1.

Wstęp teoretyczny

Sterylizacja (wyjaławianie)- proces polegający na całkowitym zniszczeniu wszystkich mikroorganizmów (form

wegetatywnych i przetrwanych) w dowolnym materiale lub środowisku. Sterylizację można przeprowadzić stosując
działanie temperatury, filtrację, promieniowanie lub metody chemiczne.

Sposoby sterylizacji

Metody fizyczne
Zastosowanie temperatury:
1) Sterylizacja w autoklawie (sterylizacja pod zwiększonym ciśnieniem w parze nasyconej)-najbardziej użyteczny sposób
sterylizacji. Proces przeprowadza się w autoklawie- pojemniku, który umożliwia osiągnięcie temperatury powyżej punktu
wrzenia wody pod ciśnieniem atmosferycznym. Sterylizowany materiał poddawany jest działaniu pary wodnej w
temperaturze 121°C, ciśnieniu 1,5 atm przez 15-20 minut. Czas trwania sterylizacji zależy również od stopnia skażenia. Im
większa liczba termoopornych przetrwalników tym wymagany jest dłuższy czas sterylizacji. Metoda ta jest szybka i
niezawodna, a jej podstawową zaletą jest fakt, że jednorazowa sterylizacja zapewnia zabicie zarówno form
wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych drobnoustrojów. Oprócz podłoży można w nim również sterylizować przedmioty,
które w wyższej temperaturze (zastosowanej np. w suszarce) mogą ulec zniszczeniu.

2) Tyndalizacja (sterylizacja etapowa)- pasteryzacja przeprowadzona trzykrotnie w odstępach 24- godzinnych. Polega na
ogrzewaniu podłoży i roztworów przez trzy dni w temperaturze 100°C przez 30 minut i pozostawieniu ich w temperaturze
pokojowej w okresach pomiędzy ogrzewaniami tak, aby mogło nastąpić kiełkowanie przetrwalników, a powstałe w ten
sposób formy wegetatywne mogły być uśmiercone przy kolejnym podniesieniu temperatury do 100°C. Trzecia sterylizacja
zapewnia pełną jałowość podłoża. Proces przeprowadza się w aparacie Kocha i pozwala na zniszczenie form
wegetatywnych (1 dzień) oraz przetrwalnikowych drobnoustrojów.

3) Sterylizacja sucha („suchym gorącem”) - wyjaławianie ciepłem suchym w ciśnieniu atmosferycznym, przeprowadzane
w suszarkach elektrycznych lub suchych sterylizatorach. Pozwala na wyjaławianie przedmiotów szklanych lub
metalowych, tj. szkło laboratoryjne, które nie mogą być sterylizowane w autoklawie, w którym para wodna może
powodować trawienie szkła i pozostawia je wilgotne. Zwykle stosuje się ogrzewanie w temperaturze 160°C przez 2
godziny, lub 180°C przez 30 minut dla materiałów odpornych na wysokie temperatury. Proces ten pozwala na zniszczenie
bakteryjnych spor.

4) Wyżarzanie w płomieniu- pozwala na natychmiastowe zniszczenie drobnoustrojów. Opalanie nad płomieniem palnika
stosuje się do jałowienia drobnych przedmiotów, nieulegających spaleniu, tj. ezy mikrobiologiczne, drobny metalowy
sprzęt, a opalanie brzegów kolb i probówek pozwala na zabezpieczenie hodowli przed zakażeniem z zewnątrz.

Metody chemiczne

Sterylizacja tlenkiem etylenu- metoda ta pozwala na zniszczenie form wegetatywnych i przetrwalnikowych, poprzez
kowalencyjne związanie się tlenku etylenu do białek komórkowych, skuteczność procesu jest możliwa tylko w obecności
wody (5-15%), stosowana do sterylizacji żywności, lekarstw, instrumentów i aparatów wrażliwych na wysoką temperaturę
(jednorazowe, plastikowe szalki Petriego, strzykawki, szwy chirurgiczne, cewniki).

Metody mechaniczne

Zastosowanie filtrów- polega na mechanicznym oddzieleniu drobnoustrojów od płynu. Metoda ta wykorzystywana jest do
wyjaławiania roztworów zawierających związki wrażliwe na działanie czynników fizycznych, np. witaminy, aminokwasy czy
cukry.
a) Filtry porcelanowe (Chamberlanda, Berkefelda) - wysoka sprawność działania, skuteczne usunięcie form
wegetatywnych i przetrwanych, z wyjątkiem wirusów.
b) Filtry ze szkła spiekanego (np. Schotta) – lejek z warstwą filtracyjną na dnie, zatrzymuje wszystkie formy
drobnoustrojów, za wyjątkiem wirusów.
c) Filtry azbestowe (np. Seitza) – pozwala na zatrzymanie na powierzchni filtra bakterii, bakteriofagów i większych
wirusów.
d) Filtry (sączki) membranowe – najbardziej przydatne i popularne są membrany nitrocelulozowe, poliwęglanowe lub
zinnych materiałów wytwarzane o różnej średnicy porów, co pozwala na oddzielanie mikroorganizmów o różnym
rozmiarze i kształcie. Z reguły do sterylizacji wykorzystuje się membrany o średnicy porów 0.22 µm, co pozwala na
zatrzymanie na ich powierzchni nawet niewielkich cząsteczek wirusa. Możliwość przyłączenia jednokierunkowych filtrów
membranowych do strzykawki, pozwala na szybką sterylizację roztworów, które nie wytrzymałyby sterylizacji cieplnej.

Sterylizacja promieniowaniem

a) Promieniowanie ultrafioletowe- posiada największe zastosowanie w praktyce laboratoryjnej do eliminacji

drobnoustrojów obecnych na powierzchniach i w powietrzu. Większość lamp UV wytwarza promieniowanie w zakresie
długości fal ok. 260 nm, które jest wybiórczo absorbowane przez kwasy nukleinowe, w wyniku czego działa zabójczo na
bakterie poddane dłuższej ekspozycji. Promieniowanie UV nie przenika przez szkło, wodę i inne substancje, dlatego
stosowane jest do wyjaławiania powietrza w zamkniętych pomieszczeniach, np. komorach laminarnych, salach
operacyjnych, pokojach rozlewów leków.

b) Promieniowanie jonizujące (sterylizacja radiacyjna) -źródłem tego promieniowania mogą być izotopy emitujące
promieniowanie gamma, np. izotopy kobaltu 60Co, stosowane do wyjaławiania materiałów wrażliwych na wysoką
temperaturę, np. wyrobów medycznych jednorazowego użytku, produktów leczniczych, kosmetyków, materiałów
transplantacyjnych.

Dezynfekcja (odkażanie) – zniszczenie, hamowanie lub usunięcie drobnoustrojów za pomocą środków chemicznych i
fizycznych. Celem dezynfekcji jest szybkie zabicie możliwie jak największej liczby mikroorganizmów chorobotwórczych z
powierzchni sprzętów, podłóg, naczyń i ciała ludzkiego. Środki dezynfekcyjne działają na formy wegetatywne, natomiast
nie powodują zniszczenia form zarodnikowych. Dezynfekcji poddawane są obiekty, których nie można poddać sterylizacji,
dlatego też każda sterylizacja jest równocześnie dezynfekcją, ale nie każda dezynfekcja jest równocześnie sterylizacją.
Sposób działania środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju zastosowanego dezynfektanta.

Metody chemiczne:
- kwasy i zasady (mleko wapienne, gorące roztwory węglanu wapnia);
-środki utleniające (podchloryny, chloraminy nieorganiczne i organiczne, nadmanganian potasu, woda utleniona, jodyna);
- związki organiczne (wodne roztwory alkoholi, związki fenolowe i ich pochodne, aldehydy).

Podłoża mikrobiologiczne.

Podłoża mikrobiologiczne - preparaty odżywcze stosowane do hodowania mikroorganizmów, które są mieszaniną różnych
związków odżywczych. W laboratorium wykorzystywane są trzy rodzaje podłóż:
• podłoża płynne - służą do namnażania dużej liczby mikroorganizmów w badaniach fermentacyjnych i testów
biochemicznych np. bulion wołowy;
• podłoża półpłynne- zawiera 0,3-0,5% substancji żelującej, służą do obserwacji ruchliwości bakterii i promowania
wzrostu beztlenowego;
• podłoża stałe – zawiera 1,5- 2% substancji żelującej, służą do obserwacji powierzchniowego wzrostu mikroorganizmów
w celu określenia wyglądu kolonii, izolacji czystych kultur oraz ich przechowywania, np. agar odżywczy.

Do zestalania różnych typów podłoży wykorzystywany jest agar-agar (substancja żelująca).

Agar- silnie rozgałęziony, złożony wielocukier otrzymywany z krasnorostów zawierający galaktozę, wykorzystywany w
praktyce laboratoryjnej, jako czynnik zestalający do podłoży mikrobiologicznych, ze względu na brak zdolności bakterii do
jego rozkładania. Agar rozpuszcza się w wodzie w temperaturze 100°C, a krzepnie po ostudzeniu do 45°C lub niższej.

Bulion odżywczy- podstawowe podłoże pełne, stosowane powszechnie w badaniach bakteriologicznych. Jest to wyciąg z
mięsa wołowego (woda mięsna) wzbogacony dodatkiem 1% peptonu (źródło łatwo dostępnego azotu) i 0,5% NaCl
(środowisko izotoniczne), pH 7,4.

Agar odżywczy- otrzymywany poprzez dodanie 1,5-2% agar-agaru do bulionu odżywczego.

Cechy pożywek mikrobiologicznych:

- zawierają łatwo dostępne źródła węgla i energii (organizmy heterotroficzne wykorzystują organiczne związki węgla,
autotroficzne- dwutlenek węgla);
- zawierają łatwo dostępne źródło azotu- organizmy heterotroficzne wykorzystują organiczne związki
azotu (aminokwasy, pepton) lub nieorganiczne związki (sole amonowe, azotany);
- podłoża syntetyczne muszą zawierać zestaw mikroelementów (fosfor, siarka, magnez);
- wykazują odpowiedni dla danej grupy odczyn (wartość pH);
- zapewniają izotoniczność środowiska (identyczne ciśnienie osmotyczne).

Podział pożywek mikrobiologicznych:

1) ze względu na pochodzenie:

a) syntetyczne (zdefiniowane) - znany skład ilościowy i jakościowy;

b) półsyntetyczne – znany jest skład tylko związków nieorganicznych;
c) naturalne – wykonywane z surowców pochodzenia naturalnego, ich skład jakościowy i ilościowy jest znany tylko
w przybliżeniu, np. mleko, jaja, krew.

2) ze względu na ilość i jakość składników odżywczych:

a) proste (podstawowe) - podłoża pozwalające na wzrost mikroorganizmów o niskich wymaganiach odżywczych,

wykorzystywane do utrzymywania hodowli podstawowej kontrolowanych szczepów bakterii, np. agar odżywczy,
bulion odżywczy;

b) wzbogacone – składają się z pożywki prostej i dodanego czynnika wzbogacającego

(krew, surowica, witaminy), na takich pożywkach wzrasta większość bakterii Chorobotwórczych;

c) wybiórczo- namnażające (selekcyjne) - pożywki o takim składzie, na których rosną tylko wybrane, poszukiwane
przez nas drobnoustroje, przez co możliwa jest ich łatwa izolacja i identyfikacja;

d) wybiórczo-różnicujące (elekcyjne) – wykorzystywane do różnicowania poszczególnych gatunków bakterii na

drodze biochemicznej, w wyniku zastosowania indykatorów, barwników lub innych substancji pozwalających na
rozróżnienie mikroorganizmów

e) specjalne – wykorzystywane do hodowli bakterii, które posiadają specjalne wymagania odżywcze, w swoim
składzie zawierają, np. surowice, witaminy, itp.

Obliczanie stężenia agaru

Przygotuj pożywke stałą. W tym celu sporządź 150 ml bulionu ze stężeniem agaru 2%. (bulion spożywczy 15g na 1000ml)

15g-1000ml
Xagar
x -150ml 152,25
∗ 100% = 2%

X= 2,25g Xagar=3,045g

:Techniki posiewów

1. Wstęp teoretyczny

Posiew ezą

Przykładem posiewu, w którym wykorzystywana jest eza jest posiew redukcyjny, której autorem jest Robert Koch. Jest to
bardzo popularna metoda ze względu na możliwość wykorzystania szerokiej gamy mikroorganizmów. Polega na
rozprowadzeniu materiału z wykorzystaniem ezy po powierzchni płytki z podłożem agarowym. Liczba drobnoustrojów
przenoszonych na kolejne sektory płytki staje się coraz mniejsza, dlatego w ostatnim etapie posiewu znajdą się
pojedyncze komórki, które zaczną się dzielić, tworząc odrębną kolonię. Poprawnie wykonany posiew redukcyjny daje
możliwość pozyskania czystego szczepu

Posiew głaszczką
Posiew głaszczką jest wykorzystywany m.in. w metodzie szeregu rozcieńczeń, której autorem jest angielski chirurg Józef
Lister. Stosuje się ją w celu dokładnego określenia ilości bakterii w materiale wyjściowym w myśl prawa, które mówi, że z
jednej bakterii w roztworze wyjściowym powstaje na drodze podziałów jedna kolonia. Podczas przygotowywania
materiału do posiewu rozcieńcza się go kilkakrotnie, a z kilku ostatnich probówek, zazwyczaj dwóch lub trzech, wykonuje
posiew głaszczką (patrz -> „ćw. 3.5 Posiew głaszczką”). Istnieje prosty wzór umożliwiający określenie ilości
mikroorganizmów:

W mikrobiologii stosuje się różne metody posiewów w zależności od konsystencji podłoża oraz celu oznaczenia. Należą do
nich:
• posiew do pożywki płynnej
- z użyciem ezy (posiew namnażający; pętelka ezy styka się z podłożem)
- z użyciem pipety (badania ilościowe; pipeta nie styka się z podłożem)

• posiew do podłoża zestalonego w probówkach

- metodą kłutą (posiew stosowany; wykorzystanie igły bakteriologicznej)
- na skos (metoda powierzchniowa, wykorzystanie ezy)

• posiew do agarowego podłoża upłynnionego (metoda wstrząsana; posiew z wykorzystaniem pipety; służy do badania
właściwości gazotwórczych oraz do oznaczania laseczek Clostridium)

• posiew do płytek Petriego

- metoda izolacyjna (stosowana w celu izolacji materiału oraz pozyskania pojedynczych kolonii; polega na wylaniu
upłynnionego podłoża na sterylną płytkę, zestaleniu podłoża oraz wykonaniu posiewu na cztery takty z wykorzystaniem
ezy, czyli posiewu redukcyjnego),
- wgłębna (stosowana w celu oznaczenia liczby drobnoustrojów; polega na wykonaniu posiewu 1 ml materiału do
sterylnej płytki i zalaniu upłynnionym podłożem agarowym o temperaturze ok. 50 ˚C w celu wymieszania całości),
- powierzchniowa (stosowana w celu oznaczenia liczby drobnoustrojów oraz określenia morfologii; polega na wylaniu
upłynnionego podłoża do sterylnej płytki, zestaleniu, posiewie 100 µl materiału za pomocą pipety, a następnie jego
wtarciu z w podłoże z wykorzystaniem głaszczki)

Izolacja czystych kultur bakterii

Hodowla drobnoustrojów, zwana kulturą, to zespół mikroorganizmów, które żyją w tym samym środowisku. W
laboratorium taką kulturą są osobniki, które posiadają zdolność do wzrostu na jednym podłożu. Istnieją dwa rodzaje
takich hodowli:
• czysta - stanowiąca zespół osobników jednakowego gatunku, potomstwo wyizolowanej bakterii;
• mieszana - w składzie której wyróżnia się kilka gatunków.

Izolacja czystych kultur

Prowadząc badania mikrobiologiczne konieczne jest posługiwanie się czystymi kulturami bakterii. Czysta kultura to nic
innego jak potomstwo pojedynczej komórki, czyli klona. Różne klony należące do tego samego gatunku nazywane są
szczepami. Izolacje czystych kultur przeprowadza się zgodnie z zasadami sterylnej pracy, zazwyczaj na stałym podłożu. Na
początku należy wyodrębnić pojedynczą komórkę od reszty populacji. Konkretną kolonię trzeba zawiesić w odpowiednim
roztworze, a następnie dzięki wielokrotnie powtórzonej metodzie redukcyjnej można otrzymać czystą kulturę.

Metody izolacji czystych kultur dzieli się na bezpośrednie oraz pośrednie. Metoda bezpośrednia polega na pobraniu
pojedynczej komórki mikroorganizmu (np. z wykorzystaniem mikromanipulatora) i przeniesieniu do sterylnego podłoża
płynnego. Metoda pośrednia polega na izolacji pojedynczej kolonii na stałym podłożu. Pojedyncze kolonie uzyskuje się
stosując jedną z trzech metod:
• posiew na całej powierzchni (A),
• posiew sektorowo- redukcyjny (B),
• metoda płytek lanych (C)- z wykonanego szeregu rozcieńczeń należy wykonać posiew badanego materiału techniką
wgłębną.

Wzrost bakterii

Bakterie namnażają się przez podział, dzięki czemu dochodzi do powstania dwóch komórek potomnych. Ilość komórek
wzrasta wraz z upływem czasu pewną ilość razy, która jest określana przez stały czynnik. Nazywa się to wzrostem
logarytmicznym. Przyjmując, że w jednostce objętości hodowli okresowej znajduje się N0 komórek, można obliczyć, że po
n podziałach otrzymamy N komórek. Będzie to równe N0 ∙ 2n. Po zlogarytmowaniu i przeliczeniu na liczbę podziałów
otrzymujemy:

Bakterie znajdujące się w pożywce płynnej, które są następnie inkubowane w odpowiednich warunkach będą dzieliły się
do czasu, gdy przynajmniej jeden z niezbędnych składników zostanie wyczerpany. Staje się on wtedy czynnikiem
limitującym dalszy wzrost bakterii. Jeśli w ciągu tego czasu nie zostaną usunięte szkodliwe czynniki, ani nie będą
dodawane wymagane składniki odżywcze, powstanie układ zamknięty zwany hodowlą okresową.

Wzrost hodowli bakteryjnej można zobrazować za pomocą wykresu zależności logarytmu liczby komórek lub liczby
żywych komórek od czasu. Taka krzywa wzrostu o kształcie sigmoidalnym jest podzielona na fazy wzrostu:

• faza zastoju- czas od chwili zaszczepienia do ustalenia maksymalnej szybkości podziałów. Jej całkowity czas trwania
zależy przede wszystkim od składu pożywki, rodzaju hodowli oraz jej wieku. Jeśli skład innego podłoża różni się od
poprzedniego, adaptacja do zaistniałych warunków wymaga produkcji nowych enzymów, która jest indukowana przez
obecność nowych substratów. Przykładem takiego zjawiska może być diauksja- wzrost dwufazowy na podłożach z większą
ilością substratów;

• faza logarytmiczna (wykładnicza)- czas generacji jest stały dla danego gatunku i warunków hodowli bakterii. Wiele
bakterii w tej fazie posiada również stałą zawartość białek oraz wielkość komórek. Taka hodowla jest nazywana hodowlą
zawierającą komórki standardowe. W hodowlach okresowych podłoże stale się zmienia, dlatego zmianie ulega rozmiar
komórki oraz jej skład. Wzrasta stężenie komórek, a maleje stężenie substratu, co powoduje gromadzenie końcowych
produktów metabolizmu. Mimo wszystko jest to najwłaściwsza faza do pomiaru szybkości wzrostu, ponieważ sam czas
generacji jest stosunkowo niezmienny. Poszukiwanie odpowiednich warunków hodowli, takich jak pH, temperatura,
rodzaj substratu, itp. Przeprowadza się z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych, dzięki czemu można dokonać
pomiaru liczby komórek, czy zmętnienia;

• faza stacjonarna- następuje w momencie, gdy komórki nie są już zdolne do reprodukcji. Szybkość wzrostu hodowli spada
nawet przed wyczerpaniem substratu, dlatego przejście z fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest stopniowe. Czynniki
takie jak duża gęstość populacji, ograniczenie ilości substratu i nagromadzenie produktów metabolizmu mogą
powodować zainicjowanie tej fazy. Jest ona głównym etapem produkcji wtórnych metabolitów (ważne np. przy produkcji
penicyliny). Wydajnością zależącą od typu substratów i warunków hodowli nazywa się masę bakteryjną, która została
wytworzona w momencie osiągnięcia fazy stacjonarnej;

• faza zamierania- liza komórek (autoliza) spowodowana wydzielaniem enzymów komórkowych

Prócz hodowli okresowej, jaką stosuje się na zajęciach laboratoryjnych, istnieje również hodowla ciągła. Hodowla ciągła
jest rozpatrywana jako układ otwarty, który osiągnął stan równowagi. Wartość czasu została tu pominięta, a warunki
hodowli są stałe, co jest łatwe do zautomatyzowania. Przeciwnie, hodowla okresowa jest układem zamkniętym,
składającym się z czterech faz. Warunki w takiej hodowli są praktycznie cały czas inne, dlatego niemożliwe jest tutaj
zastosowanie automatyzacji.

Mikroorganizmy rosną w podłożu płynnym na różne sposoby, co służy ich identyfikacji. Wyróżnia się:

• wzrost na powierzchni podłoża- zazwyczaj w postaci kożucha lub błony (mikroorganizmy tlenowe),
• wzrost na dnie podłoża
 ✓ w postaci osadu (agregaty mikroorganizmów, które są po podziale)
✓ wzrost dyfuzyjny w dolnej części podłoża (urzęsione mikroorganizmy, które żyją w warunkach niewielkiej
dostępności tlenowej),

• wzrost dyfuzyjny- następuje w całej objętości podłoża (względne beztlenowce, mikroorganizmy urzęsione).

Jedną z metod pomiaru natężenia światła przechodzącego przez roztwór koloidalny lub zawiesinę jest metoda
turbidymetryczna.

Metoda turbidymetryczna pozwala na pomiary ilościowe przez:

• porównanie turbidancji roztworu badanego oraz wzorca w tych samych warunkach,
• zastosowanie krzywej wzorcowej.

Turbidymetryczna metoda spektrofotometryczna jest wykorzystywana w chemii analitycznej. Polega ona na pomiarze
relacji między ilością światła emitowanego przez próbkę, a ilością światła docierającego do detektora po przejściu przez
kuwetę. Zależy ona przede wszystkim od ilości materiału powodującego dyspersję. Z racji tego, że jest to metoda mało
precyzyjna, służy przede wszystkim do analizy ilości biomasy mikroorganizmów.

Wyniki mierzone spektrofotometrycznie określa wielkość zwana absorbancją lub ekstynkcją. Jest ona równa logarytmowi
dziesiętnemu stosunku intensywności światła po przejściu do intensywności światła padającego na substancję.

Tween 80- monooleinian polioksyetylenosorbitolu, niejonowy detergent będący czynnikiem dezintegrującym. Żółta, lepka
ciecz służąca również jako emulgator. Ten dodatek spożywczy jest oznaczany jako E433 i jest wykorzystywany w
przemyśle cukierniczym, mleczarskim, w substytutach mleka i śmietany, lodach, zemulgowanych sosach, gumach do
żucia. Liczba 80 w nazwie nie jest przypadkowa i oznacza grupę lipofilową (kwas oleinowy). Zmniejsza napięcie
powierzchniowe. Po jego dodaniu mikroorganizm nie rośnie w postaci kłaczków, lecz jest zauważalny jako zmętnienie.
Na czym polegają różnice zachowania się bakterii w reakcji barwienia metodą Grama?
Przypomnij sobie budowę ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych.

G(+) kompleks z kilku podjednostek aminokwasu.

Peptydoglikan który mówi ze mamy fragment peptydowy i jakiś polisacharyd. Białka występują tylko u niektórych bakteri
G+ - straptococcus. Glikan -polisacharyd składający się z dwóch typów podjednostek monomerycznych ułożonych
naprzemiennie. Podstawa budowy jest jednostka glukozy beta (w zależności od ułożenia grupy hydroksylowej w
cząsteczce) wiązanie betaglikozydowe jest ważne w cząsteczce , (wiązanie alfaglikolizydowe jest hydrolizowane przez
większość organizmów) . Mamy dwa monomery , mamy tam jednostkę beta glukozy, acetyloaminowy oraz w kwasie
mamy wolna gr karboksylowa i ona jest ważna bo może wejść w reakcje z aminokwasami. Jednostki sa ułożone
naprzemiennie i wiązania między nimi to sa 1,4 betaglikozydowe . To wiązanie jest oporne na hydrolizę, tylko niektóre
organizmy moga hydrolizowac. Ważna jest również gr hydroksylowa w kwasie bo to będzie miejsce przyłączenia kwasów
tejchowych . Mamy jeszcze grupę karboksylowa która wchodzi w wiązanie z aminokwasami co powoduje ze do tej
struktury może być przylaczony krótki łańcuch peptydowy. Kwas może być podjednostka modyfikowana przez truktury
przyłączane opisane wyżej.
 W G- to oprocz tego ze wystepuje błona
cytoplazmatyczna i peptydoglikan to jeszcze wystepuje błona zewnętrzna. Struktura jest bardziej złożona niż u G+. W tej
zewnętrznej błonie wyst związki jak na slajdzie np. poryny-transporter komórek gdzie kanał jest otwarty i decyduje
wielkość cząsteczki i jej ładunek. Pod spodem wyst mukokompleks , miejsca adhezji i przestrzeń peryplazmatyczna (gdzie
ulokowany jest cienki peptydoglikan). Występują białka transportujące. Na zewnątrz ściany moga oczywiście wyst otoczki
czy śluzy. Lipopolisacharyd jest bardzo ważny poniewaz jego budowa chemiczna tworzy profil antygenowy komórek
bakteryjnych G(-). Na końcu struktury mamy specyficzny układ liposacharydow charakterystycznych dla danej komórki
polisacharydow. Dlatego mówi się ze te łańcuchy boczne to jest ospecyficzny łańcuch boczny. Jest on jego integralna
częścią. Lipopolisacharyd także jest klasyfikowany u bakterii patogennych G- jako endotoksyny bakteryjna ( czynnik
wywołujący różne choroby) . W budowie mamy doczynienia z dwiema podjednostkami cukru które będą połączone z
kwasami tłuszczowymi i te kwasy tłuszczowe wraz z ta podjednostka glukozoaminy kotwiczy cały lipopolisacharyd w
błonie cytoplazmatycznej i ten element to jest tzw lipid A. Lipid A jest także struktura charakterystyczna dla komórek
bakteryjnych. Trzeba zwrócić uwagę ze to nie jest typowa budowa fosfolipidu poniewaz w typowej wyst glicerol . Do tego
przyłączone sa kolejne cukry wyjaśnione na slajdzie. Cześć rdzeniowa może być taka sama u różnych bakterii natomiast
końcowy fragment czterocukrowy jest charakterystyczny dla profilu antygenowego.

W przypadku hydrolizy peptydoglikanu bakteri G+ cała ściana komórkowa jest praktycznie zhydrolizowana i pozostaje
tylko protoplast. W przypadku bakteri G- lizozym nie dociera do wszystkich wiązań betaglikozydowych wyst w
peptydoglikanie i przez to powstaje sferoplast zawierający resztki ściany komórkowej charakterystycznej dla danej
komórki moga być uznane za markery i usuwamy je używając EDTA

Barwienie Grama- barwienie różnicujące . W pierwszym etapie wybarwiane jest i G+ i G- , potem dodajemy odczynnik
chemiczny który utrwala barwienie czyli płyn lugola, kolejnym elementem jest spłukanie tych barwników i otrzymujemy
efekt taki ze G+ sa zabarwione a G- nie sa zabarwione ( wynika to z tego ze membrana zewnętrzna blokuje przedostanie
się barwnika do struktury peptydoglikanu i w momencie przemywania barwnik schodzi wraz z ta błona zewnętrzna i
dopiero wtedy zostaje wyeksponowany peptydoglikan który możemy dobarwic kolejnym barwnikiem) ten kolejny barwnik
to może być toksyna i wtedy możemy rozróżnić bakterie. Stare hodowle moga barwić się inaczej poniewaz bakterie
degenerują , sa tez bakterie które wgl się nie barwią, kolejne dają niejednoznaczne wyniki .

Bakterie:

E. coli Gram (-)

B. subtilis Gram (+)
Pseudomonas fluorescens Gram (-)
M. luteus Gram(+)

Przeliczanie bakterii

L= V * 10-x * y
V-objętość, x-rozcieńczenie, y-liczba kolonii.
Podłoża mikrobiologiczne
Zadanie 1. Podłoża stałe o różnej zawartości czynnika zestalającego
Podłoże półpłynne do badania ruchliwości mikroorganizmów

Materiały: na parę dwie probówki zawierające 20 cm3 rozgrzanego agaru odżywczego zawierającego standardową (1,5%)
oraz obniżoną (0,3%) ilość czynnika zestalającego. Proponowane szczepy: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Serratia
marcescens, P. fluorescens
Wykonanie: Zawartość probówek należy umieścić w sterylnych szalkach Petriego i pozostawić do zastygnięcia. Przed
rozlaniem pożywek na spodniej stronie szalek należy wykreślić markerem cztery sektory (szalek zawierających podłoże
półpłynne nie wolno odwracać). W centrum każdego sektora należy nanieść na zestaloną pożywkę 10 µL zawiesiny
komórek mikroorganizmu w płynie fizjologicznym powstałej z rozcieńczenia otrzymanych hodowli płynnych o rząd 103 w
probówkach Eppendorfa. Szalki odłożyć do inkubacji nie odwracając. Opracowanie wyników: Po okresie inkubacji określić,
który mikroorganizm wykazuje wzrost mgławicowy. Porównać obszary wzrostu mikroorganizmów.

Wyniki: Bacilius wzrost mgławicowy.

Zadanie 2. Podłoża pełne niezdefiniowane o różnej zawartości substancji odżywczych.

Test jakościowy żyzności pożywek

Materiały: Na parę dwie szalki Petriego zawierające zestalony bulion odżywczy o standardowej i zredukowanej ilości
składników odżywczych (przygotowany przez dziesięciokrotne rozcieńczenie bulionu płynem fizjologicznym i zestalenie
1,5% agaragarem). Szczepy: Dla pary studentów po jednej probówce hodowli Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens.
Wykonanie: Przygotować rozcieńczenia hodowli o rząd 106 w płynie fizjologicznym w probówkach Eppendorfa. Ezą
wykreślić posiewy w postaci równoległych linii na powierzchni pożywek. Odłożyć do inkubacji.
Opracowanie wyników: Ocenić jakość wzrostu mikroorganizmów w posiewie rysowym: 0 punktów – brak wzrostu na całej
długości linii, 1 punkt – słaby wzrost na danej linii, 2 punkty – dobry wzrost na danej linii.
Wyniki: Na pożywce z bulionem o zredukowanej ilości składników odżywczych żadna kolonia z bakterii się nie pojawiła.
Na pożywcze o standardowym bulionie pojawiła się tylko jedna kolonia na linii z bakteriami Serratia marcescens .

Zadanie 3. Podłoża zdefiniowane i niezdefiniowane (zwykłe i wzbogacone)

Zastosowanie zdefiniowanego podłoża mineralnego do badania zdolności mikroorganizmów do wykorzystywania
cytrynianu jako jedynego źródła węgla i energii dla wzrostu.

Materiały (para studentów): szalki z hodowlą Escherichia coli i Serratia marcenscens. Umieścić po 2 cm3 płynnych hodowli
bakterii w sterylnych probówkach wirówkowych; wirować przez 5 minut przy 6000 obr/min; zlać płyn znad osadów, a
osady zawiesić w 2 cm3 soli fizjologicznej.
Bulion odżywczy oraz płynne podłoże mineralne Daviesa-Mingioli pozbawione źródła węgla. Sterylne 20% roztwory
glukozy oraz cytrynianu sodowego.

Wykonanie: Przygotować 5 sterylnych probówek do hodowli mikroorganizmów. W probówkach umieścić po 5 cm3

następujących wariantów pożywek :
A: Bulion odżywczy
B: Bulion odżywczy zawierający 0,5% cytrynian sodowy
C: Podłoże mineralne pozbawione źródła węgla
D: Podłoże mineralne zawierające 0,5% cytrynian sodowy
E: Podłoże mineralne zawierające 0,5% glukozę

Wariant 1: Podłoża należy zaszczepić 0,1 cm3 zawiesiny jednego szczepu mikroorganizmu w płynie fizjologicznym. Po
okresie inkubacji zawartość probówek wstrząsnąć i porównać intensywność wzrostu. W tym wariancie połowa grupy
pracuje z E. coli, połowa z S. marcescens.

Wariant 2 (wymaga posiewów na płytki po okresie wzrostu): Podłoża w probówkach A-E zaszczepić 0,1 cm3 mieszaniny
szczepów (1:1) Escherichia coli i Serratia marcescens w płynie fizjologicznym. Po okresie inkubacji zawartość probówek
wstrząsnąć i porównać intensywność wzrostu. Wykonać posiewy redukcyjne na szalki z agarem odżywczym z próbówek D
oraz E, odłożyć do inkubacji. Po okresie wzrostu zidentyfikować mikroorganizmy na podstawie barwy kolonii.

Pożywka Davies-Mingioli bez źródła węgla (L):

K2HPO4 .......................7.0 g
KH2PO4 .......................3.0 g
MgSO4 . 7H2O .................0.1 g
(NH4)2SO4.....................1.0 g
Pożywka pełna zawiera dodatkowo 2,5g glukozy (co daje stężenie 0,25%)

Obliczenia na 5ml 5% roztwory w probówce mając do dyspozycji 20% roztwory glukozy i cytrynianu:
20% 5000𝜇l
= 40 , = 125μl
0,5% 40
 Wymagania odżywcze drobnoustrojów
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z wymaganiami odżywczymi mikroorganizmów oraz poznanie metod badania
drobnoustrojów biorących udział w przemianach wybranych makromolekuł w środowisku naturalnym.

Zadanie 1. Wykazanie zdolności amylolitycznych i proteolitycznych bakterii glebowych

a/ Przygotowanie próbek gleby

Przygotować zawiesinę mikroorganizmów glebowych, rozcieńczając próbki wyjściowe w zakresie 10-1 do 10-5 . W tym
celu należy odważyć 10 g gleby i zawiesić ją w 90 cm3 sterylnej wody wodociągowej, wytrząsać na wytrząsarce przez 15
minut, celem wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby (jest to rozcieńczenie 10-1 ). Kolejne dziesięciokrotne
rozcieńczenie należy przygotować w sterylnej probówce Eppendorfa przenosząc 0,1 cm3 rozcieńczenia 10-1 do 0,9 cm3
sterylnej wody wodociągowej (jest to rozcieńczenie 10-2 ). Postępując w ten sposób należy przygotować rozcieńczenia 10-
3 , 10-4 i 10-5 . Do izolacji bakterii wykorzystać rozcieńczenie 10-5 .

b/ Oznaczenie bakterii hydrolizujących skrobię (amylolitycznych)

Oznaczenie wykonać metodą płytkową stosując posiew powierzchniowy (głaszczką szklaną) na podłoże agarowe z
dodatkiem skrobi (wykorzystać przygotowane w zadaniu 1a rozcieńczenie 10-5 ). Po 5-6 dniowej inkubacji w
temperaturze pokojowej powierzchnię podłoża zalać płynem Lugola, a następnie policzyć kolonie, wokół których
wystąpiła strefa przejaśnienia, świadcząca o zajściu procesu hydrolizy. Wynik oznaczenia podać jako liczbę bakterii
hydrolizujących skrobię w przeliczeniu na 1 g gleby. Wyjaśnić zasadę oznaczania amylolitycznych zdolności bakterii
(powstawania przejaśnień wokół kolonii) wiedząc, że skrobia z płynem Lugola tworzy kompleks barwiący się na niebiesko.

Próba jodowa – w analizie chemicznej jest to sposób określenia zawartości skrobi w badanej cieczy. Wykorzystuje się w
tym celu jodynę lub płyn Lugola, które zabarwiają się pod wpływem dodania do nich skrobi. Pomiędzy obecnymi w płynie
Lugola cząsteczkami jodu i anionami polijodkowymi a przestrzenną strukturą zbudowanego z cząsteczek D-glukozy
łańcucha amylozy jako składowej skrobi tworzą się przebarwienia[1]. W zależności od długości łańcucha cukrowego w
skrobi barwa ta może być od ciemnogranatowej poprzez niebieską do czerwonawej.
Drobnoustroje wytwarzające enzymy amylolityczne mają zdolność degradowania skrobi do dekstryn, maltozy
i glukozy. Obecność wydzielonych substancji sprawdza się w reakcji z płynem Lugola (tj. roztwór jodu w jodku
potasu). Amylozy i amylopektyny będące składnikami skrobi ulegają reakcji z jodem, w wyniku czego pojawia się
odpowiednio niebieskie i fioletowo-czerwone zabarwienie

c/ Oznaczenie bakterii hydrolizujących białko (proteolitycznych)

Oznaczenie wykonać metodą płytkową stosując posiew powierzchniowy (głaszczką szklaną) na podłoże agarowe tzw. agar
mleczny (zawierający kazeinę). Wykorzystać przygotowane w zadaniu 1a rozcieńczenie 10-5 . Po 5-6 dniowej inkubacji w
temperaturze pokojowej powierzchnię podłoża zalać roztworem kwasu TCA (kwas trichlorooctowy), a następnie policzyć
kolonie, wokół których wystąpiła strefa przejaśnienia, świadcząca o zajściu procesu hydrolizy. Wynik oznaczenia podać
jako liczbę ww. bakterii w przeliczeniu na 1 g gleby. Wyjaśnić zasadę oznaczania zdolności proteolitycznych bakterii
(powstawania przejaśnień) wiedząc, że kwas TCA denaturuje białko.
Bakterie posiadają zdolność proteolityczną, czyli rozkładają białka , peptydy czy aminokwasy . Podczas
dodawania TCA powstają przejaśnienia gdzie są białka gdyż TCA denaturuje białko. Czyli jeżeli nasze bakterie nie
mają zdolności proteolitycznych to w obrębie ich będą przejaśnienia spowodowane denaturacją białka przez TCA.
Zadanie 4. Oznaczanie amonifikacyjnych zdolności bakterii

Amonifikacja to proces rozkładu azotowych substancji organicznych (np. białek) pod wpływem metabolizmu
drobnoustrojów, podczas którego wydziela się amoniak (NH3). Rozkład białek następuje dwuetapowo: a/ najpierw
cząsteczka białka pod wpływem peptydaz ulega hydrolizie na wolne aminokwasy; b/ na powstałe aminokwasy działają
deaminazy, powodując odłączenie od nich grupy aminowej i powstanie amoniaku. Amonifikacja jest jednym z etapów
obiegu azotu w przyrodzie.

Wykonanie:
a/ Do sterylnej probówki wlać 5cm3 1% wody peptonowej i wsiać 50µl zawiesiny badanego szczepu bakterii. Inkubować
przez 7 dni w temperaturze pokojowej.
c/ Po czasie inkubacji oznaczyć pH podłoża (stwierdzenie wzrostu pH oznacza jego alkalizację związaną z obecnością
amoniaku).
Wynik: Mocno zielone zabarwienie
d/ Obecność amoniaku potwierdzić za pomocą odczynnika Nesslera. Doświadczenie przeprowadzić na płytce z
wgłębieniem. O obecności amoniaku świadczy pomarańczowe (brązowe) zabarwienie hodowli w kontakcie z w/w
odczynnikiem. Które z badanych bakterii wykazują zdolność amonifikacji białek?
Wynik: Pomarańczowe zabarwienie

Utlenianie amoniaku do azotynów przez bakterie z rodzaju Nitrosomonas

Zadanie 5. Badanie zdolności hydrolizowania żelatyny (wykrywanie obecności żelatynazy)

a/ Do probówki wlać 10 cm3 rozgrzanego podłoża zawierającego żelatynę. Po ostudzeniu podłoża do temperatury ok.
370C- 400C zaszczepić przygotowane podłoże 100µl zawiesiny badanego mikroorganizmu. Inkubować przez 7 dni w
temperaturze pokojowej.
b/ Po czasie inkubacji zaobserwować wzrost bakterii (opisać charakter), następnie probówki umieścić w lodówce na 30-40
minut. Wyjąć probówki i zaobserwować „upłynnienie” żelatyny. Porównać próby z kontrolą (zastosować probówkę z
podłożem bez bakterii).
Wyniki: E.coli nie hydrolizują żelatyny gdyż żelatyna była w formie stałej.

Zagadnienia do przygotowania

1)Co oznacza pojęcie mutanty auksotroficzne? Co to są bakterie prototroficzne?

Auksotrofy – organizmy żywe, pozbawione zdolności syntezy określonych, niezbędnych do ich wzrostu, skomplikowanych
związków organicznych, takich jak witaminy, zasady purynowe czy aminokwasy. Organizm auksotroficzny musi pobierać
ten związek z otoczenia, jako składnik swojego pożywienia. Przeciwieństwem auksotrofów są prototrofy. Auksotroficzne
szczepy mikroorganizmów mogą powstawać ze szczepów prototroficznych w wyniku mutacji, np. delecji genu szlaku
biosyntezy aminokwasu. Takie szczepy są często celowo generowane metodami inżynierii genetycznej i wykorzystywane
w badaniach naukowych.

Prototrofy – organizmy heterotroficzne, wymagające do wzrostu oprócz substancji mineralnych tylko jednego
organicznego źródła węgla.
2)Jakimi cechami muszą charakteryzować się pożywki mikrobiologiczne?

Wyżej wymienione

3)Na czym polega mutagenne działanie światła UV? Jakie znasz inne czynniki mutagenne?
Najaktywniejszymi czynnikami fizycznymi które prowadzą do powstania mutacji indukowanych są: promieniowanie
ultrafioletowe, elektromagnetyczne oraz różnego rodzaju promieniowanie jonizujące (promieniowanie X, γ, α
czy β). Promieniowanie UV wnikając w głąb tkanki ulega rozproszeniu na napotkanych atomach, wywołując w nich stan
wzbudzenia poprzez wybijanie elektronów z zewnętrznych orbit do poziomów o wyższej energii. Pod wpływem promieni
UV tworzą się dimery, które zaburzają strukturę DNA, uniemożliwiając prawidłowy przebieg replikacji. Efektem działania
promieniowania jonizującego są zmiany w sekwencji DNA i aberracje chromosomowe, np. promienie X wycinając
nukleotydy pirymidynowe powodują rozerwanie cząsteczki DNA. Częstość mutacji, będących skutkiem
napromieniowania, zależy od dawki oraz od czasu działania promieniowania na komórki. Ponadto komórki intensywnie
dzielące się, są bardziej podatne na mutagenne działanie promieniowania jonizującego niż komórki nie ulegające
podziałom.

4) Mikroorganizmy i chemizm (rozkładu) wykorzystania przez bakterie węglowodanów i białek jako czynników
wzrostowych.

5)Mikroorganizmy i chemizm przemian związków azotu w przyrodzie (proteoliza, amonifikacja, nitryfikacja, denitryfikacja)

Amonifikacja – jest to powstawanie amoniaku (NH3) i jonów amonowych (NH4+) w procesie rozkładu przez drobnoustroje
związków organicznych zawierających azot. Związki te to przede wszystkim białka, mocznik, kwasy moczowe oraz kwasy
nukleinowe pochodzące ze szczątków roślinnych i zwierzęcych oraz z odchodów zwierząt. Całość procesu rozkładu
związków organicznych zawierających azot do formy amonowej nosi nazwę mineralizacji.

Nitryfikacja – przekształcenie amoniaku (NH3) lub jonu amonowego (NH4+) do jonu azotanwego (NO3-) przez bakterie
nitryfikacyjne. Proces ten przebiega dwustopniowo. W pierwszej kolejności występujące w glebie bakterie z rodzaju
Nitrosomonas i Nitrococcus przekształcają amoniak w jon azotynowy (NO2-). Następnie azotyn jest utleniany do azotanu
przez bakterie glebowe Nitrobacter.

Denitryfikacja – redukcja jonów azotanowych (NO3-) do wolnego azotu (N2) który zostaje uwolniony do atmosfery w
postaci gazowej. Proces ten przeprowadzany jest przez bakterie denitryfikacyjne, które należą do anaerobów, czyli są
beztlenowcami. W związku z tym żyją miejscach niedostępnych dla wolnego tlenu np. w głębokich warstwach gleby bądź
w wodach gruntowych. Analogicznym procesem, również przeprowadzanym przez bakterie, jest proces anammox.
Prowadzi do bezpośredniego utleniania nadmiernych jonów amonowych do azotu gazowego.

Proteoliza – hydrolityczny rozkład wiązania peptydowego za pomocą proteaz. Prowadzi do rozkładu białek na peptydy i
aminokwasy. Proteoliza jest procesem składowym trawienia oraz procesów rozpadu (degradacji) szkodliwych białek w
komórce

6)Wiązanie azotu w warunkach tlenowych i beztlenowych.

Amonifikacja może zachodzić zarówno w warunkach tlenowych jak i bez udziały tlenu (beztlenowo). Odbywa się w
środowisku o odczynie alkalicznym i kwaśnym oraz w różnych temperaturach i wilgotnościach. Jest to spowodowane
dużym zróżnicowaniem mikroorganizmów przeprowadzających ten proces. Mimo możliwości przeprowadzenia procesu,
środowisko w jakim się odbywa proces wpływa na jego intensywność. W środowisku kwaśnym amonifikacja przebiega
szybciej i produkowane jest więcej jonów amonowych. Wpływ na intensywność mają również warunki atmosferyczne,
właściwości gleby, wilgotność oraz pora roku. Amonifikacja jest jednym z etapów cyklu azotowego czyli obiegu azotu w
przyrodzie.
Denitryfikacja- głównie beztlenowe
Badanie wpływu antybiotyków na mikroorganizmy- część 1

1)Przygotowanie turbidymetrycznego standardu McFarland 0,5 służącego do sporządzania zawiesin mikroorganizmów o

przybliżonej zawartości komórek w jednostce objętości.

Absorbancja prawidłowo przygotowanego standardu McFarland 0,5 mierzona przy długości fali 600nm mieści się w
przedziale 0,08 do 0,1. Większość metod oznaczania wrażliwości mikroorganizmów wymaga posługiwania się zawiesinami
komórek o gęstości optycznej zbliżonej do tego standardu. Zawiesiny takie przygotowuje się w płynie fizjologicznym lub
doskonale klarownych pożywkach przez wizualne lub fotometryczne porównanie zmętnienia.

2) Określenie liczności zawiesin komórek szczepów dostosowanych do standardu McFarland 0,5.

Przyjmuje się, że zawiesiny większości mikroorganizmów dostosowane do standardu McFarland 0,5 zawierają 1-2 x 108
komórek/ mL. Jaką liczność miały przygotowane samodzielnie zawiesiny?

3) Metoda jakościowa określania wrażliwości antybiotykowej drobnoustroju – metoda Kirby-Bauer (dyfuzyjno-krążkowa)

4) Metoda dyfuzyjno-rozcieńczeniowa określania wrażliwości antybiotykowej drobnoustroju – zastosowanie pasków E-

test zawierających gradient stężenia antybiotyku do wyznaczania przybliżonej wartości MIC.

Minimal inhibitory concentration (MIC) – minimalne stężenie hamujące – najniższe stężenie terapeutyku wyrażone w
µg/mL całkowicie hamujące wzrost danego szczepu mikroorganizmu