Exp1.

胺基酸的定性測定
生二乙 生化實驗
第九組
杜紫瑄
40843234S
一、目的：
利用各類型試劑與胺基酸中特定官能基的化學反應，觀察呈色變化而鑑別基本胺基酸性質
和蛋白質。

二、原理：
1.二氫印三醐測試（Ninhydrin test）(Triketohydrindene Test)
A）此項測試可以測出具有 α-amino group 和 α-carboxyl group 的氨基酸或蛋白質。
根據胺基連結在羧酸中碳原子的位置，可分為 α、β、γ……等等的胺基酸。生物學上
的胺基酸，通常指 α 胺基酸。而 α-amino group 和 α-carboxyl group 代表的意義是
這兩主官能基都位於同一個碳上。

B）α-amino group 和 α-carboxyl group 會和經 ninhydrin（C9H6O4）反應之後

（ninhydrin:氧化劑），形成 hydridantin ，隨後 ninhydrin 和 hydridantin 會形成藍
紫色或者是紫紅色的沉澱(diketohydrindylide-diketo hydrindamine)

反應方程式：

C）呈色現象
 會出現呈色反應的：
-有 α-amino group 和 α-carboxyl group 的胺基酸或蛋白質
-胺醣類(amino sugar)
-碳酸銨 (NH4)2CO3)
 不會呈色反應的：
-脯基酸 ( proline ) 因為不具有α-amino group，對此反應不能顯色。

D）定量蛋白質
＊本實驗中會產生的NH３，會使產物顏色加深，即顏色受到pH值的影響
＊反應在pH 5至7之間進行，在鹼性溶液中易褪色
＊用此實驗定量蛋白質方法：
1.實驗中產生的二氧化碳可以定量α-胺基酸。
2.用反應所產生的藍紫色複合物來定量
3.柱層色層分析
2.薑黃蛋白測試(Xanthoproteic test)
A）具有芳香環的胺基酸（tyrosine、salicylic acid、phenylalanine）和濃硝酸反應
後，芬香族苯環的部分會進行硝化作用，而產生黃色硝基苯衍生物。
反應方程式：

B）呈色現象
 會出現呈色反應：
1.具有芳香環的胺基酸：酪胺酸(tyrosine)、色胺酸(tryptophan)
2.含有苯環的芳香族化合物：柳酸(salicylic acid)、酚
 不會出現呈色反應：
1. 苯丙胺酸 ( phenylalanine ) 不會反應，必需加入硫酸，才能出現橙色。
(成功率低，濃度極濃才可成功)

3.米倫測試（Millon test）：
A)水銀與硝酸之混合液對含羥苯 hydroxyphenyl 官能基的酪胺酸(tyrosine)產生錯合
物，而造成粉紅色或紅色沉澱。
*本實驗僅對酪胺酸(tyrosine)有反應

B)注意事項
此反應必須在酸性反應中進行，在鹼性反應或在含氯離子溶液中易造成黃黑色氫氧化汞而
沉澱。
原因：
millon 試劑的主要成分為： Hg22+、Hg2+、HNO3、HNO2
反應中 Hg2+離子需於酸性條件下可會以離子的存在而具有反應力，因為鹼性溶液中 Hg2+會
以 Hg2(OH)2 及 Hg(OH)2 存在，且加熱後形成氧化物如 Hg2O 及 HgO 而失去功能。
Hg2(OH)2 ：Hg2O(黑色沉澱)＋H2O ； Hg(OH)2 ： HgO(黃色沉澱)＋H2O
C）呈色現象
 會出現呈色反應：
1.蛋白質、proteose、peptone、乾酪胺酸、α-naphthol
2.酚、柳酸、苯酚也會起類似反應而干擾實驗
 不會出現呈色反應：
1.Gelatin 和 protamine (不含酪胺酸所以無反應)

4.乙醛酸測試（Hopkins-Cole test )(Glyoxylic acid test）：

A）可以鑑定帶 indole 官能基的色胺酸(tryptophan)
草酸與鎂金屬反應之後做成的 Hopkins-Cole 試劑，會與色胺酸(tryptophan)
產生一紫色環狀物浮現於濃硫酸上，換句話說，indole 衍生物的 indole 環在 H2SO4 或 HCl
存在時，會與各種芳香性醛類試劑(Mg-glyoxylate 及 CHO-COOH)作用產生紫色環狀物。
＊常用的醛類：CHO-COOH 或 HCHO 或 p-dimethylamino benzaldehyde

反應方程式：

 會出現呈色反應：
-Tryptophan
 不會出現呈色反應：
-不含色酸胺的 gelatin

5. Sakaguchi 測試（Sakaguchi test）：

A）鑑定有胍基 guanidine 官能基的精胺酸 (arginine)
精胺酸(arginine)的 guanidine 官能基在過氧化鹵劑(溴水、NaOBr、NaOCl)下，會與 α-
naphthol 反應，產生紅色物質。
*本實驗對精胺酸(arginine)和 guanidine group 化合物具有專一性
  會出現呈色反應：
精胺酸(arginine)、glycocyamine、Methyl guanidine、Creatine、Urea
＊NH4+、histidine、tryptophan 可阻斷或改變呈色反應

三、器材和藥品
1. Ninhydrin 試劑〔0.2 % ( w/v )，置於棕色瓶中，有毒要小心〕。
2. 薑黃蛋白試劑：6 N 濃硝酸。
3. 濃氨水
4. Millon 試劑 (廢液桶)
5. Hopkins-Cole 試劑 ( 1 % Mg 及 2.5 % 草酸在醋酸之混合液 )
6. Sakaguchi 試劑〔包括 0.02 %α-naphthol , 10 % NaOH 及 NaOCl ( 漂白水)〕
7. 試樣 ( 共八種；Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr , Phe 及 BSA 各 1% 以及一次水 )
8. Conc. H2SO4
9. 長玻璃管、沸水浴槽、滴管

四、藥性
試劑 配置 特性 注意事項

Ninhydrin 0.2％Ninhydrin 溶於 95％的酒 被廣泛用於檢測氨、一級 要至於棕色瓶中，有毒要小心

精溶液中 和二級胺，尤其是胺基
酸。茚三酮與它們反應時
產生深藍色或紫色，稱為
羅 曼 紫 （ Ruhemann's
purple）。法醫學上這個反
應被用於鑑定指紋。
薑黃蛋白 6N 濃硝酸 硝酸對苯環發生硝化作 濃硝酸滴到皮膚上，過一段時間皮
用，生成黃色的芳香硝基 膚就會發黃，數天後死皮褪去
化合物，使蛋白質發生變
性。
Millon 在 60 毫升濃硝酸（比重 1.42） 米倫試劑含有硝酸，如加 蛋白質溶液中如含有大量無機鹽，
中溶解 40 克汞（水浴加溫可助 入量過多，能使蛋白質呈 可與汞產生沉澱從而喪失試劑的作
溶） ，溶解後加入兩倍體積的蒸 黃色，加入量不超過試液 用，如此試劑不能測定尿中的蛋白
餾水稀釋，靜置澄清後，取它 體積的 1/5～1/4 質。另外試液中還不能含有 H2O2、
上層的清液備用。 醇或鹼，因它們能使試劑中的汞變
成氧化汞沉澱。遇鹼必須先中和，
 但不能用鹽酸中和。實驗時再抽風
櫥中進行
Hopkins-Cole 1 % Mg 及 2.5 % 草酸在醋酸之 用於檢測的存在的色氨酸 調製溶液加入草酸時，反應進行很
混合液 中的蛋白質。蛋白質溶液 快，會放出大量氣體和熱產生，因
與 Hopkins Cole 試劑 混 此進行時要至於流水中或是冰浴冷
合，後者由乙醛酸組成。 卻
緩慢加入濃硫酸以形成兩
層。

Sakaguchi 試 0.02 %α-naphthol , 10 % 含有精胺酸等胍基的蛋白 本實驗中所產生的強烈紅色，出現

劑 NaOH 及 NaOCl ( 漂白水) 質溶液中，加入次氯酸鈉 後會很快消退，但可加入尿素以破
及 α-萘酚，會在 NaOH 溶 壞過量的氧化劑使顏色穩定。
液中產生紅色的產物。

短 中文 羧基解 胺基解離
縮寫 全名 結構 支鏈 分子量
寫 譯名 離常數 常數

R Arg Arginine 精胺酸 鹼性 174.20 1.82 8.99

G Gly Glycine 甘胺酸 親水性 75.07 2.35 9.78

P Pro Proline 脯胺酸 疏水性 115.13 1.95 10.64

W Trp Tryptophan 色胺酸 疏水性 204.23 2.46 9.41

Y Tyr Tyrosine 酪胺酸 親水性 181.19 2.20 9.21

苯丙胺
F Phe Phenylalanine 疏水性 165.19 2.20 9.31
酸
五、實驗步驟和注意事項

(一) 二氫印三醐測試：
1. 取 1 ml 試樣加入五滴 ninhydrin 試劑。
2. 置入熱水浴,煮沸 3 至 4 分鐘 ( 須用長玻璃試管 )。
3. 觀察顏色之變化。
4. 加入數滴NaOH，觀察顏色之變化。
＊實驗條件在微酸或中性溶液中進行，避免鹼性溶液中發生褪色

(二) 薑黃蛋白測試：
1. 取 0.5 ml試樣加入 0.5 ml 濃硝酸，觀察變化。
2. 置入熱水浴，煮沸 1 至 2 分鐘 ( 須用長玻璃試管 )。
3. 觀察顏色之變化。
4. 冷卻之後，加入濃氨水，觀察顏色之變化。
(三) 米倫測試：
1. 取 1 ml 試樣加入 2 滴 Millon 試劑。
2. 再置入熱水浴，煮沸 1 至 2 分鐘 ( 須用長玻璃試管 )。
3. 觀察顏色之變化。
＊若加入過多Millon 試劑則顏色會消失
＊需在酸性條件下才具有反應力

(四) 乙醛酸測試：
1. 取 0.5 ml 試樣加入1.5 ml Hopkins-Cole 試劑
2. 慢慢沿管壁加入 1.5 ml 濃硫酸，觀察界面顏色之變化。
＊過程中不可震動混合
 (五) Sakaguchi 測試：
1. 取 1 ml試樣加入 0.5 ml NaOH (10 %) 及 0.5 ml α-naphthol。
2. 靜置 3 分鐘後，加入兩滴 NaOCl 溶液 ( 不可加太多 )。
3. 觀察顏色之變化。

六、預期結果

試劑/試樣 Arg Gly Pro Trp Tyr Phe BSA dH2O

Ninhydrin + + - + + + + -
test

Xanthoproteic - - - + + - + -
test

Millon - - - - + - + -
test

Hopkins- - - - + - - + -
Cole test

Sakaguchi + - - - - - + -
test
參考資料：
1. Ninhydrin test, retrieved from ‘https://byjus.com/chemistry/ninhydrin-
test/’

2. Gaurab kauki. April 23,2018. Xanthoproteic test: Objective, Principle,

Reagents, Procedure and Result-Online Biology Notes, retrieved from
‘https://www.onlinebiologynotes.com/xanthoproteic-test-objective-
principle-reagents-procedure-and-result/’

3. Anup Basnet. April 5,2020. Hopkins-Cole test (Adamkiewicz–Hopkins’

test): Principle, Reaction, Reagents, Procedure and Result
Interpretation-Biocheminfo， retrieved from
‘http://biocheminfo.com/2020/04/05/hopkins-cole-test-adamkiewicz-
hopkins-test-principle-reaction-reagents-procedure-and-result-
interpretation/’

4. Anup Basnet. April 15,2020.Sakaguchi Test: Principle, Reaction,

Reagents, Procedure and Result Interpretation-Biocheminfo, retrieved
from ‘http://biocheminfo.com/2020/04/15/sakaguchi-test-principle-
reaction-reagents-procedure-and-result-interpretation/’