TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÍ NGHIỆM VI SINH

BIÊN SOẠN: BÙI ANH VÕ

TP. HỒ CHÍ MINH THÁNG 1 NĂM 2019

(LƯU HÀNH NỘI BỘ)

1
NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC............................................... 2
Bài 1. NHỮNG DỤNG CỤ, THIẾT BỊ CƠ BẢN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI
SINH VẬT ....................................................................................................................... 4
Bài 2 NUÔI CẤY VI SINH VẬT .......................................................................... 22
Bài 3 QUAN SÁT NẤM MỐC ............................................................................. 32
Bài 4 QUAN SÁT NẤM MEN ................................................................................ 37
Bài 5 QUAN SÁT VI KHUẨN ................................................................................. 41
Bài 6 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT.................................................. 50
Bài 7 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT .................................... 53
Bài 8 SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN ...................................................... 58
Bài 9 BIẾN DƯỠNG Ở VI SINH VẬT .................................................................. 60
Bài 10 ĐỊNH DANH VI KHUẨN ............................................................................ 64
Bài 11 BẢO QUẢN VI SINH VẬT. ....................................................................... 68

CÁCH ĐÁNH GIÁ

Điểm quá trình: 50%
Thi cuối kỳ: 50%

2
 NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước vô cùng nhỏ bé mà mắt thường không
nhìn thấy được. Bên cạnh các giống loài có ích cho cuộc sống của con người, còn có
những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Chính
vì thế người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh phải tuân thủ các qui tắc
cơ bản sau đây:
1. Phải đọc kỹ bài và làm quen với các qui tắc và phương pháp có liên quan đến
bài thí nghiệm, nhằm sử dụng thời gian một cách có hiệu quả đồng thời giảm
thiểu các rủi ro có thể xảy ra trong quá trình làm thí nghiệm.
2. Không ăn uống, hút thuốc, nói chuyện ồn ào trong khi làm thí nghiệm.
3. Phải luôn mặc áo Blouse trong phòng thí nghiệm, tuyệt đối không để môi
trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, giấy tờ, dụng cụ cá nhân.
Đồng thời phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc
nhuộm.
4. Chỉ đem những đồ vật cho phép vào phòng thí nghiệm như tài liệu hướng dẫn
thực hành, sổ sách ghi chép và các vật dụng thí nghiệm khác.
5. Trước khi bắt đầu làm thí nghiệm, phải sát trùng tay và mặt bàn làm thí nghiệm
bằng các hóa chất sát trùng đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh. Lặp
lại công việc này sau khi hoàn tất thí nghiệm.
6. Tất cả các hóa chất, vật liệu, môi trường làm thí nghiệm ngoài việc ghi tên của
chúng còn phải ghi tên người hoặc nhóm làm thí nghiệm, tên lớp, ngày làm thí
nghiệm để tránh nhầm lẫn khi sử dụng hoặc vứt bỏ.
7. Phải hết sức cẩn thận để không làm đổ vỡ dụng cụ.
8. Tuyệt đối phải nghe theo sự hướng dẫn của giảng viên, cán bộ phụ trách phòng
thí nghiệm.
9. Không được đốt đèn cồn khi không sử dụng. Thao tác cẩn thận để không làm
bỏng tay và gây hỏa hoạn.
10. Các vật liệu, dụng cụ, môi trường đã nuôi cấy vi sinh vật hoặc nhiễm bẩn cần
phải để đúng nơi qui định để được khử trùng để vứt bỏ hoặc tái sử dụng.
11. Khi kết thúc thí nghiệm, cần phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã qua sử dụng
theo đúng qui trình và phải sắp xếp chúng vào đúng nơi qui định.
12. Trong khi làm thí nghiệm, khi gặp sự cố phải báo cáo ngay cho cán bộ hoặc
giảng viên hướng dẫn để có biện pháp xử lý kịp thời.

3
Bài 1. NHỮNG DỤNG CỤ, THIẾT BỊ CƠ BẢN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY VI SINH VẬT

A. Các dụng cụ và thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh vật.
I. Dụng cụ.
1. Ống nghiệm: Được dùng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, thường có
nút bằng bông không thấm nước hay bằng nhựa.
2. Đĩa petri: Gồm một nắp lớn và một đáy nắp nhỏ úp lồng vào nhau đường kính
8cm, 10cm, 12cm…thường được sử dụng để chứa môi trường thạch nuôi cấy vi
sinh vật, nghiên cứu các đặc điểm hình thái tế bào hay khuẩn lạc vi sinh vật.
3. Pipet: Có nhiều loại như pipet có vạch chia độ, pipet Pasteur, pipet tự động
được sử dụng để lấy chính xác một chất lỏng nào đó.
4. Que cấy:
- Que cấy thẳng: Dùng cấy sâu hay trích ly vi sinh vật trên môi trường đặc.
- Que cấy vòng: Dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật
trong môi trường lỏng hay môi trường đặc.
- Que cấy móc: Dùng cấy các loại nấm mốc, xạ khuẩn.
Những loại que cấy trên thường làm bằng kim loại không bị oxy hóa ở nhiệt độ
cao (thường bằng Platin hay Niken).
- Que trang: Để trang đều vi sinh vật lên mặt thạch nhằm phân lập vi sinh vật, gạt
các tế bào vi sinh vật riêng rẽ ra.
II. Một số dụng cụ, thiết bị khác.
1. Cân kỹ thuật: Dùng để cân hóa chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
2. Bếp điện: Dùng để đun nóng và chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
3. Tủ lạnh: Để bảo quản vi sinh vật, hóa chất và môi trường.
4. Tủ cấy vô trùng: Có không gian vô trùng được sử dụng để cấy vi sinh vật nhờ
hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng.
5. Tủ ấm: Có chế độ nhiệt ổn định được sử dụng để ủ vi sinh vật ở nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trưởng của từng nhóm vi sinh vật.
6. Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất
cao, được sử dụng để hấp khử trùng môi trường và các dụng cụ thí nghiệm.
7. Tủ sấy: Được sử dụng để sấy khô hay khử trùng các dụng cụ thí nghiệm.
8. Nồi chưng cách thủy hoặc microwave: Được sử dụng để đun chảy thạch.

4
 9. Máy đo pH: Được sử dụng để xác định độ pH của dung dịch hay môi trường
nuôi cấy vi sinh vật.
10. Kính hiển vi: Được dùng để quan sát tế bào vi sinh vật.
III. Kính hiển vi.
Kính hiển vi là một loại dụng cụ quang học dùng để quan sát các vật thể rất nhỏ,
các vi sinh vật, tế bào động, thực vật v.v… nhờ vào khả năng phóng đại của chúng.
Việc lựa chọn loại kính hiển vi để nghiên cứu tùy thuộc vào mục đích của từng nghiên
cứu. Tuy vậy, kính hiển vi quang học nền sáng là loại kính được sử dụng phổ biến và
dễ sử dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản.
Kính hiển vi quang học nền sáng được sử dụng để quan sát các đặc điểm hình
thái, cấu tạo, sinh lý nói chung của tế bào vi sinh, độ phóng đại có thể đến 1000 lần.
Loại kính này không sử dụng để quan sát các mẫu vật có kích thước nhỏ hơn 0,2 m.

1. Nguyên tắc.
Với kính hiển vi quang học, vật kính thu ảnh thực của vật quan sát, thị kính cho ta thấy
ảnh thực đó.
Thị kính thường có độ phóng đại : 10X
- Với vật kính 10X ta có ảnh được phóng đại: 1010 = 100 lần.
- Với vật kính 40X ta có ảnh được phóng đại: 4010 = 100 lần.
- Với vật kính 100X ta có ảnh được phóng đại: 10010 = 1000 lần.

2. Cấu tạo.
Kính hiển vi quang học gồm hai phần: Phần cơ học và phần quang học.
a. Bộ phận cơ học: Gồm chân kính, bàn kính và ống kính.
- Chân kính là chỗ dựa chủ yếu cho nhiều bộ phận khác như bàn kính, ống kính
và trục mang ống kính.
- Bàn kính có thể chuyển động theo mặt phẳng ngang nhờ hai ốc vặn vận chuyển
bàn kính ở hai bên. Trên bàn kính có hai kẹp giữ tiêu bản và di chuyển nó theo
hai chiều vuông góc nhau. Dưới bàn kính có một giá giữ bộ tụ quang.
- Ống kính là hai ống tròn (kính hai mắt) có thể di động theo hướng điều chỉnh
của người sử dụng. Phía trên cùng ống kính có lắp một thị kính. Ống kính có
khả năng di chuyển lên xuống nhờ các ốc điều chỉnh theo hai hướng ngược
nhau: ốc chỉnh thô hay đinh ốc lớn (di chuyển nhanh) để tìm ảnh của vật, còn
ốc chỉnh tinh hay đinh ốc nhỏ (di chuyển chậm) được chỉnh để có ảnh rõ nét có
thể xoay quanh một trục thẳng đứng.
b. Bộ phận quang học: Đây là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi, bao gồm vật
kính, thị kính, kính tụ quang và gương phản chiếu.

5
- Vật kính là bộ phận quang học chủ yếu, gồm nhiều thấu kính ghép lại. Vật kính
tạo ra ảnh thực phóng đại và ngược chiều với vật được quan sát. Kính hiển vi
thông thường có bốn vật kính 4X, 10X, 40X và 100X. Vật kính 100X là vật
kính dầu. Khi quan sát các mẫu vật nhuộm màu với vật kính 100X thì cần
nhúng chìm vật kính vào dầu soi.
- Thị kính lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ 2 thấu kính. Thị kính của kính hiển vi
thường được sử dụng hiện nay có độ phóng đại 10X. Ảnh quan sát được dưới
kính hiển vi quang học là ảnh ảo, ngược chiều với mẫu vật.
- Kính tụ quang nằm dưới bàn kính, có thể di chuyển được nhờ một ốc điều chỉnh
và có tác dụng để tập trung ánh sáng. Bên dưới kính tụ quang là hệ thống chắn
sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng vào.
- Nguồn sáng (dùng đèn) được lắp dưới kính tụ quang, giúp hướng chùm tia sáng
đi vào kính tụ quang. Ánh sáng được điều chỉnh bằng cách nâng hoặc hạ tụ
quang, đóng hoặc mở chắn sáng, tăng hoặc giảm độ sáng của đèn.

Kính hiển vi quang học

6
 Cách cầm nắm để di chuyển kính

Cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật

3. Khảo sát vi sinh vật bằng kính hiển vi.
Trong phần thực tập này, chúng ta sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật trong 2
trường hợp : ở trạng thái sống và ở trạng thái nhuộm màu.
a. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên).
- Nước cất vô trùng 2 ống
- Nước ngâm salad 2 ống
- Kính hiển vi 2 cái
- Que cấy vòng 2 que
- Đèn cồn 2 cái
- Phiến kính 16 cái
- Lá kính 16 cái
- Dầu soi 1 lọ nhỏ
- Tiêu bản Bacillus subtilis (nhuộm đơn) 2 tiêu bản
- Hộp nhựa để đựng các tiêu bản đã xem xong (tiêu bản của sinh viên làm)
7
 b. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống.
+ Nguyên tắc.
Với vi sinh sinh vật sống không được nhuộm màu, rất khó nhìn được rõ ràng.
Muốn thấy rõ ta phải làm cho phần ngoài biên của vi sinh vật được rõ nét bằng
cách hạ tụ quang xuống và khép bớt chắn sáng.
+ Cách sử dụng kính hiển vi.
- Đặt phiến kính có vi sinh vật ở trạng thái sống lên trên bàn kính mang mẫu vật
(đã được đậy bằng lá kính).
- Để vật kính 10X, sử dụng đinh ốc lớn vặn để cho vật kính chỉ còn cách mẫu vật
khoảng 1mm.
- Nhìn vào thị kính, vặn đinh ốc lớn từ từ để hạ bàn kính mang mẫu vật xuống
cho đến lúc nhìn thấy ảnh.
- Quay sang vật kính 40X, sử dụng đinh ốc nhỏ để làm rõ ảnh.
+ Thực hành.
- Dùng que cấy vòng lấy một giọt nước ngâm salad cho lên phiến kính.
- Để một cạnh lá kính lên phiến kính để tạo thành một góc 450 rồi hạ từ từ xuống
giọt nước.
Như vậy vi sinh vật được ép giữa phiến kính và lá kính. Quan sát vi sinh vật
trong giọt nước và vẽ hình.
c. Quan sát vi sinh vật sau khi nhuộm màu.
+ Nguyên tắc: Độ phóng đại chung của kính hiển vi được xác định bởi độ phóng
đại của vật kính nhân với độ phóng đại của thị kính.
Độ rõ của ảnh được quyết định bởi năng suất phân ly của kính hiển vi, năng
suất phân ly bằng nghịch đảo của khoảng cách tối thiểu phân ly giữa hai điểm khi
chúng chưa chập vào nhau. Khoảng cách này phụ thuộc vào chiều dài sóng của ánh
sáng sử dụng để chiếu sáng và số lượng tia sóng đập vào thấu kính của vật kính và
được thể hiện bằng công thức:

S = 1/h h = / 2n sin u
S: Năng suất phân ly.
n: Hệ số khúc xạ.
h: Khoảng cách tối thiểu giữa 2 điểm.
u: Góc mở của tia sáng đi vào vật kính.
: Độ dài sóng của ánh sáng sử dụng.
Năng suất phân ly càng cao khi khoảng cách h càng nhỏ muốn thế ta phải nâng mẫu số
hoặc hạ tử số. Ở đây độ dài sóng ánh sáng và góc mở của tia sáng đi vào vật kính
không đổi, do đó ta phải nâng hệ số khúc xạ (n) lên bằng cách dùng thêm dầu soi.
8
 Vật kính 100X

Thấu kính ngoài của vật kính n= 1.52

Dầu soi n = 1.512

Phiến kính n = 1.52

Bàn mang mẫu vật

không khí n = 1
ánh sáng tới ánh sáng tới
So sánh giữa vật kính khô và vật kính nhúng dầu

Để hình ảnh được phóng đại nhiều ta dùng vật kính 100X
Muốn có thị trường sáng đồng đều ta dùng gương phản chiếu phẳng. Kính tụ
quang rất cần thiết khi sử dụng những vật kính mạnh (100X) do đó phải nâng tụ
quang đến mức tối đa và mở chắn sáng.
+ Cách sử dụng.
- Nhỏ một giọt dầu soi lên tiêu bản.
- Để lên bàn kính.
- Nâng bàn kính lên để vật kính 100X đến sát tiêu bản (vật kính chạm giọt dầu
soi và sát phiến kính).
- Vặn ốc lớn, hạ bàn kính xuống từ từ (rất chậm) đến khi thoáng thấy ảnh thì
dừng lại.
- Điều chỉnh lại bằng đinh ốc nhỏ để thấy rõ nét.
+ Thực hành.
Sinh viên quan sát các tiêu bản được phát sẵn, vẽ hình các vi sinh vật đã quan sát.
4. Bảo quản kính hiển vi.
- Tuyệt đối không được tháo gỡ các vật kính, thị kính.
- Sau khi dùng kính với dầu soi, dùng gòn thấm với xylol lau vật kính 100X sau
đó lau lại bằng gòn khô.
- Đậy kính bằng bao nylon hoặc cho vào hộp đựng kính.

9
 B. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
I. Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy.
1. Xử lý dụng cụ.
a. Nguyên tắc chung.
Các dụng cụ dùng để nuôi cấy phải thật sạch, trung tính và không bị nứt mẻ.
b. Phương pháp xử lý.
Để xử lý dụng cụ, phải tiến hành qua hai giai đoạn:
- Trung tính dụng cụ.
- Rửa dụng cụ
* Trung tính dụng cụ.
- Đổ nước cất vào dụng cụ.
- Hấp dụng cụ ở 1210C trong 15 phút.
- Để nguội, kiểm tra độ pH của nước trong dụng cụ.
- Nếu nước có pH kiềm thì ta ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2%, kiểm ta lại
cho đến khi thấy nước có pH trung tính, rửa nước nhiều lần.
* Phương pháp rửa dụng cụ.
Các dụng cụ thủy tinh thường có hình dáng, kích thước cũng như mục đích sử dụng
khác nhau nên cần có các phương pháp rửa khác nhau.
+ Phiến kính.
Với phiến kính đã dùng làm tiêu bản.
- Chùi sạch mỡ, vaseline hay dầu soi bám trên phiến kính bằng miếng bông tẩm
xylol hay ngâm vào dung dịch sulfocromic trong 48 giờ.
- Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong 1 giờ.
- Rửa nước, để ráo, ngâm tiêu bản vào cồn 900 trong 2 giờ.
- Để ráo, đem sấy khô.
Với phiến kính mới cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính.
Các phiến kính sau khi rửa phải thật sạch và trong.
+ Pipet.
- Dùng que hoặc dây kim loại rút nút bông ở đầu lớn pipet ra.
- Khử trùng ở 1210C trong 30 phút.
- Ngâm vào dung dịch sulfocromic trong 24 giờ
- Rửa bằng xà phòng cho thật sạch.
- Rửa nước, để ráo, sấy khô.

10
+ Các dụng cụ thủy tinh đã dùng nuôi cấy vi sinh vật (ống nghiệm, bình tam giác,
đĩa petri …)
- Hấp 1210C trong 30 phút.
- Lấy ra, đổ các vật phẩm đi.
- Rửa thật sạch bằng xà phòng.
- Để ráo nước, sấy khô.
- Đối với các dụng cụ mới chỉ cần rửa sạch, sấy khô là dùng được.
2. Bao gói dụng cụ.
a. Nguyên tắc.
- Dụng cụ được bao gói phải thật sạch và khô.
- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự
vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
b. Phương pháp bao gói dụng cụ.
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông cho ống nghiệm, bình tam giác, pipet.
- Bao gói cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh.
* Làm nút bông.
+ Với pipet: Dùng một sợi dây kim loại nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet.
+ Với các ống nghiệm:
- Lấy một miếng bông không thấm nước cuộn lại (không lấy quá nhiều).
- Dùng kẹp hay tay ấn vào miệng ống nghiệm.
- Yêu cầu:
 Nút có kích thước và độ chặt vừa phải.
 Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm.
 Lấy nút ra và đóng lại dễ dàng.
+ Với các chai lọ và bình tam giác có kích thước lớn cách làm nút bông cũng tương tự.
* Cách bao gói dụng cụ.
+ Với các dụng cụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phần có nút bông bằng giấy
dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt, đảm bảo điều kiện vô
trùng tốt hơn. Cách làm như sau :
- Cắt các băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần gói.
- Quấn băng giấy quanh đầu có nút bông.
- Xếp gấp phần giấy thừa ở hai bên sát vào dụng cụ cần gói.
- Dùng dây thun buộc lại.
- Yêu cầu: Phần giấy bao ngoài phải chặt và kín.
+ Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri, que gạt phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể
thay giấy bao bằng một hộp nhôm kín đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
11
II. Khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy.
1. Nguyên tắc.
Dụng cụ và môi trường nuôi vi sinh vật sau khi khử trùng cần đảm bảo:
- Sự vô trùng tuyệt đối của vật phẩm và các dụng cụ.
- Không làm thay đổi chất lượng hay làm biến chất mẫu vật.
2. Các phương pháp khử trùng.
Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta thường dùng
nhiệt. Khi khử trùng bằng nhiệt các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu
diệt dễ dàng trong khi đó các bào tử vẫn còn tồn tại ngay nhiệt độ đó. Khả năng chịu
nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:
- Tính chất môi trường.
- Số lượng tế bào vi sinh vật.
- Độ pH của vật khử trùng.
Do đó, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả, cần xác định ngưỡng nhiệt thấp
nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào
tử của chúng. Có thể khử trùng bằng nhiệt khô hay nhiệt ướt.
a. Khử trùng bằng sức nóng khô (nhiệt khô)
Dưới tác dụng của sức nóng khô, các cấu tử của tế bào vi sinh vật bị oxy hóa,
tế bào bị khô và chết. Nhiệt khô thường dùng để khử trùng các dụng cụ bằng kim loại
hay thủy tinh(ống nghiệm, hộp lồng, ống hút …)
+ Khử trùng bằng tủ sấy.
Cách tiến hành như sau:
- Các dụng cụ cần khử trùng được bao gói cẩn thận cho vào tủ sấy.
- Bật công tắc để tủ hoạt động.
- Sấy ở nhiệt độ 1600C trong 2 giờ hay 1800C trong 30 phút.
- Tắt tủ sấy, để nguội tới 600C mới mở tủ lấy dụng cụ ra. Không được mở tủ khi
nhiệt độ đang còn cao bởi vì làm như vậy dụng cụ thủy tinh dễ bị nứt vỡ.
- Dụng cụ sau khi sấy mà giấy gói có màu hơi vàng là đạt yêu cầu.
+ Khử trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa.
Phương pháp này dùng để khử trùng pipet, que cấy, kẹp, kéo, đầu ống nghiệm,
miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra để cấy vi sinh vật.
Cách khử trùng:
- Đối với que cấy, ta hơ trên ngọn lửa đèn cồn, dây cấy phải được nung thật đỏ
hết chiều dài dây cấy.

12
 - Đợi cho que cấy nguội, mới tiến hành thao tác bởi vì que cấy nóng khi lấy vi
sinh vật để cấy sẽ giết chúng. Cũng có thể nhúng que cấy hay các dụng cụ khác
vào cồn 900 rồi đốt nhiều lần để khử trùng.
b. Khử trùng bằng sức nóng ướt (nhiệt ẩm).
Phương pháp này làm nóng nhanh, hơi nóng thấm sâu vào phẩm vật. Vi sinh vật
bị giết chết vì protein bị đông kết.
1 – Phương pháp khử trùng Pasteur .
Phương pháp này dùng để khử trùng các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độ cao
như sữa, kem, thức uống có rượu. Môi trường được đun nóng lên 60 – 750C trong 15
– 30 phút hoặc đun nóng lên 800C trong 10 – 15 phút.
Phương pháp này chỉ có khả năng giết chết vi sinh vật không sinh bào tử.
2 – Hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal)
Phương pháp này dùng để hấp khử trùng một số loại môi trường dễ hư ở nhiệt
độ cao. Môi trường được hấp cách thủy với nhiệt độ hơi nước sôi 1000C, mỗi lần đun 1
giờ và liên tiếp trong 3 ngày liền. Lần nọ cách lần kia 24 giờ. Giữa 2 lần hấp lấy môi
trường ra để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử của vi sinh
vật(28 – 320C). Những bào tử còn sống sót trong lần hấp trước sẽ nảy mầm khi gặp
nhiệt độ thích hợp và chúng sẽ bị tiêu diệt trong lần hấp sau đó.
3 – Khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao (Autoclave).
Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp tiệt trùng ở áp suất cao. Phương pháp
này được sử dụng để khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Có thể sử dụng để hấp
các đĩa petri, pipet hay dụng cụ chịu nhiệt. Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão
hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong các phương pháp
khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.
+ Nguyên tắc.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia tăng nhiệt các vật bằng hơi nước bão
hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất bình thường của khí quyển. Khi áp suất hơi nước
tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo.
+ Cách sử dụng.
- Chuẩn bị dụng cụ, môi trường nuôi vi sinh vật được bao gói một cách cẩn thận.
- Cho nước vào nồi hấp đến mức phù hợp.
- Xếp các dụng cụ, môi trường nuôi cấy vào nồi.
- Đóng chặt nồi hấp.
- Cắm phích điện.
- Điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng về trị số mong muốn.
- Đóng kín các van xả.
- Bật công tắc khử trùng (nút start).
13
 - Đối với nồi hấp tự động, quá trình khử trùng diễn ra và kết thúc bằng còi báo
hiệu.
- Chờ kim áp kế về số 0 và nhiệt độ hạ thấp (khoảng 600C – 800C) mới lấy dụng
cụ và vật liệu vừa khử trùng để tiện việc sử dụng.
III . Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật.
1. Khái niệm chung.
Để phân lập, nuôi cấy và bảo quản các loại vi sinh vật người ta phải sử dụng các
loại môi trường dinh dưỡng đặc hoăc lỏng (dịch thể). Môi trường dinh dưỡng không
những phải chứa đủ các chất cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật
mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện lý hóa thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa
tế bào và môi trường.
Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào cũng phải đảm bảo các yêu cầu cơ bản sau:
- Có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.
- Có pH và thế oxy hóa khử thích hợp.
- Không chứa các yếu tố độc hại đối với loại vi sinh vật nghiên cứu.
- Hoàn toàn vô trùng.
Vì vậy khi thiết kế môi trường nuôi vi sinh vật cần phải biết rõ nhu cầu dinh dưỡng và
đặc điểm trao đổi chất của chúng. Nồng độ chất dinh dưỡng đưa vào phải thích hợp để
duy trì mức độ cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật.
2. Phân loại môi trường.
a . Dựa vào thành phần.
+ Môi trường tự nhiên: Dùng các nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên như sữa, huyết
thanh, khoai tây, cám … thành phần hóa học của chúng thường phức tạp và không ổn
định.
+ Môi trường tổng hợp: Dùng các hóa chất có thành phần hoá học xác định.
+ Môi trường bán tổng hợp: Ngoài việc dùng các nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên
còn dùng thêm hóa chất.
b. Dựa vào tính chất lý học.
+ Môi trường lỏng hay môi trường dịch thể.
+ Môi trường đặc là môi trường chứa 1,5 – 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin.
+ Môi trường bán lỏng là môi trường chứa 0,35 – 0,7% agar.
c. Dựa vào công dụng.
+ Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo sự phát triển ưu thế của 1 loại hay 1
nhóm vi sinh vật nào đó. Ví dụ môi trường để phân lập hay nuôi cấy vi khuẩn cố định
đạm, vi khuẩn phân giải cellulose…

14
+ Môi trường kiểm định: Là môi trường cho phép phân biệt được một số đặc điểm
của một loại vi sinh vật cần xác định. Người ta thường cho vào môi trường kiểm định
một số chất chỉ thị màu hoặc một số hoá chất giúp việc tạo ra những phản ứng màu để
quan sát thấy.
3. Cách làm môi trường.
Làm môi trường là một trong những khâu quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật.
Vì vậy khi làm môi trường phải rất cẩn thận và chính xác. Trình tự làm như sau:
a. Pha chế.
Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường.
- Với môi trường lỏng: Các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước.
- Với môi trường đặc: Agar bột cho vào nước, khuấy đều, đun tan rồi bổ sung các
thành phần còn lại vào.
b. Lọc.
Môi trường cần phải trong để dễ quan sát:
- Với môi trường lỏng: Người ta lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấm nước
hoặc qua giấy lọc.
- Với môi trường đặc: thường lọc qua vải màn 2 lớp hoặc giấy lọc trong điều kiện
có phễu lọc nóng.
c. Điều chỉnh pH môi trường.
Độ pH môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật được nuôi cấy và tùy theo yêu cầu
khảo cứu. Muốn điều chỉnh pH có thể dùng HCl 10%, NaOH 10% cũng có thể dùng
các chất khác như H3PO4, H2SO4, KOH, Na2CO3, NaHCO3, acid lactic…
Để kiểm tra pH của môi trường có thể dùng máy đo pH hoặc giấy đo pH.
d. Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa.
Với bình tam giác thường phân phối khoảng 1/3-1/2 thể tích bình. Với ống nghiệm
thường phân phối 1/4 chiều cao ống khi làm thạch nghiêng và 1/2 -2/3 chiều cao của
ống khi làm thạch đứng.
e. Khử trùng môi trường.
Các dụng cụ chứa môi trường phải được đậy nút bông. Phương pháp hấp vô
trùng và điều kiện hấp tùy thuộc vào tính chất của môi trường đó. Thường sử dụng hấp
khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao (Autoclave).
f. Cách làm thạch nghiêng, thạch đứng và thạch đĩa.
+ Thạch nghiêng.
Sau khi khử trùng xong, ta lấy các ống nghiệm còn lỏng, đặt nghiêng trên thước
gỗ hoặc que thủy tinh sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều cao của ống và
chảy đều từ đáy ống nghiệm. Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông.

15
 +Thạch đứng.
Sau khi khử trùng xong, thạch còn nóng, ta để đứng ống nghiệm. Thạch nguội
sẽ đông lại và ta sẽ có ống thạch đứng.
+ Thạch đĩa (đổ đĩa).
Chỉ làm trước khi dùng một thời gian ngắn (vài giờ hoặc vài ngày). Việc đổ đĩa
phải thực hiện trong không gian vô trùng của đèn cồn hay trong tủ cấy vô trùng. Trình
tự làm như sau:
1. Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50 – 600C.
2. Mở giấy gói hộp petri, đặt hộp lên mặt bàn phẳng.
3. Tay phải cầm bình chứa môi trường hay ống môi trường đã chảy lỏng,
giữ hơi nghiêng, dùng tay trái xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng
bình hoặc miệng ống trên đèn cồn.
4. Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót môi trường vào
hộp. Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp một cách nhẹ nhàng để
thạch dàn thành 1 lớp đều trên đáy hộp.
5. Để yên cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn, gói giấy hộp trở lại.
4. Thực hành: Làm một số môi trường và bao gói dụng cụ cho quá trình thực tập.
4.1 Dụng cụ.
- Ống nghiệm - Muỗng lấy hóa chất. - Giấy gói.
- Phễu - Giá ống nghiệm - Giấy đo pH
- Bếp điện - Becher 100ml - Vải lọc
- Cân kỹ thuật - Ống đong 100ml - Bình tam giác 250 ml
- Autoclave - Đũa khuấy - Ống hút 1 ml
- Becher 500 ml - Bông không thấm nước - Đĩa petri.
4.2 Hóa chất.
Cao thịt Pepton
Khoai tây Glucose
KH2PO4 CH3COONa
MgSO4 Agar
NaCl Cao nấm men
CaCO3 CaSO4.2H2O
K2HPO4 (NH4)2SO4
Tinh bột

16
4.3 Công thức
4.3.1. Môi trường Hansen
Để nuôi cấy nấm men
Glucose 50 g
Pepton 10 g
KH2PO4 3g
MgSO4.7H2O4 4g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 6.0
Cách làm: Agar được nấu tan, thêm Pepton được hòa tan trước đó trong nước ấm. Cho
thêm các thành phần còn lại vào, khuấy đều. Đun sôi trở lại và bắt xuống. Khử trùng 1
atm trong 15 phút.
(Môi trường Hansen lỏng và các loại môi trường lỏng khác bỏ thành phần agar là ra
công thức)
4.3.2. Môi trường Acetat
Để nấm men, vi khuẩn tạo bào tử
Glucose 0.4 g
CH3COONa 1.4 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Cách làm: Agar nấu tan, thêm Natri acetat đã hòa tan trong nước ấm trước đó. Đun sôi
trở lại. Cho glucose vào, khuấy đều và bắt xuống. Phân vào ống nghiệm để làm thạch
nghiêng. Khử trùng 1 atm trong 15 phút.
4.3.3. Môi trường PGA
Dùng để nuôi cấy nấm mốc
Khoai tây gọt vỏ thái nhỏ 300 g
Glucose 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 6.8
Cách làm: Lấy khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cân 300 g rồi thái nhỏ, thêm 500 ml nước
cất, đun sôi 30 phút. Lọc lấy nước trong, thêm nước cho đủ 1000 ml, cho các thành
phần còn lại vào, khuấy đều, đun sôi cho tan đều rồi phân vào ống nghiệm để làm
thạch nghiêng và thạch đứng, khử trùng 1 atm trong 15 phút.
4.3.4. Môi trường lỏng cao thịt - pepton.
Để nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh
17
 Cao thịt 5g
Pepton 10 g
Nước cất 1000 ml
pH 7.0
Cách làm: Hòa tan cao thịt và pepton trong nước ấm, thêm nước cất cho đủ 1lít. Phân
vào ống nghiệm(mỗi ống khoảng 3 – 4 ml). Khử trùng 1 atm trong 30 phút.
4.3.5. Môi trường thạch – cao thịt – pepton
Để nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh.
Cao thịt 5g
Pepton 10 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 7.0
Cách làm: Hòa tan cao thịt và pepton trước trong nước ấm. Agar nấu tan, cho các
thành phần còn lại vào. Phân vào ống nghiệm để làm thạch đứng và thạch nghiêng.
Khử trùng 1 atm trong 30 phút.
4.3.6. Môi trường nước Tryptone.
Tryptone hoặc trypticase 20g
Nước cất 1lít
PH cuối 7,2 ± 0,2.
Cách làm: Chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2. Hấp 1210C trong 15 phút. PH cuối 7,2 ± 0,2.
4.3.7. Môi trường CaCO3
Cao nấm men 5g
Glucose 10g
CaCO3 15g
Agar 20g
Nước cất đủ 1000ml
Cách làm: agar nấu tan trong 800 ml nước, cho cao nấm men vào một ít nước ấm,
khuấy tan. Trộn các thành phần lại với nhau, đun sôi, bổ sung nước cho đủ 1 lít. Phân
vào dụng cụ làm môi trường. Hấp khử trùng ở 1atm trong 15 phút.
4.3.8. Môi trường vô đạm: Môi trường Ashby
Glucose 20g
KH2PO4 0.2g
MgSO4.7H2O 0.2g
NaCl 0.2g

18
 CaSO4.2H2O 0,1g
CaCO3 5g
Agar 20g
Nước cất đủ 1000ml
Cách làm: nấu tan agar trong 1 lít nước cất vô đạm, sau đó cho đường và muối vào.
Đun sôi trở lại. Khuấy đều, thêm nước cho đủ 1 lít. Phân vào dụng cụ làm môi trường.
Hấp khử trùng 1atm trong 15 phút.
4.3.9. Nước muối sinh lý.
NaCl 8.5 g
Nước cất 1 lít
Cách làm: Dung dịch này được chứa trong các bình thủy tinh, hấp khử trùng và được
phân thành các thể tích chính xác 9 ml vào trong các ống nghiệm vô trùng.
4.3.10. Môi trường chứa gelatin.
Để phát hiện hoạt tính gelatinase của vi khuẩn.

NaCl 3g Peptone 0,1g

K2HPO4 1.5g Cao thịt 1g
KH2PO4 1.5g Agar 15 g
Gelatin 4g Nước cất đủ 1000 ml
Glucose 0.05g
Cách làm: Hòa tan các muối vào 100 ml nước cất, gelatin được hòa tan riêng trong
400 ml nước cất, sau đó bổ sung đường, peptone, nước thịt. Trộn hai dung dịch với
nhau, rồi đun sôi vài phút. Agar được hòa tan riêng trong 500 ml nước cất. Trộn chung
các phần lại với nhau. Bổ sung nước cho đủ 1 lít. Phân vào dụng cụ làm môi trường.
Hấp ở 1atm trong 15 phút.
4.3.11. Môi trường chứa tinh bột.
Để phát hiện hoạt tính amylase của vi khuẩn.
Cao thịt 10 g
Tinh bột 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1 000 ml
Cách làm: Agar nấu tan trong 600 ml nước cất, hòa tan cao thịt trong một ít nước ấm.
Trộn các thành phần lại với nhau, khuấy đều. Đun sôi trở lại, thêm nước cho đủ 1 lít.
Phân vào dụng cụ làm môi trường. Hấp khử trùng 1 atm trong 15 phút.

19
4.3.12. Môi trường etanol – cao nấm men.
Cao nấm men 10 g
CaCO3 20g
Etanol 20ml
Agar 20g
Nước cất đủ 1000ml
Cách làm: nấu tan agar trong 600 ml nước, hòa tan cao nấm men trong nước ấm. Trộn
cao nấm men và CaCO3 vào agar đã nấu tan. Đun sôi trở lại, thêm nước cho đủ 1 lít.
Phân vào dụng cụ làm môi trường. Hấp khử trùng 1 atm trong 15 phút. Đợi môi
trường nguội đến 45 – 500-C cho etanol vào.
4.3.13. Môi trường thử khả năng phân giải dextrin.
Cao nấm men 10 g
Dextrin 20g
Agar 20g
Nước cất đủ 1000ml
4.3.14. Môi trường thử khả năng oxi hóa acetate (Sodium acetate)
Cao nấm men 2g
Peptone 3g
Sodium acetate 2g
Bromothymol blue 0.02g
pH 6.4
Nước cất đủ 1000ml
4.3.15. Môi trường thử khả năng phân giải calcium lactate
Calcium lactate 10g
Cao nấm men 10g
Agar 20g
pH 7.0
Nước cất đủ 1000ml
4.3.16. Môi trường Czapek Dox
NaNO3 2g
KCl 1g
KH2PO4 1g
MgSO4.7H2O 0,5 g
FeSO4 0,01g
Agar 20g
pH 6-6.5
Nước cất đủ 1000 ml
20
4.3.16. Các loại môi trường đông khô: Đã trộn sẵn, chỉ cần xem nhãn rồi lấy lượng
mẫu đã trộn sẵn để pha chế (như LSB, BGBL…)
Báo cáo:
1.Tóm tắt phương pháp sử dụng, bảo quản, di chuyển, chỉnh kính hiển vi.
2. Mô tả, vẽ hình các loại vi sinh vật đã quan sát, mẫu sống (làm tiêu bản, quan sát
hình thái, trạng thái di động..).
3.Tóm tắt cách bao gói dụng cụ, chuẩn bị và điều chế các loại môi trường nuôi cấy vi
sinh vật.

21
 Bài 2 NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Muốn khảo sát vi sinh vật cần phải cấy và nuôi chúng để nhận định loại và nghiên cứu
các đặc tính sinh lý khác.
I. Định nghĩa.
Cấy là sự chuyền vi sinh vật từ môi trường chúng đang sống vào môi trường thức ăn
mới đã được khử trùng, từ đó các vi sinh vật tiếp tục phát triển trong những điều kiện
thuận lợi nhất.
II. Mục đích.
Cấy vi sinh vật nhằm các mục đích sau:

 Phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật trong các vật liệu nghiên cứu.

 Ly trích hay phân lập giống vi sinh vật có trong thiên nhiên, trong đất, nước,
thực phẩm … từ đó nghiên cứu sâu hơn.

 Nhân giống vi sinh vật.

 Cấy chuyền để bảo quản giống vi sinh vật.

III. Điều kiện thực hiện.
Để tránh nhiễm các vi sinh vật khác trong khi cấy cần thực hiện ở một nơi đã
được vô trùng:
a. Thực hiện thao tác cấy trong phòng cấy hay tủ cấy vô trùng.
b. Hoặc chọn một nơi:

 Sạch, không bám bụi hay mầm vi sinh vật.

 Kín gió.
Trong khi cấy cần thực hiện:

 Cấy nhanh.

 Cấy gần đèn cồn (trong bán kính từ 5-10 cm)

 Tiệt trùng dụng cụ thật kĩ.

IV. Phương pháp cấy.
Trong khi cấy cần phải thực hiện các công việc sau:
1. Chuẩn bị.
- Lau bàn và rửa tay.

22
- Khử trùng lại bằng cồn.
- Ngồi đối diện trước ngọn đèn cấy.
- Giá ống nghiệm nên để bên trái nếu thuận tay phải. Tất cả các dụng cụ còn lại
nên để bên phải.
- Ghi tên vi khuẩn cần cấy và ghi ngày cấy.
2. Cách cấy:
- Tay phải cầm que cấy đốt cho thật đỏ để khử trùng, khử luôn đoạn dài của cán,
ít nhất là phần đưa vào ống nghiệm.
- Tay trái cầm ống nghiệm xuôi theo lòng bàn tay, tay phải nắm nút bông giữa
ngón út và cạnh bàn tay, tay trái xoay nhẹ ống nghiệm, hơ miệng ống nghiệm
trên ngọn lửa đèn cồn.
- Cho đầu que cấy đã khử trùng vào trong và tiếp xúc thành ống, dùng ngón cái
chạm vào thành ống nghiệm thăm dò xem que cấy đã nguội hay chưa. Khi que
cấy nguội, chấm đầu que vào nơi có vi khuẩn, rút que cấy ra, khử trùng miệng
ống nghiệm và đóng nút bông lại.
- Lấy ống môi trường, mở nút bông, khử trùng miệng ống.
- Thực hiện sự cấy.
- Cấy xong, khử trùng que cấy trước khi đặt xuống bàn.

23
 Cách lấy giống vi sinh vật bằng que cấy vòng

Cách cấy vi sinh vật vào môi trường dinh dưỡng

24
Cách cấy vi sinh vật từ thạch đĩa sang thạch nghiêng

25
 Cách cấy vi sinh vật từ thạch nghiêng sang môi trường thạch nghiêng
V. Mối quan hệ của vi khuẩn với oxi.
Ở vi khuẩn có nhiều khác biệt đáng kể về nhu cầu oxi. Một số vi khuẩn không
mọc được trên môi trường thiếu oxi, còn số khác thì ngược lại, chỉ phát triển trên môi
trường không có sự hiện diện của oxi, ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được ở cả hai
điều kiện trên. Tùy nhu cầu của vi khuẩn đối với oxi mà có thể chia thành vi khuẩn
hiếu khí, kị khí và kỵ khí không bắt buộc.

26
1. Mối liên hệ của oxi tự do lên sự tăng trưởng của vi sinh vật.
Trong ống thạch sâu, tùy đặc điểm của vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí sẽ phân bố trên
ống thạch thành 3 vùng:
- Vùng nhiều oxi tự do (A): chủ yếu là nhóm vi khuẩn hiếu khí.
- Vùng lượng oxi giảm dần (B): chủ yếu là nhóm kị khí không bắt buộc.
- Vùng không có oxi (C): chỉ có nhóm kị khí hoạt động

vùng A nhóm vi khuẩn hiếu khí

vùng B nhóm vi khuẩn kị khí không bắt buộc
vùng C nhóm vi khuẩn kị khí

2. Nuôi cấy vi khuẩn kị khí.

Có nhiều cách để nuôi cấy vi khuẩn kị khí:
a. Nuôi cấy ở đáy môi trường thạch sâu (vùng C) hoặc thêm một lớp dầu khoáng trên
mặt môi trường để ngăn cản sự khuyếch tán của oxi.
b. Dùng môi trường có chất khử oxi như bột gan, sodium formaldehyde sulfoxylate,
cystein, muối chloride của heme, sodium thioglucolate (HSCH2COONa). Hợp chất
này phản ứng với oxi và tạo điều kiện kị khí trong môi trường.
c. Dùng dụng cụ như bình thủy tinh hoặc nhựa kín trong đó oxi có thể được loại ra
bằng các phương pháp sau:
- Cho các đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn vào một lọ kín, cung cấp hydro vào và dùng điện
cực platin để đun nóng, xúc tác sự kết hợp giữa hydro và oxi thành nước, nước sau đó
được loại bỏ bằng CaCl2.
- Dùng túi khử oxi, trong túi chứa bicarbonate natri, borohydride natri và xúc tác. Cho
túi này vào các bình kín đã chứa các đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn. Cho nước vào túi, khí
CO2 và H2 được tạo thành khi có sự hiện diện của nước. Hydro được tạo ra sẽ kết hợp
với oxi tạo nước.
- Đặt các hộp petri vào lọ, đốt một ngọn đèn cầy nhỏ, đậy kín nắp lại. Bên trong thiếu
oxi đèn sẽ tắt.

27
VI. Vật liệu(dùng cho 8 sinh viên).
1. Dụng cụ.
Hộp petri vô trùng 16 cái Que cấy thẳng 4 cái
Que cấy vòng 4 cái Que cấy móc 4 cái
Giá ống nghiệm 4 cái Đèn cồn 4 cái
Rổ nhựa 4 cái Quẹt ga 4 cái
Bình cồn 96oC 4 bình Bông thấm 4 bịch nhỏ
Sọt nhỏ 4 cái
2. Môi trường, hoá chất.
Môi trường thạch - cao thịt - pepton 1 erlen 150 ml
Môi trường Hansen 1 erlen 150 ml
Môi trường thạch - cao thịt - pepton đứng 12 ống
Môi trường thạch – cao thịt – pepton nghiêng 8 ống
Môi trường lỏng cao thịt – pepton 16 ống
Môi trường Hansen nghiêng 8 ống
Môi trường PGA nghiêng 8 ống
3. Giống vi sinh vật.
Bacillus subtilis nuôi trên thạch nghiêng 1 ngày tuổi 4 ống
Bacillus subtilis nuôi trong môi trường lỏng 1 ngày tuổi 4 ống
Escherichia coli nuôi trong môi trường lỏng 1 ngày tuổi 4 ống
Clostridium nuôi trong môi trường lỏng 1 ngày tuổi 4 ống
Saccharomyces cerevisiae 1 ngày tuổi 4 ống
Aspergillus oryzae 3 ngày tuổi 4 ống
VII. Thực hành.
1. Cấy vi khuẩn.
a. Cấy vào môi trường lỏng.

28
- Cấy từ môi trường lỏng sang lỏng: Dùng que cấy vòng, cấy chuyền dịch nuôi cấy
B.subtilis sang môi trường lỏng cao thịt - pepton mới, lắc nhẹ.
- Từ môi trường rắn sang lỏng: Dùng que cấy vòng chạm nhẹ vào vân cấy B.subtilis
trên môi trường đặc rồi cấy vào môi trường cao thịt – pepton lỏng bằng cách cạ nhẹ
vào thành ống nghiệm nơi có chất lỏng. Sau đó lắc nhẹ ống nghiệm để vi khuẩn phân
tán đều.
b. Cấy vào môi trường rắn.
+ Thạch đứng: Đun chảy 3 ống môi trường thạch cao thịt peptone đứng ở 100 0C, giữ
tiếp 10 phút để đuổi oxi hòa tan, làm nguội môi trường còn khoảng 45 – 500C, cấy vài
giọt vi khuẩn Bacilus subtilis, E.coli, Clostridium; mỗi loại vào một ống thạch. Để cho
môi trường đặc lại (không lắc). Đem ủ ở 370C sau 2 ngày, lấy ra quan sát kết quả.
+ Thạch nghiêng: Sử dụng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn Bacillus subtilis (từ môi
trường lỏng hay đặc), để dưới đáy ống nghiệm, cà nhẹ để tạo huyền trọc với một ít
nước đọng ở đáy ống nghiệm. Kế đó, ta cấy những đường thật khít theo hình zích zắc
khoảng 1/3 chiều dài mặt thạch nghiêng rồi nghiêng que cấy để cấy những đường thưa
hơn về phía trên để tạo các khuẩn lạc rời nhau ra.
+ Thạch đĩa: Phương pháp cấy trên thạch đĩa thường dùng để phân lập vi sinh vật,
kiểm tra độ thuần khiết của giống vi sinh vật đã phân lập, tạo ra các khuẩn lạc riêng lẽ
từ một quần thể vi sinh vật trong thiên nhiên. Để cấy hay phân lập vi sinh vật trên
thạch đĩa có thể sử dụng phương pháp cấy ria hoặc phương pháp trải đĩa.
Phương pháp trải đĩa: chuyển 0,1 ml mẫu hoặc dịch nuôi cấy đã pha loãng lên bề mặt
thạch đĩa. Dùng que trải, trang đều trên bề mặt thạch đĩa. Ủ ở nhiệt độ thích hợp, sau
một thời gian ta có thể nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ.
Phương pháp cấy ria: Có nhiều kiểu cấy ria vi sinh vật, không có kỹ thuật nào là hoàn
hảo tuyệt đối. Ngoài ra hiệu quả của kỹ thuật còn phụ thuộc vào người thao tác. Một số
kỹ thuật ria thường dùng như kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia,
kỹ thuật ria liên tục, ria hình rào.

29
 Ria chữ T Ria bốn góc

Ria tia Ria liên tục

Sinh viên thực hiện thao tác cấy ria giống B.subtilis từ ống giống sang môi trường
thạch đĩa cao thịt pepton đã được chuẩn bị trước đó (chọn 1 kiểu cấy ria).
2. Cấy nấm men.
Phương pháp cấy nấm men giống như cấy đối với vi khuẩn.
Thực hành cấy giống S.cerevisiae từ ống giống sang:
- Môi trường Hansen nghiêng.
- Môi trường thạch đĩa Hansen.
3. Cấy nấm mốc.
Dùng que cấy móc lấy một ít khuẩn ty hoặc bào tử A.oryzae từ ống giống rồi
cấy sang ống môi trường PGA nghiêng. Có thể cấy thành những điểm trên mặt thạch
(thường cấy 3 điểm) hoặc gõ nhẹ đầu que cấy trên thành ống nghiệm hay trên nắp hộp
petri để bào tử nấm mốc phân tán vào môi trường mới.
4. Quan sát kết quả.
Thường quan sát kết quả sau 24 giờ, ủ ở 370C.
- Trong môi trường lỏng, khi quan sát vi khuẩn cần chú ý:
1. Có váng hay không, có đục hay có kết tủa, lắng cặn hay không.
2. Đặc tính có váng (nếu có): mỏng hay dày, trơn hay xù xì, kín hay dạng
vòng...
3. Đặc tính vẩn đục: đục đều, dạng bông, dạng sợi, mức độ đục (nhiều, ít,
trung bình).
4. Đặc tính của kết tủa: ít, nhiều, xốp, đặc, dạng bông, dạng hạt, nhày...

30
 - Trong môi trường đặc: cần phải quan sát hình dạng khuẩn lạc vi sinh vật khi
phát triển trong các hộp petri đựng môi trường đặc. Cần chú ý quan sát:
1. Tốc độ sinh trưởng: nhanh, chậm.
2. Hình dạng chung của khuẩn lạc: lớn, nhỏ (đo đường kính khuẩn lạc), nhỏ
li ti (1mm), đồng đều, có dạng bông, dạng sợi, dạng rễ.
3. Đặc tính của mép khuẩn lạc: bằng phẳng, uốn sóng, răng cưa, có múi, xẻ
không đều, dạng bông, dạng sợi...
4. Đặc tính bề mặt: trơn nhẵn, xù xì, có nếp, rãnh, vòng đồng tâm...
5. Nhìn nghiêng: dạng bằng phẳng, hơi lồi, lồi, lồi cao, có sừng, có núm,
có chỗ lõm ở giữa...
6. Màu sắc khuẩn lạc.
7. Hình dạng của các khuẩn lạc chìm trong thạch.
- Trong môi trường thạch nghiêng vi khuẩn và nấm men phát triển sẽ hình thành
những vân cấy và các khuẩn lạc rời hoăc dính vào nhau.
- Đối với nấm mốc sau 24 giờ nuôi sẽ thấy những sợi khuẩn ty phát triển từ vết
cấy. Sau 3 ngày có thể thấy rõ khuẩn ty và bào tử của chúng.
VII. Báo cáo.
1. Tóm tắt phương pháp cấy các loại vi sinh vật.
2. Sau 1- 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng đối với vi khuẩn và 3 – 4 ngày đối với nấm
mốc. Sinh viên báo cáo kết quả về:
- Mô tả hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của các giống vi sinh vật trong các môi
trường nuôi cấy.
- Nhận xét và bàn luận các kết quả thu được.

31
 Bài 3 QUAN SÁT NẤM MỐC

I. Sơ lược về nấm mốc.

Nấm mốc là tên chung để chỉ các loại vi nấm có cấu tạo sợi. Nấm mốc có bào tử,
không có diệp lục không có khả năng quang hợp. Chúng thuộc loại hiếu khí.
Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một khối, từng sợi riêng
lẻ được gọi là khuẩn ty và cả toàn bộ các sợi được gọi là khuẩn ty thể hay hệ sợi nấm.
Có hai loại sợi nấm là sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm không có màng
ngăn ngang. Đối với loại sợi nấm không có màng ngăn ngang, toàn bộ hệ sợi nấm chỉ
là một tế bào phân nhánh rất phức tạp. Một số sợi nấm đâm sâu vào trong cơ chất hút
chất dinh dưỡng được gọi là khuẩn ty cơ chất. Trong khi đó một phần hệ sợi nấm phát
triển trên bề mặt được gọi là khuẩn ty khí sinh.
Nấm mốc có thể sinh sản bằng nhiều hình thức sinh sản và nhiều loại cơ quan sinh
sản nhưng cách sinh sản chủ yếu là tạo bào tử. Cách hình thành bào tử có nhiều điểm
khác nhau và là đặc điểm quan trọng để phân loại.
Mặc dù vậy bất cứ đoạn sợi nấm nào cũng có thể dùng để sinh sản. Các đoạn này
khi rơi trên môi trường dinh dưỡng sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới. Những giống
nấm mốc thường gặp và quan trọng trong thực tế: Mucor, Aspergilus, Rhizopus,
Penicillium.

Mucor Rhizopus Aspergillus Penicillium

- Sợi nấm đơn bào. - Sợi nấm - Sợi nấm đa bào. - Sợi nấm đa bào.
- Bào tử kín: bào tử đơn bào. - Bào tử hở, trên đầu - Bào tử hở.
tạo thành trong các - Bào tử kín. cuống bào tử tạo thành tế - Cuống bào tử đa
túi: bào tử nang. - Cuống bào bào hình chai. bào, phân nhánh và
- Cuống bào tử đơn tử đơn bào, - Cuống bào tử đơn bào, các chuỗi đính bào
bào, phân nhánh. không phân đầu cuống phình ra, tử hướng ra như
nhánh. chuỗi đính bào tử tỏa đều chổi.
như tia sáng.

32
Sự khác biệt cấu trúc giữa nấm mốc và nấm men

Các kiểu bào tử vô tính ở nấm mốc

Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus

33
II. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên).
1. Dụng cụ.
Kính hiển vi quang học 2 cái Phiến kính 32 cái
Lá kính 32 cái Que cấy móc 4 cái
Giá ống nghiệm 4 cái Thanh xếp lam 4 cái
Hộp nhựa(đựng tiêu bản ) 4 hộp Đèn cồn 4 cái
Bình tia (nước cất) 4 bình
2. Hoá chất:
Hỗn hợp xanh cotton trộn với lactophenol 4 bình (25ml/bình)
Cồn 96o 4 bình (100ml/bình)
Dung dịch lactophenol 4 bình (25ml/bình)
3. Giống vi sinh vật.
Tiêu bản phòng ẩm của 4 giống nấm mốc: Mucor, Rhizopus, Aspergillus và
Penicillium (4 tiêu bản).
Môi trường PGA thạch đĩa nuôi 4 giống nấm mốc: Mucor, Rhizopus, Aspergillus và
Penicillium 8 hộp(1- 3 ngày tuổi)
Môi trường PGA thạch nghiêng nuôi 4 giống mốc Mucor, Rhizopus, Aspergillus và
Penicillium (8 ống).
III. Thực hành.
1. Quan sát đại thể.
Tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc của các giống nấm mốc được nuôi
trên thạch đĩa được cung cấp sẵn. Ghi nhận kết quả.
2. Quan sát vi thể.
a. Phương pháp làm tiêu bản không nhuộm màu.
- Dùng cồn lau sạch phiến kính và lá kính, để khô trên thanh xếp lam.
- Nhỏ 1 giọt dung dịch lactophenol lên phiến kính.
- Dùng que cấy móc lấy một ít hệ sợi của từng giống mốc từ ống giống nấm mốc
được cung cấp, dàn mỏng lên phiến kính.

34
 - Đậy lá kính và đem soi ở vật kính 10X, sau đó là vật kính 40X.
- Vẽ hình, nhận xét hình dạng sợi nấm, cơ quan sinh bào tử, bào tử…
b. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu.
- Dùng cồn lau sạch phiến kính và lá kính, để khô trên thanh xếp lam.
- Nhỏ một giọt xanh coton lên phiến kính.
- Dùng que cấy móc lấy một ít sợi nấm dàn đều lên phiến kính chỗ có giọt phẩm
nhuộm.
- Đậy lá kính trên mẫu vật.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40X.
- Quan sát vẽ hình: dạng nấm sợi, cơ quan sinh bào tử, bào tử…

c. Phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm (sinh viên không làm phần này).
- Đặt vào đĩa petri một tờ giấy lọc, sau đó là một phiến kính.
- Đậy nắp petri, gói giấy và hấp khử trùng.
- Đun chảy môi trường PGA trong ống nghiệm đã hấp khử trùng
- Mở hé nắp petri ở gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến
kính bên trong đĩa petri, sao cho thạch chảy dài một nữa bên của phiến kính.
- Khi thạch trên phiến kính đã đặc lại, bổ sung một ít nước cất vô trùng vào để
làm ướt phần giấy thấm bên dưới để giữ độ ẩm.
- Dùng que cấy móc để lấy một ít bào tử hoặc tơ nấm, cấy thành 1 hoặc 2 điểm
trên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm.
- Gói hộp lại, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 – 3 ngày.
- Lấy phiến kính ra khỏi hộp petri, dùng giấy thấm chùi sạch mặt đáy của phiến
kính.
- Đậy lá kính lên chỗ có nấm mốc mọc, đặc biệt ở phần không có thạch.
- Quan sát và vẽ hình cuống đính bào tử, bào tử, vách ngăn(nếu có)…
IV. Báo cáo.
1. Nêu tóm tắt các phương pháp làm tiêu bản để quan sát nấm mốc.
2. Báo cáo kết quả thực hành quan sát nấm mốc:

35
 Quan sát đại thể.
Miêu tả các đặc điểm của từng loại nấm mốc về:
- Hình dạng khuẩn lạc.
- Màu sắc của khuẩn lạc (khuẩn ti thể và bào tử của chúng).
- Cách khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch.

 Quan sát vi thể.

Ứng với mỗi loại tiêu bản, sinh viên vẽ hình. nhận xét về:
- Sợi nấm đơn bào hay đa bào?
- Cuống bào tử đơn bào hay đa bào, có phân nhánh hay không?
- Bào tử kín hay hở?

36
 Bài 4 QUAN SÁT NẤM MEN

I. Sơ lược về nấm men

Nấm men có cấu tạo đơn bào có kích thước tương đối lớn, gấp 5- 10 lần so với
tế bào vi khuẩn. Hình dáng tế bào nấm men cũng rất đa dạng (hình cầu, hình oval, hình
ống, hình trứng…). Một vài loài có khả năng tạo khuẩn ty hay khuẩn ty giả.
Nấm men có 2 hình thức sinh sản: vô tính và hữu tính.
Chúng sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, còn sinh sản hữu
tính bằng phương thức tiếp hợp.
Khi quan sát nấm men cần lưu ý đến các đặc điểm nổi bật của chúng như hình
dáng và kích thước tế bào, sự nảy chồi, hình dáng và số lượng bào tử trong một túi bào
tử. Cách nảy chồi, khả năng tạo bào tử, hình dáng và số lượng nang bào tử cũng là các
đặc điểm phân loại.

Nấm men Sacharomyces

II. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên).
Dụng cụ.
- Kính hiển vi 2 cái.
- Phiến kính (lame) 16 cái.
- Lá kính (lamelle) 16 cái.
- Đèn cồn 4 cái.
- Que cấy vòng 4 cái.
- Bông thấm 1 bịch.
- Giấy thấm 1 hộp.
- Cốc 250 ml đựng nước rửa tiêu bản 4 cái.
- Chậu chứa nước rửa + giá nhuộm 4 bộ.

37
Hóa chất:
- Xylol 2 bình(20ml/bình)
- Dầu soi 2 bình(20 ml/ bình)
Phẩm nhuộm.
1. Xanh methylene Loeffer’s. 2 bình (25ml/bình)
Cách pha:
- Dung dịch A
Xanh methylene 0.3 g.
Etanol 95% 30 ml.
- Dung dịch B
KOH 0,01% (w/v) 100 ml.
Trộn dung dịch A và dung dịch B lại với nhau.
2. Lục malachite 5% ( 5 g trong 100 ml nước cất) 2bình(25 ml/bình)
3. Safranin 0,5% ( 0,5 g trong 100 ml nước cất) 2 bình(25 ml/bình)
Giống thí nghiệm.
- Saccharomyces cerevisiae nuôi trên môi trường Hansen lỏng và môi trường
Hansen nghiêng 1 ngày tuổi.
- Saccharomyces cerevisiae nuôi trên môi trường Acetate 7 ngày tuổi.
III. Thực hành .
1. Xác định tỷ lệ tế bào sống chết bằng phương pháp nhuộm màu ở
trạng thái sống. Quan sát chồi ở tế bào nấm men.
1. Dịch tế bào nấm men được chuẩn bị bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh
khối nấm men từ ống giống hòa vào nước cất vô trùng để tạo huyền phù tế
bào nấm men có mật độ vừa phải.
2. Nhỏ một giọt xanh methylene Loeffer’s vào giữa một phiến kính sạch.
3. Dùng que cấy lấy một giọt dịch tế bào nấm men cho vào giọt xanh
methylene Loeffer’s.
4. Cẩn thận đặt 1 lá kính sạch lên trên giọt chất lỏng chứa tế bào nấm men và
xanh methylene Loffer’s.
5. Nhanh chóng đặt lên kính hiển vi và quan sát ở độ phóng đại 10X và 40X.
6. Đếm số tế bào sống chết ở một vài vị trí, lấy giá trị trung bình rồi suy ra
phần trăm tế bào sống chết trong mẫu quan sát. Quan sát vị trí và số lượng
chồi trên mỗi tế bào. Vẽ hình.
2. Nhuộm và quan sát bào tử.
- Nuôi nấm men trên môi trường Acetate 7 ngày, lấy một ít tế bào nấm men hòa
đều vào một giọt nước cất vô trùng trên phiến kính sạch.
- Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.

38
 - Đặt 1 miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lục malachite 5%, hơ nóng trong 10
phút (không để sôi).
- Rửa nước.
- Nhuộm Safranin 0.5% hay Fushin trong 1 phút.
- Rửa nước, làm khô.
- Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản.
- Quan sát dưới vật kính nhúng dầu(100X).
- Quan sát hình dạng và số lượng bào tử trong tế bào. Vẽ hình
Sau khi quan sát xong, lấy một ít gòn thấm xylol lau đầu vật kính, sau đó sử dụng gòn
khô để lau lại.
Báo cáo: Tóm tắt phương pháp nhuộm. Ghi nhận và biện luận kết quả.
3. Xác định mật độ tế bào nấm men trong canh trường bằng cách đếm trực tiếp
bằng buồng đếm hồng cầu.
3.1. Nguyên tắc cấu tạo buồng đếm hồng cầu.
Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào
tử nấm mốc). Người ta thường dùng 2 loại phòng đếm: phòng đếm Thomas và phòng
đếm Goriep.
Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại phòng đếm này đều giống nhau. Đó là một phiến
kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ.
Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm rất nhiều ô vuông. Vùng đếm có
diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích 1/25mm2. Mỗi ô vuông
lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô) có diện tích 1/400 mm2 và
chiều cao là 1/10 mm. Như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3, phòng đếm có
lá kính dày để đậy.

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu

39
3.2. Cách tiến hành.
+ Pha loãng mẫu.
Hút 1ml canh trường nấm men cho vào ống nghiệm I chứa 9 ml nước cất vô
trùng, trộn đều. Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1. Sau đó lại hút 1 ml ở ống I cho
vào ống nghiệm II chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn đều, ta được độ pha loãng 10- 2.
Tiếp tục như vậy ta được các độ pha loãng tương ứng 10- 3, 10- 4….. Tùy số lượng vi
sinh vật trong mẫu (ước đoán) mà ta pha loãng nhiều hay ít.
+ Tiến hành đếm.
- Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu
- Đậy lá kính lên lưới đếm.
- Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho 1 giọt vào mép lá kính, dịch qua mao dẫn
tràn vào lưới đếm (chú ý: không để hình thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn
dịch mẫu xuống rãnh).
- Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút. Sau đó tiến
hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các tế bào nằm trong lồng ô con và
những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến
ô con 16 (sử dụng vật kính 40X).
- Dùng xong phòng đếm và lá kính phải rửa ngay và lau khô.
1.3. Cách tính.
Số lượng tế bào trong 1 ml canh trường được tính theo công thức:
a x 4000 x 103 x 10 n
Số tb/ml =
b
a: số tế bào trong 5 ô lớn, ni : số lượng đĩa cấy ở độ pha loãng thứ i.
b: số ô con trong 5 ô lớn (80 ô con)
10 n: độ pha loãng mẫu.
Lưu ý: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo độ chính xác của
phương pháp.

40
 Bài 5 QUAN SÁT VI KHUẨN

I. Sơ lược về vi khuẩn.
Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào, đa số chúng có đường kính 0,2 – 2,0 m, chiều dài từ 2-
8 m. Hình dáng tế bào có thể là hình cầu, hình que, hình xoắn hay hình dấu phẩy. Các
tế bào có thể tồn tại ở dạng đơn lẻ hay có thể kết đôi, kết chuỗi, kết chùm. Chúng sinh
sản chủ yếu bằng hình thức phân đôi tế bào. Một số loài có khả năng tạo bào tử. Một
số loài có khả năng di động nhờ chúng có tiên mao. Khi quan sát vi khuẩn cần quan sát
các đặc điểm mang tính đặc trưng như hình dáng, kiểu liên kết tế bào, khả năng di
động, sự hình thành bào tử và nhuộm gram …
II. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên).
Dụng cụ.
- Phiến kính 40 cái. - Kính hiển vi 2 cái.
- Lá kính 40 cái. - Nước cất vô trùng 4 ống
- Que cấy vòng 4 cái. - Giấy lọc 1 hộp.
- Đèn cồn 4 cái.
- Cốc thủy tinh 250 ml đựng nước để rửa tiêu bản 4 cái.
- Chậu chứa nước rửa tiêu bản + giá nhuộm 4 bộ.
Hóa chất.
- Xylol 2 bình(25 ml/bình)
- Dầu soi 2 bình(10 ml/bình)
Thuốc nhuộm.
1. Tím kết tinh 2 bình(50 ml/bình)
Cách pha:
a. Tím kết tinh 2 g.
Rượu etylic 90% 20 ml.
b. Ammonium oxalate 0.8 g.
Nước cất 80 ml.
Trộn đều dung dịch a và dung dịch b lại với nhau. Bảo quản trong 24 giờ rồi lọc
qua giấy lọc thô.
2. Lugol 2 bình(50 ml/bình)
Cách pha:
I2 1 g.
KI 2 g.
Nước cất 300 ml
Hòa tan KI và I2 vào 10 ml nước, rồi thêm nước cho đủ 300 ml.
3. Safranin(dùng cho nhuộm gram) 2 bình(50 ml/bình)
41
 Cách pha:
Safranin 0.25 g.
Rượu etylic 10 ml.
Nước cất 90 ml.
4. Cồn tẩy 2 bình(100 ml/bình)
5. Safranin 0.5% (0.5 g trong 100 ml nước cất) 2 bình(50 ml/bình)
6. Lục malachite 5% (5 g trong 100 ml nước cất) 2 bình(50 ml/bình)
7. Fuchsin Zielhl (dùng cho nhuộm đơn)
Fuchsin kiềm 0.3 g.
B.
Rượu etylic(90%) 10 ml.

Phenol 5 g
A.
Nước cất 35 ml
Trộn hai dung dịch A và B lại với nhau.

Giống thí nghiệm

- B. subtilis nuôi trên môi trường cao thịt – pepton lỏng 1 ngày tuổi 4 ống
- E.coli nuôi trên môi trường cao thịt pepton lỏng 1 ngày tuổi 4 ống

III. Quan sát vi khuẩn sống.

Quan sát vi khuẩn sống là phương pháp đơn giản giúp ta biết được hình dáng thật của
vi khuẩn, khả năng di động, …
Cách tiến hành:
1. Dùng que cấy vòng lấy một giọt nước cất vô trùng cho vào giữa phiến kính.
2. Dùng que cấy vòng lấy một giọt dịch nuôi cấy vi khuẩn ở ống giống hòa vào
giọt nước cất vô trùng trên phiến kính.
3. Đậy lá kính lên, để tránh tạo bọt khí, phải đặt một cạnh lá kính tựa trên mặt
phiến kính, hạ từ từ.
4. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. Ghi nhận kết quả (vi khuẩn di động
hay bất động, hình dạng tế bào … )
5. Sau khi quan sát xong để tiêu bản đúng nơi qui định để tiệt trùng. Ghi nhận kết
quả quan sát.
Lưu ý: tụ quang hạ xuống và đóng bớt chắn sáng. Phải chỉnh kính hiển vi nhanh để
quan sát (khoảng 1 phút) vì nếu chỉnh kính hiển vi chậm tiêu bản sẽ bị khô ta không
thể thấy được trạng thái di động của vi khuẩn.
42
Báo cáo: nhận xét về hình dạng, khả năng di động của các vi sinh vật đã quan sát.
IV. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái nhuộm màu.
1. Nhuộm đơn.
1.1 Mục đích: Để rõ hơn về hình dạng tế bào vi sinh vật và đo kích thước của chúng,
thường dùng phương pháp nhuộm đơn(chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên tiêu bản).
1.2 Cách tiến hành.
Phương pháp gồm 3 bước:
Bước 1: trải trùng (hay làm vết bôi)
Lấy một giọt dịch nuôi cấy vi khuẩn đã pha loãng để đạt mật độ vừa phải hoặc cạ nhẹ
vào đường cấy vi khuẩn hòa đều với giọt nước cất vô trùng trên phiến kính, dùng que
cấy vòng trải mỏng trên mặt phiến kính, để khô.
Bước 2: cố định mẫu
Hơ nhẹ phía dưới phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 – 4 lần hoặc nhỏ vài giọt cồn
ngay trên vết trải và đốt. Rửa nước.
Mục đích:
- Giết chết tế bào sống.
- Gắn chặt tế bào vào phiến kính để khi rửa không bị trôi.
- Làm cho tế bào bắt màu dễ hơn.
Bước 3: nhuộm màu
Đặt một miếng giấy lọc nhỏ lên vết bôi. Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn (Fushin) lên
vết bôi trong 3 – 5 phút. Rửa nước, làm khô. Quan sát dưới kính hiển vi sử dụng vật
kính nhúng dầu (100X).
Báo cáo: Tóm tắt phương pháp nhuộm.
Vẽ hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi.

43
Cách lấy mẫu từ ống giống lỏng để làm vết bôi

44
Cách làm vết bôi

45
 Cách nhuộm đơn

2. Nhuộm gram.
Năm 1884 nhà bác học Đan Mạch Cristian Gram đề xuất một phương pháp nhuộm đặc
biệt. Đây là phương pháp nhuộm để phân loại vi khuẩn theo khả năng bắt màu với
thuốc nhuộm tím kết tinh và Iod.
Theo phương pháp này tất cả vi khuẩn được chia thành 2 nhóm lớn. Một nhóm giữ
được phức màu tím được tạo thành giữa tím kết tinh và Iod khi xử lý cồn, những vi
khuẩn này được gọi là vi khuẩn gram dương. Nhóm khác không có khả năng giữ được
phức chất này và bị mất màu khi xử lý cồn, chúng được gọi là vi khuẩn gram âm. Cơ
chế do cấu trúc thành tế bào khác nhau.

Màu của vi khuẩn ở mỗi giai đoạn trong quá trình nhuộm Gram
46
 Cách nhuộm Gram
Cách tiến hành:
1. Chuẩn bị tiêu bản: Dùng que cấy lấy một ít nước vô trùng đặt lên phiến kính.
 Nếu giống từ môi trường đặc: Dùng que cấy khử trùng để nguội, lấy vi trùng, hòa
vào giọt nước trên phiến kính.
 Nếu giống nuôi trên môi trường lỏng: Dùng que cấy lấy 1 giọt môi trường nuôi vi
sinh vật hòa vào giọt nước trên phiến kính.
- Dàn mỏng thành vết bôi.
- Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá).
2. Đặt một miếng giấy lọc lên vết bôi. Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong 1 phút.
Dùng kẹp gấp bỏ giấy lọc.
3. Nhuộm Lugol trong 1 phút.
4. Rửa nước.

47
5. Tẩy bằng cồn trong 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi
thấy màu vừa hết trong các giọt nước chảy ra).
6. Rửa nước.
7. Nhuộm bổ sung bằng Safranin hay Fushin trong 10 - 30 giây.
8. Rửa nước.
9. Làm khô, soi dưới vật kính nhúng dầu.
Kết quả vi khuẩn gram dương sẽ có màu tím, vi khuẩm gram âm sẽ có màu thuốc
nhuộm bổ sung.
Báo cáo: Tóm tắt phương pháp nhuộm, ghi nhận kết quả quan sát.
3. Nhuộm bào tử.
Một số vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử so với tế bào dinh dưỡng có
sức chống chịu cao hơn đối với các điều kiện bất lợi. Bào tử có thể hình tròn hay bầu
dục. Bào tử có thể hình thành chính giữa tế bào, ở một đầu hay gần một đầu của tế
bào. Khi đường kính của bào tử không lớn hơn đường kính của tế bào thì vi khuẩn
thường thuộc giống Bacillus, còn khi đường kính của bào tử lớn hơn đường kính tế
bào thì vi khuẩn thường thuộc giống Clostridium.
Bào tử kháng lại sự nhuộm màu thông thường nhưng khi đã ăn màu thì sẽ không
mất màu khi rửa. Do đó phải có sự nhuộm màu bằng phượng pháp mạnh. Có nhiều
phương pháp nhuộm, sau đây là phương pháp thường dùng.

Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer-Fulton

48
Cách tiến hành:
- Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm lục malachite 5%, hơ nóng trong 10 phút.
- Rửa nước.
- Nhuộm Safranin 0.5% trong 1 phút.
- Rửa nước, làm khô.
- Soi kính với vật kính nhúng dầu.
Kết quả tế bào vi khuẩn màu hồng nhạt, bào tử màu xanh lục.
Báo cáo:
- Tóm tắt quá trình nhuộm.
- Vẽ hình thái tế bào, vị trí bào tử.

49
 Bài 6 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT
I. Nguyên tắc.
Có rất nhiều phương pháp để phát hiện các chủng vi sinh vật có trong tự
nhiên(đất, nước, trái cây, thực phẩm…). Về nguyên tắc có thể chia làm 3 nhóm
phương pháp là các phương pháp dựa trên kiểu hình, các phương pháp dựa trên tính
miễn dịch(protein đặc hiệu) và các phương pháp dựa trên DNA (DNA đặc hiệu).
+ Phát hiện dựa trên kiểu hình: Trong môi trường dinh dưỡng chọn lọc (đặc hoặc
lỏng) và trong điều kiện nuôi cấy phù hợp, có thể phát hiện vi sinh vật cần tìm qua sự
tăng trưởng ưu thế của chúng so với những loài khác. Ngoài ra, vi sinh vật có thể được
phát hiện dựa vào những đặc tính dễ thấy như tạo sắc tố, khả năng sử dụng cơ chất đặc
biệt, khả năng kháng kháng sinh hay kim loại nặng.
Môi trường chọn lọc có thể chia thành 2 loại:
- Môi trường chọn lọc chung. Dùng để phát hiện một nhóm đối tượng vi sinh vật –
chẳng hạn như muốn phân lập, phát hiện nấm thì ta dùng môi trường Czapek-Dox,
đối với vi khuẩn thì ta dùng môi trường cao thịt-pepton, đối với nấm men thì dùng
môi trường Hansen, còn đối với xạ khuẩn thì dùng môi trường Gause.
- Môi trường chọn lọc dựa vào đặc tính riêng của từng nhóm hay từng loại vi sinh
vật. Tùy thuộc vào đặc tính sinh hóa riêng của nhóm vi sinh vật muốn phát hiện –
phân lập để nghiên cứu mà sử dụng những môi trường chọn lọc chuyên biệt khác
nhau. Ví dụ khi muốn phân lập vi sinh vật có khả năng sinh acid thì ta phải dùng
môi trường có chứa CaCO3. Sau thời gian nuôi ủ, vi sinh vật nào có vòng phân giải
xuất hiện xung quanh khuẩn lạc chính là đối tượng ta quan tâm.
Phương pháp cấy để phát hiện, phân lập vi sinh vật thường dùng là cấy ria hoặc trải
đĩa. Sau khi đã chọn lọc được vi sinh vật quan tâm, tiến hành làm thuần, sau đó mới
khảo sát các giai đoạn tiếp theo tùy thuộc vào các mục tiêu nghiên cứu.
+ Phát hiện dựa vào tính miễn dịch: bằng phương pháp miễn dịch với chất phát
huỳnh quang có thể phát hiện ngay vi sinh vật có trong mẫu tự nhiên. Phương pháp
này cho phép phát hiện vi sinh vật không thông qua nuôi cấy.
+ Phát hiện dựa trên DNA: dùng mẫu dò và lai phân tử để phát hiện vi sinh vật.
Nội dung thực hành.
Sinh viên thực hành một số phương pháp phát hiện vi sinh vật dựa vào kiểu hình như
tăng trưởng trên môi trường chọn lọc và dựa vào đặt tính riêng của từng vi sinh vật.
- Phát hiện bằng môi trường chọn lọc: sinh viên thực hành cấy mẫu đất, mẫu nước nho
để lên men tự nhiên trên các môi trường khác nhau: môi trường cao thịt peptone, môi
trường Hansen và môi trường Czapek - Dox.

50
- Phát hiện vi sinh vật dựa vào đặc tính riêng: sinh viên thực hành cấy từ mẫu dưa chua
lên môi trường carbonat agar để phát hiện vi sinh vật sinh acid dựa vào khuẩn lạc có
vòng tan CaCO3, cấy mẫu đất được nuôi tích lũy lên môi trường Ashby để phát hiện vi
sinh vật cố định đạm sống tự do.
III. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên)
Dụng cụ.
Petri vô trùng 48 cái Giá ống nghiệm 4 cái
Đèn cồn 4 cái Rổ nhựa 4 cái
Quẹt gas 4 cái Que trải 4 cái
Que cấy vòng 4 cái Pipet 1ml vô trùng 16 cái
Pipet (5-10ml) vô trùng 8 cái Bút lông dầu 4 cái
Hóa chất – môi trường
Ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng 12 ống
Ống nghiệm chứa mẫu nuôi tích lũy vi khuẩn cố định đạm 4 ống
Môi trường thạch Cao thịt-pepton 1 erlen 250ml
Môi trường thạch Hansen 1erlen 250ml
Môi trường Czapek-Dox 1erlen 250ml
Môi trường CaCO3 1erlen 250ml
Môi trường Ashby 1erlen 250mL
IV. Thực hành
2.1 Tiến hành pha loãng mẫu
Pha loãng lần lượt 1ml mẫu với 9ml nước cất vô trùng để được các nồng độ pha loãng
mẫu ban đầu khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3. Thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng.
2.2. Phân lập vi sinh vật trên môi trường chọn lọc chung.
Ở phần này sinh viên thực hành phân lập phát hiện các đối tượng vi sinh vật
trong đất, nước nho lên men là vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
Lần lượt hút 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào các đĩa Petri
chứa môi trường Cao thịt – peptone, môi trường Hansen và môi trường Czapek-Dox.
Sau đó dùng que trải trang đều, gói hộp và đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ đối
với vi khuẩn và ở nhiệt độ phòng trong 2, 3 ngày đối với nấm men và nấm mốc.
2.3. Phân lập vi sinh vật dựa vào những đặc tính riêng.
2.3.1. Phân lập – phát hiện vi sinh vật sinh acid.
Lần lượt hút 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào các đĩa Petri
chứa môi trường CaCO3. Sau đó dùng que trải trang đều, gói hộp, ủ ở nhiệt độ phòng
2-3 ngày. Quan sát và đếm các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3.
2.3.2. Phân lập – phát hiện vi khuẩn cố định đạm tự do.

51
 Lần lượt hút 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau (đã được nuôi tích lũy 4-
5 ngày trên môi trường Ashby) cho vào các đĩa Petri chứa môi trường Ashby. Sau đó
dùng que trải trang đều, gói hộp, ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. Quan sát hình dạng, số
lượng các khuẩn lạc.
V. Báo cáo.
- Tóm tắt các quá trình thí nghiệm và nguyên tắc của từng thí nghiệm.
- Tính số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và vi khuẩn xuất hiện trên các môi
trường khác nhau. So sánh sự hiện diện của vi sinh vật trên các môi trường khác
nhau. Kết luận về môi trường chọn lọc cho từng nhóm vi sinh vật.
- Tính số vi khuẩn sinh acid, số khuẩn lạc vi khuẩn cố định đạm sống tự do và số
khuẩn lạc vi sinh vật phân giải tinh bột.
- Ứng với mỗi môi trường chọc lọc, có bao nhiêu loại khuẩn lạc ứng với từng
nhóm vi sinh vật.
- Giải thích và biện luận kết quả thu được.

A.7 Môi trường Czapek-Dox

NaNO3 2,0 g
KCl 1,0 g
KH2PO4 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Thạch 20,0 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH 6,0 đến 6,5
pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

52
 Bài 7 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp như đếm trực tiếp
trên kính hiển vi; định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản quang (đo độ đục); đếm
số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định (đổ đĩa hoặc trải đĩa); định lượng thống kê
bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN), phương pháp đo ATP… Trong bài này
giới thiệu nguyên tắc và thực hành một số phương pháp định lượng vi sinh vật.
I. Nguyên tắc.
1. Phương pháp đếm trực tiếp.
Vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, tảo, nguyên sinh động vật… có thể
đếm trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Phương pháp này cho phép xác định
nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng không phân biệt được tế bào sống và
tế bào chết, dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu, không thích
hợp với mẫu có mật độ thấp.
Trường hợp vi sinh vật có kích thước nhỏ như vi khuẩn, có mật độ thấp, khó
quan sát và đếm bằng kính hiển vi thì phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc nuôi cấy trong
môi trường lỏng bằng phương pháp pha loãng tới hạn(MPN) được sử dụng. Tuy nhiên
phương pháp đếm khuẩn lạc và phướng pháp MPN cũng thích hợp cho các vi sinh vật
có kích thước lớn.
2. Phương pháp đếm khuẩn lạc.
Cấy một thể tích xác định huyền phù vi sinh vật cần nghiên cứu lên môi trường
đặc trưng trong đĩa petri và sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ. Khi đó ta xem
mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ 1 tế bào.
Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống. Tế
bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn
lọc. Phương pháp này còn gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc(colony count) hay đếm
đĩa (plate count), có thể thực hiện bằng kỹ thuật trải hộp hay đổ hộp.
3. Phương pháp đo độ đục.
Tế bào vi sinh vật khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục và
gây cản quang. Độ đục của môi trường tỉ lệ với với mật độ tế bào, trong giới hạn nhất
định có thể xác lập được quan hệ tuyến tính giữa chúng. Do vậy có thể định lượng mật
độ tế bào bằng cách đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng 550-610nm.
Phương pháp này có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của 2 hay
nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Phương pháp này cho kết quả nhanh
thường áp dụng để theo dõi hay nghiên cứu đặc điểm tăng trưởng của các chủng vi
53
sinh vật trong phòng thí nghiệm hay trong sản xuất. Tuy nhiên không thích hợp cho
ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật.
4. Phương pháp MPN (MPN- Most Probable Number).
Phương pháp MPN thường được sử dụng để xác định số lượng vi sinh vật trong
mẫu có mật độ thấp. Phương pháp này còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn
hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật
theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau.
Cho vào các ống nghiệm chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của vi
sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 –
5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu môi trường để định tính sự hiện diện
trong ống thử nghiệm. Đây là các ống dương tính. Ghi số ống dương tính ở mỗi độ pha
loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1 ml
mẫu hay trong một gam mẫu ban đầu.
Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ
pha loãng. Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể
được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp.
II. Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên)
Kính hiển vi 2 cái
Phòng đếm hồng cầu 2 cái.
Micropipet loại 100 - 1000l 2cây
Đầu tip vô trùng 50 cái
Eppendorf vô trùng 35 cái
Đèn cồn 4 cái .
Que cấy vòng 4 cái.
Que gạt 4 cái.
Petri vô trùng 45 cái.
Bông thấm 1 bịch.
Giấy thấm 1 hộp.
Bút lông dầu 2 cây
Môi trường thạch cao thịt peptone 1 erlen 500ml
Lauryl Sulphate Broth (LSB) 18 ống
Brilliant Green Lactose Bile Salt(BGBL) 18 ống
Nước cất vô trùng(9ml) 14 ống.

54
 Nước muối sinh lý vô trùng 1 erlen 100ml
III. Thực hành.
1. Xác định mật độ tế bào E.coli trong canh trường bằng phương pháp đo độ đục.
1.1 Chuẩn bị các huyền phù E. coli có độ đục xác định.
- Xác định độ đục của dịch E.coli sau 24 giờ nuôi (pha loãng nếu số đo vượt quá 1).
Dùng môi trường cao thịt peptone mới chưa nuôi cấy làm đối chứng khi đo.
- Dựa vào các số đo ở trên, pha loãng thành những huyền phù khác nhau sao cho OD
610 nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Đo OD 610 n các huyền phù vừa được

pha, ghi nhận số đo thực tế.

1.2 Pha loãng liên tiếp bậc 10 các huyền phù có độ đục khác nhau.
Tiến hành pha loãng mỗi huyền phù có độ đục xác định thành các độ pha loãng 10-5,
10-6, 10-7 như sau:
- Chuẩn bị các ống eppendorf vô trùng chứa 0.9 ml NaCl 0.85% vô trùng được đánh
số từ 1 đến 7.
- Dùng micropipete và đầu tip vô trùng hút 0,1 ml huyền phù tế bào cho vào ống 1.
Đậy nắp eppendorf, lắc kỹ. Như vậy ta có độ pha loãng 10-1.
- Tiếp theo, dùng micropipette và đầu tip vô trùng, hút 0,1ml huyền phù của tế bào
của ống 1 cho vào ống 2. Đậy nắp eppendorf, lắc kỹ. Khi đó, ống 2 chứa huyền phù tế
bào có độ pha loãng là 10-2.
- Thực hiện tương tự để có các huyền phù tế bào với các độ pha loãng 10-3 đến 10-7
1.3 Tạo hộp trải.
- Ứng với các huyền phù được pha loãng từ huyền phù ban đầu có OD 610 nm là
0,1(hoặc xấp xỉ 0,1), dùng Micropipet hút 0,1 ml các huyền phù có độ pha loãng 10-5,
10-6, 10-7 cho vào giữa đĩa petri chứa môi trường thạch cao thịt peptone, dàn đều trong
mặt thạch bằng que gạt thủy tinh vô trùng. Mỗi độ pha loãng cấy 3 petri lặp lại. Đặt
trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ.
- Thực hiện tương tự cho các mẫu huyền phù ban đầu có OD 610 nm là 0.2, 0.3, 0.4, 0.5.
1.4 Tính mật độ tế bào tương ứng với các độ đục khác nhau.
- Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi hộp Petri. Sử dụng số liệu của độ pha loãng sao
cho có 25 – 250 khuẩn lạc trong 1 đĩa.
Tính số tế bào(A) có trong 1 ml huyền phù ở mỗi độ đục. Cách tính như sau:
N
A =
n1Vf1 +…+niVfi
A : là Số khuẩn lạc trong 1ml canh trường(CFU/ml)(colony forming unit)
N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn.
ni : số lượng đĩa cấy ở độ pha loãng thứ i.
55
 fi : độ pha loãng tương ứng.
V: thể tích mẫu cấy.
Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới
dạng thập phân nhân với 10n.
Cách đếm: Lấy bút mực viết kính, kẻ 2 đường kính giao nhau vuông góc ở đáy hộp
lồng. Đếm số khuẩn lạc trong từng vùng và chấm mực đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm.
1.5 Xây dựng mối quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào.
- Dựa vào các số liệu thu được ở mục 2.4, tính giá trị log(A/ml) cho mỗi giá trị mật độ
A/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log(A/ml) (trục tung) theo
OD610nm(trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log(A/ml) và OD610nm
1.6. Xác định mật độ tế bào theo độ đục.
- Đo OD610nm của huyền phù tế bào cần xác định mật độ (nếu OD vượt quá khoảng
tuyến tính của lân cận 0,1-0,5 cần pha loãng mẫu)
- Từ OD610nm vừa đo được, dựa trên mối quan hệ tuyến tính vừa xác lập được ở trên
suy ra log(A/ml) rồi từ đó suy ra N/ml= 10log(A/ml).

2. Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN.

2.1 Giới thiệu.
Coliforms là trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
ý, có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ.
Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms
được xem là vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong nước, thực phẩm
… được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật khác.
Nhóm coliform gồm 4 giống: Escherichia với một loài duy nhất là Escherichia
coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.
Số lượng Coliforms trong mẫu chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể
được xác định bằng phương pháp MPN.
2.2 Cách tiến hành.
- Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng (10 – 1, 10 – 2 , 10 – 3 ) vào ống nghiệm chứa
10ml môi trường LSB (mỗi độ pha loãng cấy 3 ống). Ủ ở 370C trong 48 giờ.
Ghi nhận số ống có sinh hơi.
- Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống
nghiệm chứa 10 ml môi trường BGBL. Ủ ở 370C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống
dương tính ở mỗi độ pha loãng.
Tra bảng MPN để biết kết quả.
56
 IV. Báo cáo.
- Trình bày thật tóm tắt nguyên tắc và cách thực hiện các phương pháp.
- Tính toán kết quả.
- Đánh giá, nhận xét kết quả và so sánh các phương pháp.
- Giải thích các hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm hay phân tích các
yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Bảng MPN trên 1g hay 1 ml mẫu,
dùng 3 nồng độ 0,1, 0.01, 0.001 mỗi nồng độ 3 ống

Ống dương tính Ống dương tính Ống dương tính Ống dương tính
0,1 0.01 0.001 MPN 0,1 0.01 0.001 MPN 0,1 0.01 0.001 MPN 0,1 0.01 0.001 MPN

0 0 0 <3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23

0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39

0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64

0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95

0 1 0 3 1 1 0 15 2 1 0 15 3 1 0 43

0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75

0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120

0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160

0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93

0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150

0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210

0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290

0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240

0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460

0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100

0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 >1100

57
 Bài 8 SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN
I. Khái niệm.
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong
quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời
gian. Vi khuẩn thường sinh sản bằng phương thức phân đôi tạo thành hai tế bào con
cùng kích thước, do vậy làm tăng gấp đôi số lượng tế bào sống và mật độ tế bào trong
quần thể sẽ liên tục tăng gấp đôi trong pha tăng trưởng hàm mũ (exponential phase).
Trong pha này một tế bào sẽ phân thành hai, mỗi tế bào lại phân đôi tạo thành
bốn tế bào. Thời gian cần cho một lần phân bào và tăng gấp đôi mật độ tế bào được gọi
là thời gian thế hệ (generation time) hay thời gian tăng gấp đôi, là giá trị để xác định
tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn. Do vậy có thể xác định thời gian thế hệ thông qua
việc xác định mật độ tế bào trong pha tăng trưởng hàm mũ theo phương trình sau:
g = 0,693t/(ln Bt – ln B0)
với g làthời gian thế hệ, ln Bt và ln B0 là hàm mũ tự nhiên của mật độ tế bào ở thời
điểm t (thời gian tăng trưởng so với thời điểm bắt đầu) và t0 (thời điểm bắt đầu).
Trong thực nghiệm khi 1 chủng vi khuẩn được cấy vào một môi trường nuôi
cấy mới, chủng này sẽ thể hiện một đường cong tăng trưởng đặc trưng. Đường cong
tăng trưởng của vi khuẩn nói chung gồm 4 pha: (1) pha tiềm tàng hay pha lag (lag
phase), (2) pha hàm mũ hay pha log (log phase), (3) pha ổn định (stationary phase) và
(4) pha suy tàn hay pha chết (death phase).
Trong pha tiềm tàng, tế bào chuẩn bị cho quá trình phân chia, DNA được tổng hợp và
nhiều enzym được cảm ứng tổng hợp. Trong pha hàm mũ, hàm mũ của sinh khối hay
mật độ tế bào sẽ tăng tuyến tính với thời gian. Trong pha này, vi sinh vật tăng trưởng ở
vận tốc cực đại ở một điều kiện nuôi cấy nhất định. Ở pha ổn định không có sự gia
tăng mật độ của tế bào do tốc độ tăng trưởng bằng với tốc độ tế bào chết đi. Ở pha ổn
định các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt trong khi các sản phẩm biến dưỡng ức chế tăng
trưởng lại được tích lũy. Sau pha ổn định quần thể tế bào vào pha suy tàn với mật độ tế
bào sống giảm dần. Vận tốc của pha suy tàn tỷ lệ với số tế bào sống theo phương trình
sau:
dt = ln B0 – ln Bt
trong đó dt là vận tốc suy tàn, t là thời gian, ln B0 là hàm mũ cơ số tự nhiên của số
lượng tế bào ở thời điểm khởi đầu và ln Bt là hàm mũ cơ số tự nhiên số tế bào sống sót
đến thời điểm t.

58
 Ở 1 khoảng giá trị nhất định, mật độ của tế bào trong môi trường nuôi cấy tỉ lệ
với mật độ quang hay độ đục, do vậy có thể dùng phương pháp đo độ đục để đo sự
tăng trưởng của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy bằng một máy so màu để theo dõi sự gia
tăng của mật độ tế bào và xây dựng đường cong tăng trưởng của chúng.
II. Vật liệu(dùng cho 8 sinh viên)

- Dịch E. coli được nuôi 1 giờ và 24 giờ(50ml/erlen 100ml) 2 bình

- Môi trường lỏng cao thịt peptone (50 ml/erlen 250 ml) 4bình
- Micropipet 1 cái
- Đầu tip 1 ml vô trùng 20 cái
- Máy đo mật độ quang và ống đo
- Máy lắc ổn nhiệt.
III. Thực hành.
Sinh viên thực hành phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng và xác
định thời gian thế hệ của vi khuẩn E. coli ở 370C.
Cách tiến hành:
a. Cấy 5ml dịch E. coli sau 1 giờ nuôi vào bình tam giác chứa 50ml môi trường.
Cấy 2,5 ml dịch E. coli nuôi cấy 24 giờ vào bình tam giác thứ 2 chứa 50 ml môi
trường. Lắc đều.
b. Dùng micropipet với đầu tip vô trùng hút 2ml mẫu ở mỗi bình cho vào ống đo.
c. Đặt hai bình lên máy lắc, lắc đều. Ghi nhận thời điểm bắt đầu.
d. Dùng môi trường mới chưa nuôi cấy làm đối chứng, đo độ đục của mẫu ở bước
sóng 610 nm. Ghi nhận độ đục OD610 (độ đục ở thời điểm t0)
e. Tiến hành thu mẫu cách 10 phút trong khoảng thời gian 90 phút và đo độ đục như
trên. Trường hợp độ đục tiếp cận giới hạn trên hoặc vượt quá thang đọc, pha
loãng mẫu 1/10 lần với nước trước khi đo độ đục. Trong trường hợp này, dùng
môi trường chưa nuôi cấy được pha loãng 1/10 lần làm đối chứng khi đo.
f. Ghi nhận độ đục tại các thời điểm thu mẫu. Vẽ đường tương quang giữa độ đục
và thời gian cho mỗi bình nuôi cấy. Tính số lượng tế bào ở từng thời điểm đo.
Báo cáo kết quả
Mỗi nhóm thực hiện nuôi cấy và thu mẫu trên 2 bình nuôi. Ghi nhận kết quả và
vẽ đường cong tăng trưởng theo thời gian. Tính thời gian thế hệ của chủng trong
trường hợp giống ban đầu là 1 giờ và 24 giờ nuôi.

59
 Bài 9 BIẾN DƯỠNG Ở VI SINH VẬT
I. Khái niệm.
Các phản ứng biến dưỡng trong tế bào vi sinh vật là một hệ thống phức tạp,
thống nhất giữa các con đường trao đổi chất trong tế bào. Về mặt năng lượng, các
phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống này thể hiện một sự tương quan giữa năng
lượng cần để phá vỡ các liên kết hóa học, năng lượng phóng thích do sự tạo thành liên
kết mới và những dạng năng lượng khác, thường là nhiệt, được trao đổi với môi trường
xung quanh.
Do vậy, một số phản ứng hóa học trong tế bào cần cung cấp năng lượng(các
quá trình tổng hợp như tổng hợp protein, acid nucleic…) trong khi đó các phản ứng
khác lại giải phóng năng lượng (các phản ứng oxi hóa các chất dinh dưỡng). Tế bào sử
dụng năng lượng của các phản ứng tạo năng lượng để thực hiện các phản ứng cần
năng lượng. Do vậy hoạt động biến dưỡng ở vi sinh vật cần được xem xét trên 2 khía
cạnh: dòng năng lượng và dòng carbon đi qua tế bào.
Thông qua hoạt động biến dưỡng, năng lượng được chuyển thành dạng dự trữ là
ATP(Adenosine Triphosphate). Tế bào cũng cần lực khử để tạo thành các vật liệu cho
tế bào. Lực khử này là NADP(Nicotinamid Adenine Dinucleotide) hoặc
NADPH(Nicotinamid Adenine Dinucleotide Phosphat) nhận được từ các phản ứng
oxi hóa chất dinh dưỡng. Năng lượng và lực khử được tạo ra trong quá trình biến
dưỡng sẽ được sử dụng cho sự tăng trưởng và sinh sản của tế bào.
Vi sinh vật có nhiều phương thức biến dưỡng khác nhau để đáp ứng nhu cầu tạo
ra năng lượng, lực khử và vật liệu để tạo thành các đại phân tử sinh học cấu thành tế
bào như protein, acid nucleic. Các phương thức biến dưỡng này có thể là:

- Các phương thức tự dưỡng: CO2 được sử dụng làm nguồn carbon. Năng lượng
được thu nhận từ một trong hai nguồn:
(1) Thu nhận từ ánh sáng(quang tự dưỡng)
(2) Thu nhận từ sự oxi hóa các hợp chất vô cơ( hóa tự dưỡng vô cơ)
- Các phương thức dị dưỡng: hợp chất hữu cơ vừa được sử dụng làm nguồn carbon và
nguồn năng lượng. Vi sinh vật dị dưỡng có thể thu nhận năng lượng bằng phân giải
các hợp chất hữu cơ, bằng một trong hai hình thức:
(1) Hô hấp (sử dụng chuỗi truyền điện tử hay chuỗi hô hấp):chất hữu cơ bị
oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và nước.

60
 (2) Lên men (không sử dụng chuỗi truyền điện tử): chất hữu cơ bị oxi hóa
không hoàn toàn thành các chất biến dưỡng trung gian như cồn, acid hữu cơ…
Tất cả các phản ứng biến dưỡng nhằm tạo ra năng lượng, lực khử và các
nguyên liệu để tạo thành các đại phân tử cấu thành tế bào được xúc tác bởi các
enzyme. Hàng ngàn enzyme khác nhau tham gia vào các phản ứng biến dưỡng trong tế
bào, mỗi enzyme thực hiện một phản ứng biến dưỡng chuyên biệt.
Mỗi loài vi sinh vật đều có nhiều enzyme khác nhau. Chủng loại và hoạt tính
của các enzyme này quyết định đặc tính sinh lý, kiểu hình của vi sinh vật. Môi trường
sống và mối tương tác với môi trường tạo áp lực chọn lọc để mỗi vi sinh vật tiến hóa
có được những enzyme cần cho sự tồn tại và tăng trưởng tốt nhất của vi sinh vật trong
môi trường.
Một số enzyme thường gặp ở vi sinh vật:
1. Catalase.
Catalase xúc tác phản ứng thủy phân H2O2 tạo thành nước và phóng thích oxi
phân tử. Hầu hết vi sinh vật hiếu khí đều có catalase nhằm loại trừ sự tích tụ H2O2 có
độc tính đối với tế bào được tạo ra trong các phản ứng oxi hóa khử trong chuỗi hô hấp.
Hoạt tính của catalase có thể được phát hiện bằng cách bổ sung vài giọt H2O2 lên
khuẩn lạc hoặc cho H2O2 lên một giọt huyền phù vi sinh vật trên phiến kính và theo
dõi sự sủi bọt do oxi phân tử được phóng thích.
2. Gelatinase.
Gelatinase là enzyme được tạo bởi nhiều vi sinh vật xúc tác sự thủy phân
gelatin(collagen). Sự thủy phân gelatin cũng tạo ra carbon tan có thể dùng làm nguồn
carbon và năng lượng. Hoạt tính thủy phân gelatin có thể được phát hiện dựa vào sự
hóa lỏng môi trường chứa gelatin. Hoạt tính này cũng được phát hiện bằng thuốc thử
HgCl2 có tác dụng làm tủa đục gelatin. Nếu vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin
thì sau khi cho thuốc thử HgCl2 vào môi trường chứa gelatin, chung quanh khuẩn lạc
sẽ xuất hiện vòng trong suốt. Vòng phân giải càng lớn, khả năng phân giải gelatin càng
mạnh.
3. Amylase.

Enzyme  - amylase xúc tác sự thủy phân tinh bột thành đường maltose. Phân
tử đường này có tính tan tốt hơn, có thể vào tế bào và được vi sinh vật sử dụng làm
nguồn carbon và nguồn năng lượng. Hoạt tính phân giải tinh bột được phát hiện dựa
trên nguyên tắc sau:

61
 Tinh bột là polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối phức tạp. Khi môi
trường chứa tinh bột được nhuộm bằng iod, iod sẽ được giữ lại trong cấu trúc mạng
không gian của tinh bột và làm môi trường có màu xanh đậm. Nếu vi sinh vật phân
giải tinh bột, cấu trúc mạng không gian này bị phá vỡ, do đó sẽ xuất hiện vòng phân
giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc.
II. Vật liệu.
Môi trường chứa gelatin 1 erlen 250 ml
Môi trường chứa tinh bột 1 erlen 250 ml
Môi trường thạch cao thịt peptone 100 ml
Đĩa Petri vô trùng 24 cái
Đèn cồn 4 cái
Que cấy vòng 4 cái
Thuốc thử lugol 1 lọ 150 ml
Dung dịch H2O2 3% 1 lọ 100 ml
Thuốc thử HgCl2 1 lọ 150 ml
Cách pha:
HgCl2 15g
HCl 20 ml
Nước cất 100ml
Giống Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus
III. Thực hành
1. Phát hiện hoạt tính catalase.

- Cấy các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis và Lactobacillus

acidophilus lên môi trường thạch cao thịt peptone.

- Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

- Ghi nhận sự tăng trưởng của từng chủng vi sinh vật.

- Thử hoạt tính catalase bằng cách nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên
khuẩn lạc hoặc dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn hòa với giọt nước vô trùng
trên phiến kính rồi cho một giọt H2O2 3%. Dựa vào hiện tượng có sủi bọt(+)
hoặc không(-) kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng.
62
2. Phát hiện hoạt tính gelatinase.

- Cấy các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis và Lactobacillus

acidophilus lên môi trường chứa gelatin.

- Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày.

- Ghi nhận sự tăng trưởng của từng chủng vi sinh vật.

- Nhỏ thuốc thử HgCl2 lên toàn bộ bề mặt thạch, để yên trong 10 – 15 phút. Quan
sát và đo kích thước vòng phân giải (nếu có) ở mỗi chủng.
3. Phát hiện hoạt tính amylase.

- Cấy các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis và Lactobacillus

acidophilus lên môi trường chứa tinh bột.

- Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày.

- Ghi nhận sự tăng trưởng của từng chủng vi sinh vật.

- Nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bộ bề mặt thạch. Quan sát và đo kích thước vòng
phân giải (nếu có) ở mỗi chủng.
IV. Báo cáo.
Tóm tắt nguyên tắc và cách xác định hoạt tính của các enzym.
Kết quả và kết luận về hoạt tính amylase, gelatinase và catalase của mỗi chủng.

63
 Bài 10 ĐỊNH DANH VI KHUẨN
I. Khái niệm.
Phân loại(taxonomy) vi sinh vật bao gồm:
(1) Xếp nhóm(classification) là sự sắp xếp vi sinh vật thành các nhóm dựa vào mối
quan hệ giữa vi sinh vật.
(2) Đặt tên(nomenclature): là việc đặt cho các đơn vị trong hệ thống xếp nhóm
(3) Định danh(identification): là việc áp dụng hệ thống xếp nhóm và đặt tên nêu
trên để xác định vị trí và tên gọi của một vi sinh vật hoặc một loài, chủng vi
sinh vật mới
Vi khuẩn là các vi sinh vật tiền nhân bao gồm 3 nhóm lớn:
(1) Archaebacteria(vi khuẩn cổ)
(2) Cyanobacteria(vi khuẩn lam)
(3) Eubacteria(vi khuẩn thật)
Việc phân loại vi khuẩn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái như hình dạng,
cách sắp xếp tế bào, gram, tiên mao…và các đặc điểm sinh lý như phương thức biến
dưỡng, phương thức lên men các cơ chất đường, phạm vi nhiệt độ cho phép tăng
trưởng, quan hệ với oxi,…
Phương pháp định danh cổ điển thường sử dụng hệ thống khóa hai lựa
chọn(dichotomous key) bao gồm một loạt các câu hỏi đúng”có” hoặc sai”không” đối
với các đặc điểm hình thái và sinh lý của chủng vi sinh vật cần định danh. Các câu hỏi
này được sắp xếp theo thứ tự thành sơ đồ phân nhánh đôi. Tập hợp các câu trả lời cuối
nhánh sẽ giúp cho việc xác định vị trí và tên loài của vi sinh vật đang quan tâm.

Chủng cần định danh

- +
- +
- +
K
- +
j i h g

f e a

c b

Sơ đồ hai lựa chọn được dùng trong định danh vi sinh vật
64
 Việc định danh vi khuẩn thường dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý của vi
khuẩn trong khóa phân loại của Bergey (Bergey’s manual of determinative
bacteriology)
II. Vi khuẩn acetic.
Vi khuẩn acetic thuộc nhóm hiếu khí, thu năng lượng nhờ quá trình hô hấp với
oxi là chất nhận điện tử sau cùng, được xếp chung vào họ Acetobacteriaceae gồm 2
giống là Acetobacter và Gluconobacter. Theo khóa phân loại của Bergey, hai giống
Acetobacter và Gluconobacter có những đặc điểm sau:
+ Giống Acetobacter.

- Tế bào hình elip đến hình que, thẳng hoặc cong mảnh, có kích thước 0.6 – 0.8 x
1 – 4 m.

- Di động do chu mao hoặc không di động.

- Không hình thành bào tử, gram âm(một vài trường hợp, gram biến đổi).

- Nhiệt độ tối thích: 25 – 300C; pH tối thích 5.4 – 6.3

- Có khả năng oxi hóa etanol đến acid acetic ở pH 4.5

- Không có oxidase, không sinh indol, không làm tan chảy gelatin, không có khả
năng phân giải dextrin.

- Có khả năng oxy hóa acid acetic và lactate thành CO2.

- Hiện diện trong hoa, quả, mật ong, rượu nho, rượu táo, bia, giấm….
+ Giống Gluconobacter.

- Tế bào hình elip đến hình que, có kích thước 0.5 – 0.8 x 0.9 – 4.2m.

- Di động, có 3 – 8 tiên mao ở cực hoặc không di động.

- Nhiệt độ tối thích 25 - 300C, không phát triển ở 370C; pH tối thích 5.6 – 6.0,
hầu hết các chủng sinh trưởng được ở pH 3.6.

- Có khả năng oxi hóa etanol thành acid acetic ở pH 4.5

- Không có Oxidase, không có gelatinase, không sinh indol, không phân giải
dextrin.

- Không có khả năng oxy hóa acid acetic và lactate thành CO2.

- Hiện diện ở táo, lê, giấm, hồng, dứa…

65
 Như vậy cả hai giống có đặc tính chung như: không có hoạt tính gelatinase,
không sinh indol, oxi hóa etanol thành acid acetic ở pH trung tính hoặc môi trường
acid(pH 4.5). Hai giống này được phân biệt dựa vào khả năng oxi hóa acetate hoặc
lactate tạo ra CO2 và nước và cấu tạo tiên mao.
III. Vật liệu.
Môi trường etanol – cao nấm men 100 ml trong erlen 250 ml
Môi trường chứa gelatin 100 ml trong erlen 250 ml
Môi trường chứa dextrin 100 ml trong erlen 250 ml
Môi trường Calcium lactate 100 ml trong erlen 250 ml
Môi trường nước trypton 8 ống(5m/ống)
Môi trường sodium acetate 8 ống (5m/ống)
Đèn cồn 4 cái
Que cấy vòng 4 cái
Petri vô trùng 32 cái
Thuốc thử kovac’s
Thuốc thử lugol
Thuốc thử HgCl2
Các chủng vi khuẩn sinh acid acetic được phân lập sẵn.
IV. Thực hành.
Định danh đến mức giống chủng vi khuẩn sinh acid acetic được phân lập sẵn.
Sinh viên dựa vào việc khảo sát các đặc tính sau để kết luận:
1. Xác định khả năng sinh acid acetic.
Dùng que cấy vòng, cấy chủng vi khuẩn lên môi trường etanol – cao nấm men.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Ghi nhận sự xuất hiện hay không của vòng phân giải
CaCO3 chung quanh khuẩn lạc
2. Khả năng phân giải gelatin.
Dùng que cấy vòng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường chứa gelatin. Ủ ở nhiệt
độ phòng trong 3 ngày. Thực hiện phản ứng màu với thuốc thử HgCl2.
3. Khả năng phân giải dextrin.

66
 Cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thử khả năng phân giải dextrin. Ủ ở nhiệt
độ phòng trong 3 ngày. Thực hiện phản ứng màu với thuốc thử lugol.
4. Khả năng sinh indol.
Dùng que cấy vòng, cấy vi khuẩn vào môi trường chứa 5ml nước trypton. Ủ ở
nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
+ Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào để yên vài phút.
Đọc kết quả:
(+): có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường.
(-): có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường.
Đôi khi có sự xuất hiện màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của indol tạo ra.
5. Khả năng oxi hóa acetate.
Dùng que cấy vòng, cấy chủng vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường
sodium acetate. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Sự oxi hóa acetate được phát hiện
nhờ sự đổi màu của chất chỉ thị Bromothymol blue từ vàng xanh thành xanh dương.
6. Khả năng biến dưỡng lactate.
Dùng que cấy vòng, cấy chủng vi khuẩn vào hộp Petri chứa môi trường calcium
lactate. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Chủng có khả năng biến dưỡng lactate thành
CO2 sẽ tạo cặn tủa CaCO3 xung quanh khuẩn lạc do phản ứng giữa CO2 được tạo ra
với calcium.
V. Báo cáo.
Dựa vào các đặc điểm của vi khuẩn sinh acid acetic trong khóa phân loại của
Bergey, sinh viên kết luận chủng vi khuẩn đã khảo sát có phải là vi khuẩn sinh acid
acetic hay không, nếu là vi khuẩn sinh acid acetic thì nó thuộc giống nào?

67
 Bài 11 BẢO QUẢN VI SINH VẬT.
I. Nguyên tắc.
Sau khi phân lập và tạo được chủng thuần, chủng vi sinh vật cần được bảo
quản bằng phương pháp thích hợp để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Phương
pháp bảo quản giống cần đảm bảo được sức sống và ngăn ngừa những thay đổi về di
truyền, sinh lý của giống. Có một số phương pháp bảo quản giống như: cấy chuyền,
giữ trong lạnh hoặc lạnh sâu, đông khô.
Cấy chuyền thường xuyên là phương pháp giữ giống đơn giản nhất. Vi sinh vật
hiếu khí được cấy chuyền và giữ trong thạch nghiêng. Vi sinh vật kị khí được nuôi và
giữ trong ống thạch sâu bằng cách cấy sâu vào ống thạch tạo điều kiện không có oxi.
Khi có yêu cầu kị khí cao hơn, cần bổ sung trên bề mặt thạch sâu 2- 3 cm dầu khoáng
hoặc nuôi và giữ trong buồng kị khí.
Nhược điểm của phương pháp cấy chuyền là có nguy cơ làm thay đổi di truyền
và sinh lý của vi sinh vật cao đồng thời mất nhiều thời gian, đặc biệt là khi cần bảo
quản một lượng lớn giống. Phương pháp này chỉ được dùng để giữ giống ngắn hạn,
cần phải cấy chuyền cách vài tuần. Nếu được giữ ở nhiệt độ thấp hơn(0 – 50C) thì thời
gian bảo quản an toàn có thể kéo dài từ 3 – 5 tháng.
Giống có thể được giữ lâu hơn ở nhiệt độ thấp( - 20, - 35, - 70, -80, -1960C)
trong các tủ lạnh sâu hoặc trong nitơ lỏng. Cần phải làm lạnh sâu nhanh để tránh việc
hình thành tinh thể nước trong tế bào làm chết tế bào. Ngoài ra người ta còn sử dụng
glycerol để bảo vệ tế bào khi bảo quản lạnh sâu.
Việc lấy nước ra khỏi tế bào cũng có tác dụng ức chế biến dưỡng, không gây
những thay đổi về di truyền và sinh lý. Do vậy một số vi sinh vật, nhất là các vi sinh
vật tạo nội bào tử có thể được bảo quản bằng phương pháp làm khô. Đối với các vi
sinh vật không tạo nội bào tử, phương pháp làm khô thông thường có thể làm giảm sức
sống của chủng sau bảo quản. Các chủng vi sinh vật này có thể được bảo quản trong
thời gian dài bằng phương pháp đông khô. Trong phương pháp này, tế bào được huyền
phù hóa trong môi trường chứa một trong các chất bảo vệ và được làm đông nhanh
trong hỗn hợp acetone – đá khô. Sau đó nước tự do bên trong tế bào được loại bỏ bằng
cách làm thăng hoa nước ở áp suất thấp. Việc nước được chuyển thẳng từ trạng thái
rắn sang trạng thái khí sẽ hạn chế nguy cơ làm tổn thương tế bào. Giống đông khô có
thể bảo quản an toàn trong nhiều năm..

68
II. Vật liệu.
Que cấy vòng 4 cái
Đèn cồn 4 cái
Ống thạch cao thịt peptone nghiêng 4 ống
Micropipet 1 cái
Đầu tip vô trùng 10 cái
Eppendorf 1.5ml vô trùng 4 cái
Dung dịch glycerol 40% vô trùng 100 ml/ erlen 250ml
Nước muối sinh lý vô trùng 100 ml
Ống giống E.coli nuôi 24 giờ. 2 ống
III. Thực hành.
1. Bảo quản giống bằng thạch nghiêng
Cấy chủng E.coli từ ống giống vào ống môi trường thạch cao thịt petone nghiêng.Ủ ở
nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Lấy ra, cho vào tủ lạnh (0 – 50C). lặp lại việc cấy chuyền
trong 2 – 4 tuần.
2. Bảo quản giống bằng glycerol.
Tế bào E.coli trong dịch nuôi được ly tâm, rữa và huyền phù hóa trong nước muối sinh
lý. Hút 0.5 ml huyền phù này cho vào eppendorf chứa 0.5 ml glycerol 40% vô trùng,
trộn đều. Bảo quản ở -20 cho đến – 700C. Giống ở trạng thái này có thể bảo quản
trong 1 năm hoặc lâu hơn tùy vi sinh vật.

69
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Bộ môn Công nghệ sinh học,[2017], Thí nghiệm vi sinh, Lưu hành nội bộ ĐH
Tôn Đức Thắng, TPHCM.
[2]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, [2003], Thí nghiệm vi sinh học, NXB Đại học
quốc gia TPHCM.
[3]. Benson,[2002], Microbiological applications lab manual (8th ed.). McGraw-Hill,
Boston, USA
[4]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, [2009], Vi sinh vật học,
NXB Giáo Dục, Hà Nội.
[5]. Michael T. Madigan,…et al., [2015], Brock Biology of Microorganisms,, 14th ed.,
Pearson, Boston.

70