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기사

교감 신경계는 CD4+ FoxP3+ 조절 T 세포를 조절합

니다.
TGF-β 의존 메커니즘
수로짓 보우믹,* 아누라그 싱,* 리처드 A. 플라벨,† 로버트 B. 클라크,* 제임스 오
루크,* 로버트 E. 콘*.,1
*미국 코네티컷주 파밍턴에 위치한 코네티컷대학교 보건센터 면역학과,† 미국 코네티컷주 뉴헤이븐에 위치한 예일대학교 의과대학 면역생
물학과 및 하워드 휴즈 의학연구소.

접수: 2009년 2월 24일, 수정: 2009년 6월 15일, 승인: 2009년 7월 9일. DOI: 10.1189/jlb.0209107

초록 자가 항원에 대한 면역 관용은 CD4+ FoxP3+ Tregs에 의한 결실

CD4+ FoxP3+ Tregs는 자가 항원에 대한 선천성 면역 반응

, 클론성 알레르기 및 억제를 통해 잠재적으로 병원성 자가 반응

의 필수 매개체입니다. 따라서 Treg 활성과 수의 항상성 조절 성 림프구를 제어하는 메커니즘에 의해 유지됩니다 [1, 2]. 따라

은 자기 항원과 비자기 항원 모두에 대한 면역 반응에 영향을 서 Foxp3+ Tregs의 조작은 다음을 복원하는 유망한 방법임이 입
미칠 수 있습니다. 교감신경계(SNS)는 중추 및 말초 면역계 증되었습니다.
와 화학적, 물리적으로 상호 작용하고 항원 제시 세포와 효과

림프구에 직접적인 영향을 미치기 때문에, 우리는 SNS를 화

학적으로 제거하면 말초 Treg의 수와 기능에 미치는 영향을

조사했습니다. 6- 하이드 록시 도파민에 의한 생쥐 말초 교감

신경 분포의 제거는 비장 및 림프절 CD4+ FoxP3+ TGF-β

의존적 메커니즘에 의한 Tregs의 증가를 유도했습니다. 또한

, 이러한 Tregs의 증가는 실험적 자가면역성 뇌척수염의 유

발을 억제하는 것과 일치합니다. 우리의 연구 결과는 S N S

가 말 초 Treg의 유지에 중요한 기여를 하며 TGF-β가 면

역계와 신경계 사이의 가교 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

스트레스 재연과 같이 SNS에 의해 매개되는 신경학적 사건

은 면역 반응을 조절하는 T 세포의 수에 영향을 미칠 수 있습

니다. 또한, SNS를 통해 Tregs를 표적으로 삼는 것은 자가면

역 질환의 예방 또는 치료에 대한 새로운 접근 방식이 될 수

있습니다. J. Leukoc. Biol.

86: 1275-1283; 2009.

소개
 프 기관의 NE 수치가 90% 이상 감소하는 것으로 입증되었습니
자가 면역 또는 염증 상태를 예방합니다 [3-9]. 일반적으로 자
다 [18]. 6-OHDA는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과하지 않기 때문
연적으로 발생하거나 유도되는 Treg는 세포 표면에 인터루킨
에 말초 투여 시 CNS 카테콜아민 수치가 감소하지 않습니다
-2 수용체 α-사슬(CD25)과 전사인자 FoxP3를 발현하는
[19]. 6-OHDA를 쥐의 CNS에 직접 투여하면 체액성 면역의 억
CD4+ T 림프구로 정의되어 왔습니다[4, 10]. CD25는 Treg
제를 전달하는 세포 또는 EAE의 억제와 함께 OX8+ 세포의 주
세포를 열거하는 데 가장 많이 사용되는 마커이지만[4, 8], 일
름이 유도됩니다 [20 -22]. 마우스에 6-OHDA를 말초 투여하면
부 CD25- T 세포도 조절 활성을 보이기 때문에 CD4+ CD25+
1) 말초 카테콜아민 수치가 감소하고[23, 24], 2) 세포 매개 면
표현형은 Treg 세포에 특이적이지 않습니다[5, 11, 12]. 말초

에서 Treg 세포의 수가 조절되는 메커니즘은 아직 잘 알려져 역의 발현은 억제하지만 체액성 면역은 억제하지 않으며[24,

있지 않지만 자가면역질환을 치료할 수 있는 잠 재 력 을 지 25], 3) 안구 전실에 항원을 주입하여 유도된 항유전자 특이

니고 있습니다. CD8+ 비장 조절 T 세포의 생성을 방지할 수 있습니다[25]. 6-

SNS는 면역 체계와 화학적, 물리적으로 상호 작용하여 면 OHDA 처리 마우스에서 CD8+ 조절 T 세포가 생성되지 않는

역 반응에 상당한 영향을 미칩니다([13-17]에서 검토됨). SNS 것은 CD8+ 조절 T 세포를 유도하는 데 필요한 NE 의존성 조절

가 면역 반응에 미치는 영향은 신경독소 6-OHDA를 쥐의 NK T 세포[26]의 손실 때문일 수 있습니다[27]. 이러한 관찰 결

SNS 신경을 절제(교감신경 절제술)한 결과, 말초 투여 시 림 과를 종합해 보면

SNS는 면역 항상성에 지대한 영향을 미칩니다.

약어: 6-OHDA=6-히독시도파민, BBB=혈액뇌장벽, DTH=지연형 과민증, 를 조절하는 T 세포의 유지에 관여합니다.
EAE=실험적 자가면역 엔-.

두개골염, FoxP3+ =포크헤드 박스 P3+ , MOG=myelin oligodendro-

염료 당단백질, NE=노르에피네프린, qRT-PCR=정량적 RT-PCR, RPL-19= 1. Correspondence: 면역학과, 코네티컷 대학교 보건 센터, 263 Farmington
리보솜 단백질 L-19, SNS=교감 신경계, Treg=T 조절 세포 Ave., Farmington, CT 06030, USA. 이메일: cone@uchc.edu

0741-5400/09/0086-1275 © 백혈구 생물학 협회 86권, 2009년 12월, 백혈구 생물학 저널 1275호


도덕적 및 세포 매개 면역 반응. 그러나 SNS와 면역 조절에 관
한 수많은 데이터가 발표되었음에도 불구하고[13-15, 20-25],
SNS와 세포 매개 면역 조절 사이의 인과적 연관성을 밝히기
위해서는 더 많은 연구가 필요합니다.
분석을 위해 적절한 동형 대조군과 함께 항-CD3, 항-CD4, 항-FoxP3, 항-CD8, 항
-CD122 항체를 eBiosciences(미국 샌디에이고, 캘리포니아주)에서 정 제 했 습
니 다 . FoxP3 염색 키트는 eBiosciences에서 구입했습니다. 세포 증식 및 자극
분석을 위해 항-CD3(145-2C11)은 BD PharMingen(미국 캘리포니아주 새너제
이)에서 구입했습니다. CFSE 염료는 Molecular Probes( 미국 캘리포니아주 칼스

이에 본 연구는 말초의 SNS 신경 분포가 Tregs의 중요한 조절 배드)에서 구입했습니다.

인자일 가능성을 탐색하여 면역 조절 및 내성에 미치는 영향을 평

가하기 위해 수행되었습니다. 이를 위해 우리는 6-OHDA에 의한

말초 교감신경 절제술이 말초 CD4+ FoxP3+ Tregs의 수와 기능

에 미치는 영향과 EAE에 미치는 영향을 조사했습니다. 우리는 말

초의 교감 신경을 제거하면 6-OHDA로 치료받은 마우스의 비장

과 림프절에서 CD4+ FoxP3+ Tregs의 수가 크게 증가한다는 것

을 보여줍니다. 그 결과, 이러한 Treg 수의 증가는 TGF-β를 매개

로 한 자연 T 세포의 Treg 유도 때 문 이 라 는 것을 발견했습니다

. 면역 관 용 을 유지하는 Treg의 역할과 일치하여, 6-OHDA로

치료한 동물에서 Treg 수가 증가한 동물은 EAE가 발생하지 않았

습니다. 따라서 이러한 결과는 SNS가 말초의 Treg 수를 주로 유

지함으로써 면역 항상성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니

다.

재료 및 방법

동물
생후 6~8주 된 암컷 C57BL/6 마우스는 찰스 리버 연구소(미국 매사추세츠

주 윌밍턴)에서 구입했습니다. 미국 뉴헤이븐에 있는 예일대학교의 리처드

플라벨 박사로부터 얻은 TGFbRII 마우스는 코네티컷대학교 보건 센터에서

관리하고 있습니다. Cbl-b-/- 마우스는 코네티컷 대학교 보건 센터에서 보

관하고 있습니다. 모든 동물은 코네티컷 대학교 보건 센터의 실험동물 관리

센터에서 주로 관리했습니다. 동물 사용은 안과 및 시력 연구에서의 동물

사용에 관한 미국 시력 및 안과 연구 협회 결의안을 준수했습니다. 동물과

관련된 모든 작업은 코네티컷대학교 보건센터 동물관리위원회(ACC 2004-

380)의 검토와 승인을 거쳤습니다.

시약
6-하이드록시도파민 하이드로브로마이드(6-OHDA), 데시프라민 및 프로프라

놀롤은 시그마(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다. MOG35–55

(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) 펩타이드는 코네티컷주 뉴헤이븐에 있는

예일대학교의 W. M. 켁 시설에서 제조했습니다. IFA 및 열살균 결핵균 H37Ra

는 Difco Laboratory(미국 미시간주 디트로이트)에서 구입했습니다. 백일해 독

소는 List Biological Labs(미국 캘리포니아주 캠벨)에서 구입했습니다. 유세포

1276 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 제거했습니다. CD4+ CD25– T 세포 집단을 실온에서 10분간 1µM 카르복
교감신경 탈신경화
화학적 교감신경 절제술이
시플루오로 조절석시니미딜
로세인 T 세포를 에스테르(CFSE)와
증가시킵니다. 함께 배양했습니다. 이
비장과 림프절을 제거하기 이틀 전에 생쥐에게 6-OHDA를 복강 내로 투여했습니
러한 T세포 서브세트(5 × 104 세포/웰)를 항원 전구 세포로서 5 × 104 조사
다(체중 200 mg/kg). 각 실험을 위해 PBS(pH 7.2)에 6-OHDA 용액을 신선하
(3,000 방사능)된 자가 PBMC와 0.5 µg/ml의 항-CD3 항체를 코닝 96웰 원
게 준비하여 즉시 사용했습니다. 6-OHDA에 의한 탈신경의 특이성을 확인하기
형 바닥 플레이트에 다양한 비율로 분리 정제된 Tregs의 존재 유무에 따라
위해 일부 마우스는 6-OHDA 주입 2시간 전에 복강 내 6-OHDA와 길항제인
삼중 웰에서 3일 동안 자극했습니다. 4일째 되는 날, 플로우조 소프트웨어가
데시프라민(시그마) 또는 데시프라민 10 mg/kg을 동시에 투여했습니다. 일부
탑재된 FACS 칼리버 기기(미국 캘리포니아주 새너제이 소재 벡톤 디킨슨)
그룹은 6-OHDA 주입 1시간 후 5mg/kg 프로프라놀롤을 다시 투여했습니다
를 사용하여 CFSE 희석으로 증식을 측정했습니다.
.

실시간 qRT-PCR 분석
유세포 분석
비장 세포에서 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qia- gen, Valencia, CA, USA)를
세포 샘플을 0.2% BSA와 0.1% NaN3 (FACS 버퍼)을 함유한 PBS(PBS, pH
사용하여 분리하고 Turbo DNA-free DNase(Am- bion, Austin, TX, USA)로 처
7.2)로 세척했습니다. 최대 10개의6 세포를 포함하는 알리콧을 적절히 희석한
리했습니다. cDNA는 Superscript III 역전사효소(Invitrogen, Carlsbad, CA,
100µl의 Abs와 함께 4°C에서 30분 동안 배양했습니다. Foxp3+ Treg 세포의
USA)를 사용하여 합성했습니다. 10마이크로그램의 cDNA를 SYBR Green
확인을 위해 항-CD3ε, 항-CD4로 염색된 세포를 제 조 사 의 프로토콜에 따
PCR Mas- ter Mix(미국 캘리포니아주 포스터 시티, Applied Biosystems)를 사
라 고정/투과화 버퍼(eBiosciences)를 사용하여 투과화하고, 항-Foxp3-알로
용하여 25µl 반응에서 qRT-PCR로 증폭했습니다. 프라이머는 Primer Express
피코시아닌(FJK-16 s)과 해당 동형 대조군인 IgG2a-알로피코시아닌
소프트웨어 v3.0을 사용하여 설계되었고 프라이머 효율은 기울기 분석으로
(eBiosciences)을 사용하여 염색했습니다. 유세포 분석은 FACSCalibur(BD 바
100% ± 2.5%로 확인되었습니다. qRT-PCR은 ABI 7500 fast 시스템을 사용하
이오사이언스, 미국 캘리포니아주 산호세) 및 FLOWJO(트리스타, 미국 오리
여 수행되었고 데이터는 Δct 방법(SDS 소프트웨어 v3.0)을 사용하여 분석되
건주 애슐랜드) 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다.
었습니다.

프라이머 서열(미국 아이오와주 코럴빌의 Invitrogen 및 IDT)은 표 1에 나

시험관 내 T세포 증식 분석
와 있습니다. 앰플리콘 크기는 ~100bp였습니다.
PBS 및 6-OHDA 처리 동물에서 얻은 CD4+ Fox P3+ Tregs에 대한 CD4+

T 세포의 증식 반응을 비교했습니다. 제조업체의 구조에 따라 MACS

예방 접종
CD4+ CD25+ 조절 T 세포 분리 키트를 사용하여 비장 세포에서 Tregs 및
실험용 자가면역성 뇌척수염 활성 실험용 자가면역성 뇌척수
CD4+ T 이펙터를 분리했습니다. 세포 제제에서 죽은 세포와 죽어가는 세

포를 죽은 세포 제거 키트(Miltenyi Biotec, 독일 베르기쉬 글라드바흐)로 염(EAE) 유 도 를 위해 6-OHDA 또는 PBS 주입 2일 후,

C57BL/6.

표 1. TGF-β의 qRT-PCR 분석에 사용되는 프라이머

유전자 포워드 프라이머 리버스 프라이머

TGF-β1 tcccccgagaggcagatc ATCGAGATGAGCGCTCTGA
RPL-19 CAGAAGATTGACCGCCAT CAGCTTGTGTGATGTGTGTCC
AT

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1277

마우스를 대상으로 500 µg이 첨가된 IFA에 200 µg의 MOG35– 결과
55 를 함유한 에멀젼을 피내 주사했습니다.
6-OHDA를 투여한 마우스에서 MOG 펩타이드에 대한
결핵균. 생쥐에게 첫 번째 면역 접종 직후와 48시간 후 100µl
지연형 과민성 부종 반응이 감소합니다.
의 PBS에 200ng의 백일해 독소(PTX)를 정맥 주사했습니다. 백
6-OHDA를 투여한 마우스에서 지연형 과민성(DTH)이 감소하
신 접종 후 동물을 관찰하여 질병의 정도를 평가했습니다. 이
는 것을 추가로 확인하기 위해 6-OHDA를 주입한 지 2일 후에
연구는 맹검 방식으로 진행되었습니다. 측정된 임상 척도는 다
마우스를 MOG와 CFA에 면역시켰습니다. SNS를 절제하는 데
음과 같습니다:
사용된 6-OHDA의 용량은 동물에게 정상 또는 명백한 신경학
0 = 정상, 1 = 꼬리 절뚝거림, 2 = 걸음걸이가 서투른 하반신
적 증상을 유발하지 않았습니다. MOG를 접종한 후 항원
마비, 3 = 뒷다리 마비, 4 = 사지 마비, 5 = 사망.
(MOG) 챌린지에 의해 유도된 DTH 반응의 부종.

지연형 과민성 유도 6-OHDA가 감소하거나 발생하지 않았습니다(그림 1A). 항원을

생쥐의 옆구리에 200㎍의 MOG 펩타이드(CFA)를 주사하여 면역 접종을
실시했습니다. 대조군에는 아무런 예방 접종을 하지 않았습니다. 백신 접
종 7일 후 생쥐를 케타민(75 mg/kg)과 자일라진(15 mg/kg)으로 마취하고
디지털 마이크로미터(일본 도쿄 미타토요)로 양쪽 뒷발바닥의 발바닥 두께
투여한 부위(6-OHDA 처리 마우스)에서 항원을 투여하지 않은 발
바닥에 비해 단핵구 세포가 유의하게 증가했지만, 침윤된 세포의
수는 PBS를 투여한 마우스에 비해 다소 적었습니다(그림 1B).

를 측정했습니다. 한쪽 발바닥에는 50㎍의 MOG 펩타이드를 PBS에 담아

6-OHDA에 의한 말초 화학적 교감신경 절제술은 말
피내(ID) 주사하고, 다른 쪽 발바닥에는 차량만 주사했습니다.
초 트렉의 수 증가를 유도합니다.
약 24시간 후, 생쥐를 케타민/자일라진으로 마취하고 발바닥 두께를 측정했
6-OHDA가 Treg에 미치는 영향을 조사하기 위해 6-OHDA
습니다. 부종은 24시간 후 자극을 받은 발바닥의 두께 차이(µm)에서 24시

간 후 차량 자극을 받은 발바닥의 두께 차이(µm)를 뺀 값으로 계산했습니다 투여 후 48시간 후 비장 및 사타구니 림프절 세포

.
현탁액을 항-CD4, CD25 및 FoxP3로 염색했습니다. 비장과 서혜
부종을 평가한 후 마우스를 죽이고 항원 또는 차량 챌린지 발을 제거한 후
부 림프절(ILN) 모두에서 CD4+ FoxP3 + T 세포의 빈도가 전
10% 완충 포르말린으로 고정했습니다. 발은 병리학과 연구 조직학 실험실

에서 처리하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색했습니다.

체 CD4+ T 세포의 ~9.8%에서 18%로 크게 증가했습니다(그

림 2A, B). 이러한 T 조절 세포 수의 증가는 동일한 표현형을 가

CD4+ T 세포 분리 및 입양 이식 진 세포의 절대 수를 계산했을 때 일관된 것으로 나타났습니다(
CD4+ T 세포는 제조업체의 지침에 따라 CD4+ T 세포 분리 키트(밀텐이 바 그림 2C). Treg 표현형을 가진 T 세포의 증가가 6-OHDA에 의
이오텍)를 사용하여 분리했습니다. 세포 제제에서 죽은 세포와 죽어가는 세
한 것인지 확인하고 6-OHDA에 의한 교감신경 탈신경의 특이성을
포를 죽은 세포 제거 키트(Miltenyi Bio- tec)로 제거했습니다. 분리된 집단은
확인하기 위해 데시프라민(DES)을 사용하여 다음과 같은 물질
CD4+ T 세포의 경우 순도가 90~95%였습니다. 입양 이식을 위해 총 1 × 10
의 흡수를 구체적으로 방지했습니다.
개의6 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사했습니다. 주사는 MOG 펩타이드

와 함께 면역 접종 당일에 이루어졌습니다. 교감 신경세포에 의한 6-OHDA. 6-OHDA를 투여하기 2시간

전에 DES로 치료하면
통계
6-OHDA를 매개로 한 CD4+ FoxP3+ T 세포 수의 증가(그림 2A-
발바닥 부종, TGF-β mRNA 수준 및 Tregs의 빈도를 PBS 처리 그룹과 6-
C). 또한, 프로프라놀롤로 치료하면 (
OHDA 처리 그룹 간에 짝을 이룬 t 검정으로 비 교 했 습 니 다 . 두 개 이상의
β-차단제)의 흡수를 막는 6-OHDA 주입 후 6-OHDA로 인한 비장
그룹을 비교할 때는 반복 측정 공변량 분석(repeated-measure ANOVA)을 사
및 림프절 CD4+ FoxP3+ T 세포 수의 증가에 영향을 미치지 않았
용했습니다. 모든 비교에서 통계적 유 의 성 을 결정하기 위해 P <0.05를 사
다고 제안합니다.
용했습니다.

1278 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 화학적 교감신경 절제술이 조절 T 세포를 증가시킵니다.

그림 1. 6-OHDA를 처리하고 면역을 받은 마우스에서 DTH 반응의 폐지. 생 쥐 에 게 6-OHDA(200 mg/kg)를 정맥 투여한 후 2일 후에 MOG/CFA를 접종했습

니다. 대조군은 아무런 예방 접종을 받지 않았습니다. 백신 접종 7일 후, 한 발바닥에는 MOG를, 다른 발바닥에는 차량만 투여했습니다. (A) 챌린지

24시간 후 측정한 발바닥의 두께. 막대 그래프는 6마리/그룹, 2개 실험의 평균 ± SE 발바닥 부종을 나타냅니다. (B) 도전하지 않은 면역 마우스(대

조군), 면역 마우스, 면역 2일 전에 PBS 또는 6-OHDA를 정맥 주사한 후 도전한 마우스의 MOG 도전 24시간 후 발바닥의 조직학. 생쥐는 PBS 또는

6-OHDA 처리 그룹에서 세포의 혈관 주위 침윤을 보였습니다. 배율 ×20.

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1279

 그림 2. 말초 화학적 교감신경 절제술의 종류는 다음과 같습니다.
6-OHDA는 트렉의 수 증가를 유도합니다.
(A) 대표 점 플롯은 마우스(C57BL/6) 비장 및 사타구니

림 프 절 세포의 유세포 분석으로 PBS, 6-OHDA 또는

데시프라민과 6-OHDA를 주입한 후 48시간이 지난 시

점의 세포를 보여줍니다. 플롯은 게이티드 CD4 T 세포

를 나타냅니다. 오른쪽 위 사분면의 값은 전체 CD4 T 세

포의 백분율로 CD4+ FoxP3+ T 세포를 나타냅니다. (B)

막대 그래프는 평균 결과를 보여줍니다(n=12-15).

(C) 위 실험에서 CD4+ FoxP3+ Tregs의 절대 수를 보여

주는 막대 그래프. 비장의 유세포 분석 데이터에서 숫자

를 계산했습니다. (D) 프로프라놀롤은 다음의 증가를 막

1280 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 화학적 교감신경 절제술이 조절 T 세포를 증가시킵니다.
지 못했습니다.

화학적 교감신경 절제술에 의한 트렉: 대표 점 플롯은 마우스(C57BL/6) 비장 및 사타구니 림프절 세포의 유세포 분석 후 48시간 후 PBS, 6-

OHDA 또는 6-OHDA를 주입하고 프로프라놀롤을 주입한 후의 유세포 분석 결과를 보여줍니다. 플롯은 게이티드 CD4 T 세포를 나타냅니다.

오른쪽 위 사분면의 값은 전체 CD4 T 세포의 백분율로 CD4+ FoxP3+ T 세포를 나타냅니다. (E) 6-OHDA는 총 CD8+ 세포 또는 CD8+

CD122+ 세포의 수에 영향을 미치지 않습니다. 대표 점선도는 PBS 또는 6-OHDA를 주입한 후 48시간이 지난 시점에서 마우스(C57BL/6) 비

장 세포의 유세포 분석 결과를 보여줍니다. 세포는 CD3+에 대해 게이팅됩니다. 오른쪽 상단 사분면의 값은 CD8+ CD122+ T 세포를 나타냅니

다.

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1281

6-OHDA의 영향이 교감신경 절제술 후 노르에피네프린의 대량

방출 때문이 아니라는 것을 밝혀냈습니다(그림 2D). CD8+ 조절

T 세포에 대한 잘 정의된 마커는 없지만[28, 29], 최근에는 CD8+
CD122+ 조절 T 세포가 EAE로부터 마우스를 보호하는 데 필수
적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다[30]. 따라서 우리는 6-
OHDA 처리 전후의 CD8+CD122+ 조절 T 세포의 수를 측정했습
그림 3. 6-OHDA로 처리한 마우스의 Tregs는 PBS로 처리한 마우스의
Tregs와 기능적으로 유사합니다. 체외 Treg 기능 분석: CD4+ CD25– 각
그룹에서 무반응성 C57BL/6의 비장에서 채취한 T 세포(T eff)를 CFSE
로 표지했습니다. CFSE가 표지된 반응성 T 세포는 자극을 받지 않은
상태(무자극)에서는 증식하지 않았지만, 자극 그룹에서 CFSE의 희석

니다. 으로 입증된 바와 같이 용해성 항-CD3가 있는 경우 증식했습니다. 다음

6-OHDA로 치료한 후 비장에서 CD8+ T 세포의 빈도에는 변 과 같은 조건에서 T 효능 및 항원 제시 세포(생 비장 DC)와 함께 배양된

Tregs는 다음과 같습니다.

화가 없었습니다(그림 2E).
항-CD3는 CFSE 희석으로 정량화한 결과 응답자 T 효능 세포의 증식을

6-OHDA를 처리한 마우스의 트렉은 PBS를 처리한 마우스 억제합니다. 대조군 또는 6-OHDA 처리된 동물에서 Treg를 분리하여

1:1, 1:2, 1:4 Treg-to-T 효능 비율로 na¨ıve T 효능 세포와 함께 배양했습

의 트렉과 기능적으로 유사합니다.
니다.
화학적 교감신경 절제술이 Tregs의 기능적 능 력 에 미치는 영

향을 항-CD3 유도 이펙터 T 세포의 시험관 내 증식 억제 분석으

로 조사했습니다.

교감신경절제 마우스 또는 PBS 처리 마우스에서 분리한 비장

Treg 세포를 항-CD3 및 항원 제시 세포가 있는 상태에서 순진

한 마우스의 CFSE 표지 CD4+ T 이펙터(CD4 T eff)와 공동 배양

했습니다. 3일간 배양한 후, Tregs의 존재 유무에 따라 항 CD3

로 유도된 T 이펙터의 증식을 CFSE 희석에 따라 측정했습니

다. 그 결과, 교감신경절제 동물에서 분리한 Tregs가 PBS로 처

리한 대조군과 비교했을 때 항 CD3에 의해 유도된 T 효능의

증식을 억제하는 능력에 변화가 없다는 것을 발견했습니다(그

림 3). 이러한 결과는 SNS가 Treg 항상성 유지에 관여하지만

기능에는 영향을 미치지 않을 수 있음을 시사합니다.

6-OHDA로 유도된 교감신경 절제술은 총 CD4+ T 세포의

빈도를 변화시키지 않습니다.
말초 CD4+ FoxP3+ T 세포의 6-OHDA 유도 증가에 대한 메커

니즘을 확인하기 위해, 우리는 Treg의 증가가 6-OHDA가 T 이

펙터 세포를 Treg로 "전환"하여 T 이펙터 세포에 직접적인 영

향을 미치기 때문일 수 있다고 생각했습니다.

1282 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 화학적 교감신경 절제술이 조절 T 세포를 증가시킵니다.
를 예방합니다.
표현형. 또는 6-OHDA가 Treg를 유도하는 다른 요인에 영향

을 미치거나 6-OHDA 치료 후 기존 Treg의 증식이 강화될 수 6-OHDA 주사는 CD4+ FoxP3+ Tregs의 수를 증가시키고 이

있습니다. 6-OHDA는 비장에 있는 총 CD4+ T 세포의 빈도 러한 세포는 EAE를 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에 [4,

에는 변화를 일으키지 않았지만, CD4+ FoxP3+ Tregs 및 8, 9, 35, 36], 우리는 사용 가능성을 탐색했습니다.

CD4+ CD25+ 세포의 빈도는 증가하여(그림 1 및 4) 6- 6-OHDA는 EAE를 예방할 수 있습니다. 미엘린 희돌기아교세

OHDA가 T 이펙터를 Treg 표현형으로 전환하도록 유도했음 포 당단백질(MOG) 면역 전에 6-OHDA를 투여한 마우스에서

을 시사합니다. 6-OHDA가 T 세포에 미치는 직접적인 영향 EAE의 발병이 지연되고 EAE의 발현이 유의미하게 감소했습

을 확인하기 위해, 순진한 마우스에서 T 이펙터와 Treg를 회 니다(그림 6A). 6-OHDA에 의한 CD4+ T 조절의 증가가 EAE

수하여 시험관 내에서 6-OHDA와 함께 배양했습니다. 6- 의 유발에 영향을 미치는지 조사하기 위해, PBS 또는 6-OHDA

OHDA를 사용한 배양에 의한 Treg 표현형의 증식 및/또는 처리 마우스로부터 1 × 106 비장 CD4+ T 세포를 MOG를 면

유도에 대한 영향은 관찰되지 않았습니다(데이터는 표시되 역시킨 직후에 재수용 마우스에 주입했습니다. PBS 처리된 마

지 않음). 우스의 CD4+ T 세포는 EAE 유발에 영향을 미치지 않았습니

다(그림 6B). 그러나 6-OHDA로 처리한 마우스의 1 × 106

6-OHDA에 의한 Tregs의 증가는 TGF-β에 의해 매개
CD4+ T는 비록 그 억제가 유의미하지는 않았지만 수용자의
됩니다.
EAE에 개선 효과를 보였습니다(그림 6B).
TGF-β는 FoxP3+ Tregs의 유도 및 생존에 관여하는 주요 요인

으로 정의되었습니다 [3, 7, 10, 31, 32]. 따라서 우리는 화학적 교

감신경 절제술 후 비장의 TGF-β 수치를 조사했습니다. 말초에

6-OHDA를 주입하면 qRT-PCR로 평가 한 결과 비장에서 TGF-

β mRNA의 외압이 크게 증가했습니다 (그림 5A). 이러한 TGF-

β mRNA의 증가가 6-OHDA에 의한 비장 Treg의 증가와 관련이

있는지 확인하기 위해 TGFbRII 형질전환 마우스와 Cbl-b-/- 마

우스에 6-OHDA를 주입했습니다. TGFbRII 형질전환 마우스의

T 세포는 우성 음성 TGF-β 수용체 II [33]를 발현하며, TGF-β

에 내성이 있는 CD4 T 세포를 재생합니다. Cbl-b-/- T 효능은 또

한 정상 수준의 II형 TGF-β 수용체를 발현함에도 불구하고

TGF-β에 대한 반응성이 감소된 것으로 나타났습니다 [34]. 6-

OHDA 주사 후 48 시간 후, TGFbRII 형질 전환 마우스 또는

Cbl-b-/- 마우스의 비장에서 Treg 빈도에는 큰 변화가 없었습니

다 (그림 5B, C). 그러나 비장으로부터의 qRT-PCR은 6-OHDA

주입 후 TGFbRII 형질전환 마우스에서 TGF-β mRNA의 발현

에 주름이 있음을 보여주었습니다(그림 5D). 이러한 CD4의 증

가 부족은+
FoxP3+ 마우스에 6-OHDA를 투여한 후의 트랩
T 세포가 TGF-β에 내성을 갖는다는 것은 TGF-β 신호 전달이 6-

OHDA에 의한 비장 및 림프절 Tregs의 증가에 관여한다는 것

을 시사합니다.

6-OHDA로 유도된 말초 화학적 교감신경 절제술은 EAE

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1283
그림 4. 6-OHDA로 유도된 교감신경절

제술은 총 CD4+ T 세포의 빈도를 변화

시키지 않습니다.
C57BL/6 마우스를 다음과 같이 처리했습니다.
6-OHDA를 투여하고 대조군 쥐는 PBS

를 투여했습니다. 주사 후 48시간 후, 전

체 비장 세포를 염색했습니다. 치료 후

48시간 후 비장에 있는 CD4+ CD25+

T 세포의 비율을 나타내는 대표적

FACS 도트 플롯입니다. 플롯은 전체

림 프 구 게이트를 나타냅니다. 값은

전체 림프구의 백분율로 다양한 세포

유형을 나타냅니다.

토론 6-OHDA는 BBB를 통과할 수 없기 때문에, 6-OHDA의 말초

투여가 조절 T 세포에 미치는 영향은 아직 결정적이지 않습니

6-OHDA를 중추신경계에 투여하면 쥐의 EAE가 억제되었고
다. 중앙에서 투여하는 것과는 대조적으로
[22, 37], 쥐의 후각 면역 반응이 손상되었는데, 이는 아마도 T

세포의 활동을 향상시킴으로써 가능했습니다[20, 21]. 중앙 관 6-OHDA의 말초 투여에 의한 SNS의 화학적 절제가 루이스 쥐

리 [38, 39]와 마우스[40]에서 EAE를 향상시킨다는 보고가 있습니

면역 접종 전 6-OHDA는 1) 척수에 침윤하는 단핵 세포의 수 다. 신생 루이스 쥐는 말초 교감신경 절제술을 유도하는 데 사용

에는 영향을 미치지 않았지만 쥐의 혈관 주위 병변에서 T 억제 되었습니다 [38, 39]. 신생 설치류의 경우 BBB가 불완전하게 발
세포 표현형 OX8을 가진 세포의 수를 증가시켰고[22], 2) 쥐 달하기 때문입니다,
의 비장 T 억제 세포 활동을 강화시켰습니다[20]. 그러나 6-OHDA는 뇌로 들어가 중추 도파민을 손상시킬 수 있습니다.
및 노르아드레날린성 뉴런과 더불어 말초

그림 5. 6-OHDA에 의해 유

도된 Tregs의 증가는 TGF-β

에 의해 매개됩니다. (A) 주사

후 48시간 후 채취한 총 비장

1284 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 세포에서 qRT-PCR로 평가한
화학적 교감신경 절제술이 조절 T 세포를 증가시킵니다.
PBS 또는 6-OHDA 처리된

C57BL/6 마우스의 TGF-β

mRNA 발현. 막대 그래프는

RPL-19(하우스키핑 유전자)

발현의 백분율로 TGF-β

mRNA 발현을 보여줍니다.

(B) CD4+ FoxP3+ Tregs의

백분율을 보여주는 대표적

FACS 도트 플롯.

처리 후 48시간 후, PBS 처리 또는 6-OHDA 처리된 TGFbRII 형질전환 마우스와 Cbl-b-(-/-) 마우스의 비장에서의 세포 수를 측정합니다. 플롯
은 게이티드 CD4 T 세포를 나타냅니다. 오른쪽 상단 사분면의 값은 전체 CD4 T 세포의 백분율로 CD4+ FoxP3+ T 세포를 나타냅니다. (C) 막
대 그래프는 평균 결과를 보여줍니다(n=10). (D) 주사 후 48시간 후 채취한 총 비장 세포에서 TGFbRII 마우스 qRT-PCR로 측정한 6-OHDA
유도 말초 교감신경 절제술 전후의 TGF-β mRNA 발현. 막대 그래프는 RPL-19 발현의 백분율로 TGF-β mRNA 발현을 보여줍니다.

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1285

 이 말초 Tregs의 발현과 기능에 미치는 영향을 조사했습니다. 생쥐

의 교감신경 절제에 사용된 6-OHDA의 용량(200 mg/kg)은 명백한

신경 논리 손상을 유발하지 않았습니다. 실제로, 이 용량의 6-

OHDA를 투여한 마우스에서는 항체 생산이 영향을 받지 않거나

때때로 강화되었습니다 [25]. DTH로 인한 부종은 다음에서 크게

감소했습니다.

6-OHDA 처리, MOG 면역 마우스. 6-OHDA를 투여한 마우스에

서 MOG가 침범한 부위에 축적된 단핵구 세포는 다소 적었지

만, 침윤된 단핵구 세포의 수는

그림 6. 6-OHDA로 유도된 말초 화학적 교감신경절제술이 EAE를 예방

합니다. (A) 7~8주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 6-OHDA를 주사한 후 48

시간 후 앞서 설명한 대로 MOG를 면역 처리했습니다. 차량 처리 마우스

(밝은색)와 6-OHDA 처리 마우스(어두운색)의 임상 점수(0, 정상, 1, 꼬리

절뚝거림, 2, 서투른 걸음걸이의 마비, 3, 뒷다리 마비, 4, 사 지 마 비 , 5,

사망)를 매일 평가했습니다. 데이터는 평균 점수(n=10, 차량 및; n=12,

6-OHDA) ± SE를 나타냅니다. (B) 마우스를 MOG 펩타이드에 면역시키

고, 면역 직후 PBS 또는 6-OHDA 처리된 마우스로부터 1 × 106 CD4+ T

세포(정맥주사)를 투여했습니다. 주사하지 않은 경우(검은색), PBS-

CD4+ T 세포를 주사한 경우( )및

6-OHDA- CD4+ T 세포 주입(밝은 그늘) 마우스, 매일 평가. 데이터는 평

균 점수를 나타냅니다(n=10, 주사하지 않음, n=10, PBS-CD4+ T 세

포 주사, n=12, 6-OHDA-CD4+ T 세포 주사).

작용. 이러한 연구 결과를 종합하면, 신경독소 투여 경로에 따

라 질병 발생 및 진행에 관여할 수 있는 교감신경 탈신경 패턴

이 달라진다는 것을 알 수 있는데, 이는 보조제 유발 관절염의

경우에서 볼 수 있습니다[41]. 또한, 초기 연구에서 화학적 교감

신경 절제술이 관문/억제 T 세포를 강화한다고 제안했지만[20,

22], 표현형적으로 확인된 Treg에 대한 확실한 증거는 아직 부

족합니다.

따라서 우리는 6-OHDA에 의한 생쥐의 말초 교감신경절제술

1286 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 화학적 교감신경
성이절제술이 조절 T 세포를 증가시킵니다.
높습니다.
세포가 대조군보다 상당히 높았습니다. 6-OHDA로 처리한 TNP
TGF-β는 FoxP3+ Tregs의 유도 및 생존에 관여하는 주요 요인
면역 마우스에서 트리니트로페놀(TNP)에 대한 DTH를 측정했을
으로 정의되었습니다 [4, 6, 31, 51, 52]. 교감 신경을 절제하면 비
때도 비슷한 결 과 를 얻었습니다(S. Bhowmick, 미공개 데이터).
장에서 TGF-β mRNA 수치가 현저히 증가했습니다. 6-OHDA
또한 6-OHDA 처리는 DTH 부종은 억제되지만 IFN-γ 생성 세포
투여는 TGF-β에 내성이 있는 TGFbRII 또는 Cbl-b -/- 마우스에
의 유도를 막지는 못합 니 다 [25]. CD8+ 조절 T 세포에 의한
서 CD4+ FoxP3+ Treg 수 의 증가를 유도하지 않았기 때문에 이
DTH 반응의 국소적 억제는 항원에 의해 도전받는 부위에 단핵구
러한 TGF-β의 증가는 Treg의 빈도 증가를 유발하는 데 직접적으
세포가 모집되는 것을 방지합니다 [42]. 따라서 부종 억제는
로 관여합니다. 그럼에도 불구하고, 6-OHDA는 TGFbRII 마우스
CD8+ 조절 T 세포에 의해 매 개 되 지 않았으며, 6-OHDA 주
의 비장에서 TGF-β mRNA 수치를 증가시켰습니다. NE가 간세
입 후에도 그 수가 변하지 않았습니다. 항원 챌린지 후 DTH 부위
포에서 시험관 내에서 생성되는 TGF-β를 용량에 따라 감소시키
에 모집된 단핵구 세포의 대부분은 챌린지 항원에 특이적이지 않
거나 증가시킬 수 있다는 시험관 내 연구에 의해 시사된 바와 같이
습니다 [43]. 이러한 관찰은 6-OHDA 처리가 세포 매개 반응의
, NE는 TGF-β 생성에 억제 효과가 있을 수 있습니다.
유 도 를 억제하지는 않지만 항원 도전을 받은 부위에서 혈관

반응을 예방했을 수 있음을 시사합니다. 이러한 관찰은 브라디키

닌에 의해 유도된 활막 혈장 유출이 교감신경 뉴런에 의존한다는

보고와 일치합니다[44, 45].

6-OHDA의 말초 투여는 비장과 림프절에서 CD4+ FoxP3+

T 세포의 빈도와 수를 증가시켰지만 모든 CD4+ 또는 CD8+ T

세포의 빈도는 증가시키지 않았으며, 이는 Treg 표현형을 가진

CD4+ T 세포가 선택적으로 증가했음을 시사합니다. CD4+

FoxP3+ T 세포의 수는 증가했지만, 교감신경절제 마우스에서

분리된 Treg의 기능적 능력에는 변화가 관찰되지 않았습니다.

우리의 연구 결과는 말초 조직의 교감 신경을 타르에 의해 절

제하는 것이 자가 면역 질환의 치료법으로 사용될 수 있는

Tregs를 유도하여 활성 내성을 유도하는 새로운 접근 방식이

될 수 있음을 나타냅니다.

생체 내에서 대부분의 Treg는 흉선에서 생성되는 것으로

보이지만[4], 이러한 세포는 말초에서도 생성될 수 있습니다

[10, 46]. 실제로 말초 Tregs가 흉선 Tregs의 말초 전이뿐만 아

니라[32, 47] 기존의 CD4+ Foxp3– T 세포에서 새롭게 생성될

수 있다는 증거가 증가하고 있습니다[48 -50]. 6-OHDA 주입

이 전체 CD4+ T 세포의 빈도에 변화를 일으키지 않았다는 관

찰에 의해 기존 Tregs의 확장 가능성은 배제됩니다. 또한, 우

리는 시험관 내에서 순진한 T 이펙터 또는 Treg를 6-OHDA

에 노출시킴으로써 6-OHDA가 T 이펙터 및 Treg의 표현형

또는 증식에 미치는 직접적인 영향을 확인하지 못했습니다(

데이터 표시 안 함). 이에 따르면 CD4+ Tregs의 전환은 교감

신경세포에 대한 6-OHDA의 이차적 효과로 인한 것일 가능

www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1287

 과 민 성 MOG 특이 T 세포의 활동을 방지하기 때문에 이러한 세
의존적인 방식으로 [53]. 또한, 세포 내 수준은

TGF-β는 세포 내 산화 조건의 증가에 의해 증가합니다 [54]. 따 포가 이 억제에 관여할 가능성이 높습니다 [8, 9]. 여기서 중요한 점

라서 6-OHDA에 의한 신경세포의 산화 조건이 증가하면 신경 은 면역 접종 전 교감신경 절제술이 EAE의 유도를 막는 Tregs를 유

세포의 TGF-β가 증가할 수 있습니다. 말초 교감신경 절제술 도할 수 있지만, 교감신경 절제술이 활성화된 T 세포를 억제하는

에 의해 유도되는 TGF-β의 증가 메커니즘과 TGF-β의 공급 CD8+ Tregs [25]의 유도 억제를 통해 때때로 EAE를 강화할 수 있

원은 연구 중입니다. 쥐 소뇌의 뉴런은 TGF-β를 생성하는 것 다는 점입니다[40]. 따라서 면역화와 관련된 교감신경 절제술의 타

으로 나타났으며, 이는 뇌 형성 T 세포로부터 조절 T 세포의 이밍과 투여 경로에 따라 EAE가 억제되는지 또는 강화되는지가 결

생성으로 이어질 수 있습니다 [55]. 따라서 뉴런은 우리 시스템 정될 수 있습니다.

에서도 TGF-β의 주요 공급원이 될 수 있습니다. 또한, 우리의 종합하면, 우리의 연구 결과는 말초의 Tregs 수 가 SNS 신호

결과는 교감 뉴런이 Treg 생성을 조절한다는 것을 시사합니다. 에 의해 조정되고 TGF-β가 SNS와 면역 체계 사이의 다리 역할

또한, 우리의 연구는 활성화 된 뇌 유발 성 T 세포에 대한 소뇌 을한다는 것을 시사합니다. 또한, 우리의 관찰은 말초 면역계에

뉴런의 영향을 연구 한 Liu 등 [55]과 비교하여 EAE의 유도 단 서 TGF-β의 생산과 SNS 사이의 밀접한 관계를 정의합니다. 이

계에서 EAE를 억제 할 수있는 말초 메커니즘을 제안합니다. 러한 관찰은 스트레스 반응과 같이 SNS에 의해 매개되는 신경학

전신적으로 투여된 적 사건이 면역 재구성을 조절하는 T 세포의 수에 영향을 미칠

6-OHDA는 BBB를 통과하지 못하며, 본 연구에서 소뇌 뉴런이 수 있음을 나타냅니다.

TGF-β의 공급원일 가능성은 낮습니다.

많은 연구를 통해 EAE와 같은 자가면역질환에서 Tregs의 보

호 역할이 입증되었습니다 [3, 4, 8, 9]. 여기에서는 MOG 면역 접

종 48시간 전에 6-OHDA를 주사하면 마우스에서 MOG로 유발

된 EAE의 발생을 예방할 수 있음을 보여줍니다. 이 결과는

CD4+ FoxP3+ T 조절을 50% 증 가 시 키 면 EAE 유 발 이

억제된다는 이전 연구 결과를 더욱 확인시켜줍니다 [35]. 6-

OHDA 처리는 생체 내 CD4+ FoxP3+ T 조절의 수를 약 50% 증

가시켰습니다. 6-OHDA 처리 동물에서 1×106 CD4+ T 세포를 입

양하여 이식한 결과 EAE의 유도가 감소했지만, 이 감소는 통계

적으로 유의미하지 않았습니다. 그러나 6-OHDA 처리 동물의 전

체 CD4+ T 세포 집단은 PBS 처리 그룹에 비해 CD4+ FoxP3+ T

regs가 더 많았으며, 6-OHDA 처리 동물의 CD4+ T 세포는 PBS

처리 동물의 세포보다 억제력이 더 컸습니다. 따라서 다음을 직접

주입하면 EAE를 효율적으로 억제할 수 있지만

6-OHDA(CD4+ T 레그 수치를 다음과 같이 증가시킵니다.

~50%), 전체 CD4+ T 세포의 입양 이동에 의한 억제는 이동된

집단에서 낮은 CD4+ T Fox P3+ T reg 수로 인해 효율적이지 않았

습니다. 이것은 화학적 교감신경 절제술 후 EAE 유 도 의 억제가

증가된 Treg 수에 기 인 한 다 는 것을 설득력 있게 보여주지는 않

지만, 1) 수용자에서 Treg의 입양 전이가 EAE를 누르고 2) Treg가

1288 백혈구 생물학 저널 86권, 2009년 12월호 www.jleukbio.org

 tlieb, P. A., Kapranov, P., Gingeras, T. R., Fazekas de St Groth, B., Clay-
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Treg 확장 방법이 유망할 수 있습니다 [57- 60].

감사

이 연구는 부분적으로 국립보건원 보조금 EY017537 및

EY017289(R. E. C.), 코네티컷 라이온스 안구 연구 재단(J.

O. R.), 코네티컷 대학교 보건 센터 연구 자문 위원회의 지원

으로 수행되었습니다. 저자들은 프라이머 및 PCR 분석 설계

에 도움을 준 아만다 방(코네티컷 대학교 보건센터 면역학과)

에게 진심으로 감사드립니다.

공개

저자는 재정적으로 상충되는 이해관계가 없습니다.

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www.jleukbio.org 86권, 2009년 12월호 백혈구 생 물 학 저널 1291