Cytogenetyka molekularna – CGH i aCGH.

Porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy

Techniki cytogenetyczne

oparte na hybrydyzacji DNA

MLPA – amplifikacja sond zależna od ligacji
(ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

(ang. fluorescent in situ hybridization)

qPCR - ilościowy PCR (ang. quantitative)

aCGH – porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy

(ang. (microarray-based comparative genomic hybridization)

SNP – polimorfizm pojedynczego nukleotydu

(ang. single nucleotide polymorphism)

pz – para zasad;
Mpz – milion par zasad
 Hybrydyzacja DNA
HYBRYDYZACJA–zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów
nukleinowych(DNA z DNA,RNA z RNA, czyDNA z RNA).
Aby doszło do hybrydyzacji wcześniej komplementarne nici kwasów nukleinowych muszą ulec
rozdzieleniu (DENATURACJI) – często dzieje się to pod wpływem wysokiej temperatury, można
użyć też substancji chemicznych (formamid, mocznik).
Po przestaniu działania czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (RENATURACJA).
Podstawy CGH
Porównanie „normalnej” próbki z nieznaną
próbką – równoczesna hybrydyzacja mieszaniny
wyznakowanego w różny sposób DNA badanych
komórek (np. nowotworowych) i referencyjnego
DNA (komórek prawidłowych) do chromosomów
metafazowych w preparacie cytologicznym.

Stosuje się dwubarwną fluorescencję detekcji

zhybrydyzowanego DNA nieprawidłowego
(zielony) i prawidłowego (czerwony) → ilościowa
analiza komputerowa stosunku intensywności
obu sygnałów fluorescencji wzdłuż
poszczególnych chromosomów.

Zaletą metody CGH jest możliwość analizy

aberracji w obrębie wszystkich chromosomów
wykonując pojedynczą hybrydyzację.
 Wynik CGH

Nazwa jednostki (zmiana w opcji Nagłówek i stopka)

ANALIZA CHROMOSOMU 2.
 Podstawy aCGH
aCGH polega na porównaniu intensywności
fluorescencji zhybrydyzowanych do sond
fragmentów DNA pacjenta i kontroli.

Sond w zależności od macierzy jest kilkadziesiąt

tysięcy-kilkaset tysięcy, w miarę równo rozłożonych
w genomie. Rozdzielczość takiej metody to średnio
300kpz (dla macierzy o 60 tys. sond), choć to zależy
od konkretnego fragmentu genomu. Na macierzach
o większej liczbie sond rozdzielczość jest wyższa.

Sondami są obecnie głównie oligonukleotydy.

Nazwa jednostki (zmiana w opcji Nagłówek i stopka)

https://molekularnie.wordpress.com/2020/11/26/zrozumiec-arreje-o-acgh/
 Co możemy wykryć za pomocą aCGH?

pozwala na wykrycie niezrównoważonych zmian genomowych w badanym

materiale, w czasie jednego eksperymentu – delecji (utrata materiału
genetycznego) oraz
Katedra i Zakład Biologii duplikacji
i Genetyki Medycznej i/lub amplifikacji (dodatkowy materiał genetyczny).
 Czego nie wykryjemy przy pomocy aCGH?

Dodatkowo technika nie pozwala na wykrycie:

- mozaikowość niewielkiego stopnia
- mutacje punktowe
- zrównoważone rearanżacje chromosomowe
- niezrównoważone rearanżacje chromosomowe w regionach
zawierających sekwencje repetetywne (centromery, telomery, duplikacje
segmentowe, krótkie ramiona chromosomów akrocentrycznych)

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Podstawy aCGH
Porównanie „normalnej” próbki z nieznaną próbką

Próbka referencyjna Próbka badana

Dobrze udokumentowany skład Nieznany skład genetyczny
genetyczny

Dwa różnie wyznakowane DNA (referencyjne i badane), kohybrydyzują do

mikromacierzy, która pokryta jest sondami oligonukleotydowymi odpowiadającymi
całemu genomowi.

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

Agilent Confidential – Internal Use Only For EU Region
12
 Podstawy aCGH
Porównanie „normalnej” próbki z nieznaną próbką

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

Agilent Confidential – Internal Use Only For EU Region
13
Budowa mikromacierzy

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Typowa analiza aCGH
Próbka Izolacja Fragmentacja Znakowanie
DNA DNA

Hybrydyzacja Skanowanie Analiza Danych

Agilent Confidential – Internal Use Only For

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej EU Region
15
 Metodyka

1 pomiar stężenia 2 pomiar stężenia DNA 3 przygotowanie próbek

i ocena jakości DNA – referencyjnego zawierających 500ng
Nanodrop i badanego – Qubit DNA w objętości 20ul

4 5 znakowanie DNA: 6 oczyszczenie

fragmentacja gDNA badane – cyjanina 5
znakowanego DNA
referencyjne – cyjanina 3

7 określenie wydajności 8 mieszanie DNA 9

(Yield) znakowanego badanego i DNA Nałożenie próbki
DNA – nanodrop referencyjnego na macierz

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

1 2

3 4 5

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 10 Hybrydyzacja i płukanie macierzy

1 2

3
4

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 11 skanowanie
macierzy

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Analiza

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Prawidłowy wynik
Chromosom 2

Sondy odpowiadające chromosomom 2

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej Agilent Confidential – Internal Use Only For
EU Region
21
 Duplikacja

Agilent Confidential – Internal Use Only For

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej EU Region
22
 Delecja

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej Agilent Confidential – Internal Use Only For
EU Region
23
 Analiza

Nie analizuje się zmian gdy odbiega tylko 1 sonda – powinno się analizować min 3,
najlepiej gdy 5 sonda (jedna za drugą) wykazuje tę samą tendencję.

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Analiza
Równocześnie badamy profil na wszystkich
chromosomach – w jednym eksperymencie
jesteśmy w stanie przebadać cały genom z wysoką
rozdzielczością.

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej

 Wynik graficzny aCGH to seria punktów, reprezentujących
lokalizację na chromosomie (OY) i zlogarytmowaną
średnią różnicę pomiędzy fluorescencją od tej samej sondy
u pacjenta i kontroli (oś OX, tzw log ratio). Jeśli jest taka
sama fluorescencja od obu sond, to ich ratio wynosi 1.
Log2(1)=0. Więc środek skali jest ustawiony na 0.
Znaczące odstępstwa od tej krotności, np. 1/2 fluorescencji
albo 2-krotność (a raczej półtorakrotność) – o ile
powtarzają się dla wielu kolejnych sond, oznaczają że
mamy tam zmianę liczby kopii.

Nazwa jednostki (zmiana w opcji Nagłówek i stopka)

https://molekularnie.wordpress.com/2020/11/26/zrozumiec-arreje-o-acgh/
Obraz chromosomu 15 z mikrodelecją w q13.2 i prawdopodobnie z jakimś
polimorfizmem w q26.3. Należałoby się przyjrzeć bliżej patrząc w softwarze
na geny które się tam znajdują. Zwróćcie uwagę, że niektóre sondy są poza
skalą – o ile są pojedyncze, to artefakty.

Samym obrazem tego typu za wiele nie zdziałamy. Musimy mieć oczywiście
wstępne rozpoznanie i dostęp poprzez software do bazy danych,
w przypadku małych zmian i zmian nieswoistych szczególnie, by móc
określić czy CNV może być zgodny z fenotypem pacjenta, a nie jest to jakaś
zmiana przypadkowa albo polimorficzna.

https://molekularnie.wordpress.com/2020/11/26/zrozumiec-arreje-o-acgh/
 W czym tkwi problem, jeśli ktoś jest
niewprawiony w analizie aCGH?

Otóż są 2 kontrole do wyboru – męska

i żeńska. A sekwencja Y jest trochę
podobna do X… Jeśli zhybrydyzujemy
pacjenta płci przeciwnej do kontroli,
a do tego na domiar złego mamy
aneuploidie gonosomów – dostajemy
nie do końca intuicyjny obraz zmian
liczby kopii X i Y.
Oczywiście z punktu widzenia
poprawności analizy nie ma znaczenia
jaką płeć kontroli wybierzemy. Większe
znaczenie ma dobór kontroli pod
populację pacjenta, bo jeśli wybierzemy
kontrolę afrykańską dla Europejczyka to
dostaniemy pełno zmian populacyjnych
CNV, które potem trzeba odciąć… ale to
tak na marginesie.
https://molekularnie.wordpress.com/2020/11/26/zrozumiec-arreje-o-acgh/
 Na tym przykładzie kontrola jest męska.
Wobec tego mamy z owej kontroli
fluorescencję pochodzącą od jednego
chromosomu X. U kobiety albo chorego
z z. Klinefeltera są 2 chromosomy X, więc
sygnał jest 2 x wyższy – ratio 2/1.
Stąd cały X mamy na wyniku oflagowany
jako zduplikowany (z wyjątkiem delecji na
1 kopii X, akurat tu taka się trafiła dodatkowo.
W tym wydeletowanym fragmencie
fluorescencja sond u pacjenta i kontroli jest
taka sama i ten fragment jest „na zerze”.
Z kolei Y jest z grubsza na zerze, ale niecały –
na samej górze i na samym dole jest trochę
sygnałów o wysokiej fluorescencji, ponieważ
na Y są regiony pseudoautosomalne, na tyle
podobne do X, że w ogóle na macierzy nie
ma dla nich osobnych sond. Program do
interpretacji obrazu wyciąga ten sam sygnał,
który naniósł już na chromosom X.
https://molekularnie.wordpress.com/2020/11/26/zrozumiec-arreje-o-acgh/
Gdyby kontrola była żeńska z kolei, chromosom X
u tego pacjenta wyglądałby tak:
Zastosowanie aCGH

Dzięki wyższej wydajności diagnostycznej, zwiększonej rozdzielczości i większej czułości aCGH jest
doskonałą metodą analizy, zwłaszcza w porównaniu z tradycyjnym kariotypowaniem lub FISH.

Mikromacierze genomowe stosowane do oceny liczby kopii DNA są zalecane jako testy
pierwszego stopnia do oceny postnatalnej osób z niepełnosprawnością intelektualną,
zaburzeniami ze spektrum autyzmu i/lub mnogimi wadami wrodzonymi.

For In Vitro Diagnostic Use Available only in

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej EU
 Zastosowanie aCGH
Konstytucyjne aberracje chromosomowe vs. zmiany chromosomowe w nowotworach.

Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Medycznej