изравнява.
Тези три етапа на PCR демонстрират динамичния характер на реакцията и
подчертават значението на оптимизирането на реакционните условия,
включително концентрациите на реагентите и цикличните параметри, за
постигане на максимална ефективност на амплификацията. Етапът на
експоненциално усилване демонстрира мощната способност на PCR за бързо
генериране на милиони или милиарди копия на специфична ДНК мишена.

Валидирането на PCR е важна стъпка за гарантиране на успеха и точността на

процеса на амплификация. Могат да се използват няколко метода за валидиране
на резултатите от PCR. Нека разгледаме някои от често срещаните техники за
валидиране:

1. Оцветяване с етидиев бромид: Етидиев бромид (EtBr) е често

използвано багрило за оцветяване на амплифицирани ДНК продукти.
Той се вмъква между базовите двойки на двойната спирала и може да
се визуализира под UV светлина. Границата на откриване на ДНК,
свързана с етидиев бромид, обикновено е около 0.5-5.0 ng на лента.
2. Комбиниран подход от три праймера: В някои случаи може да се
използва подход на комбинация от три праймера за по-рентабилно
крайно маркиране на PCR продукти. Този подход включва използване
на флуоресцентно белязан универсален праймер, модифицирани
локус-специфични праймери и 5' последователни опашки на
универсален праймер. Използването на флуоресцентни етикети
позволява директна визуализация и количествено определяне на PCR
продуктите.
3. Електрофореза с агарозен гел: Електрофорезата в агарозен гел е най-
често използваният метод за валидиране на резултатите от PCR. Тази
техника използва електрически ток за разделяне на ДНК молекули въз
основа на техния размер. Агарозните гелове се използват за ДНК
фрагменти, по-големи от 500 базови двойки, докато
полиакриламидните гелове се използват за по-малки фрагменти. След
електрофореза, ДНК лентите се визуализират чрез оцветяване на гела
с ДНК-специфични багрила като етидиев бромид.

Валидирането на резултатите от PCR с помощта на тези техники помага да

се гарантира надеждността и точността на процеса на амплификация.
Тези методи позволяват на изследователите да потвърдят наличието на
целевата последователност, да идентифицират всички нежелани продукти
и да оценят общия успех на PCR експеримента.

Видове PCR
PCR (полимеразна верижна реакция) е универсална техника, която е претърпяла
различни модификации и адаптации, за да отговори на специфичните нужди в
различни области. Ето някои от често срещаните видове PCR техники:

1. Конвенционален PCR: Това е стандартният PCR метод, при който се

използва единична двойка праймери за свързване към двете
разделени целеви нишки. Той генерира милиони копия на целевите
ДНК последователности.
2. Мултиплексна PCR: Тази специализирана PCR техника използва
няколко двойки праймери, които се свързват с различни целеви
последователности в една проба. Обикновено се използва за
откриване на патогенни микроорганизми и може да идентифицира
мутации, делеции, вмъквания и пренареждания в патогенни проби.
3. Вложен PCR: Вложената PCR се използва за подобряване на
специфичността на амплификацията на ДНК чрез намаляване на
неспецифичната амплификация. Той включва два комплекта двойки
праймери, използвани в последователни PCR реакции. Първият кръг
на PCR генерира по-голям ДНК продукт, който включва целевата
последователност, а вторият PCR амплифицира само специфичната
целева последователност, подобрявайки специфичността.
4. PCR в реално време/количествена PCR (qPCR): Тази техника
позволява количествено определяне на амплификацията на ДНК в
реално време по време на PCR реакцията. Обикновено се използва за
оценка на броя на ДНК мишените, присъстващи в проба, или за
изследване и сравняване на генна експресия.
5. Горещ старт/студен край PCR: Тази PCR техника намалява
неспецифичната амплификация по време на началните етапи на PCR.
Това включва използване на хибридни полимерази, които остават
неактивни при стайна температура и се активират само при по-високи
температури
6. Тъчдаун PCR (Step-down PCR): Touchdown PCR е проектиран да
минимизира неспецифичното усилване чрез постепенно намаляване
на температурата на отгряване на праймера в последователни цикли.
Започва с начални цикли с по-висока температура на отгряване за
повишена специфичност и постепенно намалява температурата за по-
ефективно усилване.
7. Сглобяване на PCR или сглобяване на полимеразно циклиране
(PCA):
8. използвана за потвърждаване на наличието на ДНК вмъквания в
рекомбинантни клонове. Той амплифицира вмъкнатите
последователности, използвайки специфични праймери,
предназначени за векторните региони, обграждащи мястото на
вмъкване. Тази техника позволява скрининг на бактериални колонии,
 трансформирани с рекомбинантни вектори, без първоначално
извличане на геномна ДНК.

9. Обратна PCR: Инверсна PCR се използва за откриване на

последователностите, обграждащи целевата ДНК (странични
последователности). Това включва серия от смилане с рестрикционни
ензими и самолигиране. След това се използват праймери за
амплифициране на последователности в двата края на целевия ДНК
сегмент, простиращи се навън от известния ДНК сегмент.
10. Обратна транскрипция-PCR (RTP):

PCR предлага няколко предимства, които го правят широко използвана и мощна

техника в различни области. Ето някои основни предимства на PCR:

1. Простота и бързина: PCR е сравнително проста техника за разбиране

и изпълнение. Включва няколко основни стъпки и може да се извърши
за относително кратък период от време, обикновено няколко часа.
Това бързо време за изпълнение позволява бърза диагностика и
идентифициране на целевите последователности.
2. Висока чувствителност: PCR е силно чувствителен и има потенциал
да амплифицира дори следи от целева ДНК. Той може да произведе
милиони до милиарди копия на специфичен ДНК фрагмент, което го
прави подходящ за приложения, които изискват високо ниво на
чувствителност, като например откриване на редки генетични
варианти или ниско изобилие на патогени.
3. Възможности за количествено определяне: Количественият PCR в
реално време (qPCR) е вариант на PCR, който позволява количествено
определяне на синтезирания продукт в реално време. Тази функция е
особено полезна за анализиране на промени в нивата на генна
експресия, като например при тумори или микробни инфекции. qPCR
позволява на изследователите точно да измерват и сравняват нивата
на генна експресия в различни проби.
4. Универсалност и гъвкавост: PCR е универсална техника, която може
да се използва в различни приложения. Той позволява амплификация
на ДНК от широк спектър от източници, включително геномна ДНК,
cDNA и дори деградирали или стари ДНК проби. Може да се адаптира
за различни цели, като секвениране, клониране, анализ на мутации и
генотипиране.
5. Специфичност: PCR предлага висока специфичност, когато е
проектиран правилно. Чрез използване на специфични праймери,
които са насочени към желаната ДНК последователност, PCR може
 селективно да амплифицира целевия регион, като същевременно
минимизира амплификацията на нецелевата ДНК. Тази специфика
гарантира надеждни и точни резултати.
6. Инструмент за изследване: PCR е мощен инструмент в
изследванията, позволяващ секвениране на неизвестни етиологии на
заболяването и идентифициране на нови вирусни щамове. Това
позволява на изследователите да идентифицират последователността
от неизвестни досега вируси, свързани с известни, осигурявайки по-
добро разбиране на болестите. PCR допринесе значително за
напредъка на геномиката, молекулярната биология и диагностичните
изследвания.
7. Подобрена диагностика и идентификация: PCR значително подобри
диагностиката и идентифицирането на различни заболявания. Той
позволява бързо и чувствително откриване на патогени, генетични
нарушения и мутации, свързани с рака. Тестовете, базирани на PCR, се
превърнаха в неразделна част от клиничните лаборатории,
осигурявайки по-бързи и по-точни резултати за диагностика на
заболяването.
Като цяло, простотата, скоростта, чувствителността, възможностите за
количествено определяне, многофункционалността, специфичността и
въздействието му върху изследванията и диагностиката на PCR го правят
незаменим инструмент в молекулярната биология, генетиката и клиничните
приложения. Очаква се непрекъснатото му развитие и усъвършенстване да
подобри допълнително приложенията му и да допринесе за напредъка в
различни научни дисциплини.

надеждността и точността на резултатите от PCR в различни приложения.

Приложения на полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция (PCR) направи революция в различни области

на науката и медицината поради своята гъвкавост и чувствителност. PCR и
неговите усъвършенствани варианти направиха възможни няколко приложения,
които някога се смятаха за невъзможни. Ето някои ключови приложения на PCR:

1. Диагностика на инфекции: PCR подходите се използват широко в

клиничните лаборатории за диагностициране на инфекции, причинени
от бактерии, вируси, протозои и гъбички. Тези техники предлагат
специфично и чувствително откриване и количествено определяне на
инфекциозни агенти.
2. Диагностика на генетични дефекти: Системите за откриване,
базирани на PCR, се използват за точно идентифициране на генетични
нарушения преди началото на заболяването и потвърждаване на
 тяхното присъствие след началото. PCR позволява откриване на
наследствени генетични промени и спонтанни генетични мутации.
3. Диагностика и прогноза на раковите заболявания: Подходите,
базирани на PCR, могат да идентифицират гени, свързани с рака, и да
анализират техните модели на експресия. Това помага при определяне
на генетичното предразположение към определени видове рак,
потвърждаване на вида рак, прогнозиране на прогнозата и насочване
на решенията за лечение.
4. Филогенетика: PCR амплификация на филогенетични маркери се
използва рутинно във филогенетичния анализ за идентифициране и
класифициране на организми. Помага за разбирането на
еволюционните връзки и биоразнообразието.
5. Археология: PCR техниките се използват за усилване и подобряване
на качеството и количеството на древна ДНК (aDNA), възстановена от
археологически останки. Това дава възможност за анализ на aDNA за
изучаване на древни популации, еволюционна история и генетично
разнообразие.
6. Рекомбинантна ДНК технология: PCR се използва в
рекомбинантната ДНК технология за генериране на хибридни ДНК
молекули с прецизност. Също така се използва за клониране на ДНК в
специфични вектори за експресия и производство на протеини.
7. Метагеномика: PCR се комбинира с метагеномика за идентифициране
на редки гени и членове на микробни общности. Метагеномиката,
насочена към гени, позволява откриването на редки видове и редки
гени, присъстващи в сложни микробни екосистеми.
8. Насочена към място мутагенеза: Базираните на PCR подходи
обикновено се използват за въвеждане на мутации на специфични
места в ген. Тази техника помага при изучаването на ролята на
специфични аминокиселини в структурата и функцията на протеините.
9. Персонализирано лекарство: PCR технологиите играят решаваща
роля във фармакогеномиката и фармакогенетиката. Генетичните
маркери, проследявани чрез PCR, помагат да се определят
индивидуалните отговори на лечението, да се проектират
индивидуални лекарства и да се предписват ефективни дози лекарства.
10. Криминалистични науки: PCR се използва в криминалистичните
науки за амплифициране на ДНК проби, получени от
местопрестъпления. Дори ДНК проби с лошо качество и ниско
количество могат надеждно да бъдат анализирани чрез PCR,
подпомагайки криминалната идентификация и разследванията.
11. ДНК профилиране: PCR-based methods are employed for DNA profiling,
which exploits the polymorphic nature of DNA. These techniques help
study ecological communities, филогенеза, population genetics, and
provide valuable information in forensic investigations.
12. Профилиране на генната експресия: PCR с обратна транскриптаза и
количествена PCR (qPCR) се използват рутинно за анализ на генната
експресия. Те помагат при профилирането на модели на генна
експресия и валидирането на транскриптомни профили, получени
чрез техники като микрочипове и RNA-seq.
13. Идентифициране на лечебни растения: Базираното на PCR ДНК
баркодиране е бърз и точен инструмент за идентифициране на
лечебни растителни видове. Този подход се използва в различни
области, включително медицина, екология и консервационна
биология, за идентифициране на застрашени и нови видове.
14. Откриване на генетично модифицирани организми (ГМО): PCR
техниките се използват за проследяване на наличието на генетично
модифицирани организми в храните и фуражите. Това гарантира
тяхното регулиране и защитава правата на потребителите чрез
предоставяне на надеждни и бързи методи за откриване.
15. Проследимост на месото: PCR методите се използват за
идентифициране и количествено определяне на фалшификация на
месо в сурови и преработени хранителни продукти. Това помага да се
гарантира точността и целостта на системите за етикетиране и
проследяване на месото.